姜立春，朱 蘭，顧相悅，費 禹，曾文佳，徐中文，李曉琴

(綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川綿陽 621006)

0 引言

秸稈作為一種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的重要的可再生生物質(zhì)資源，在我國每年產(chǎn)量約在8.0億t以上，占世界秸稈總產(chǎn)量的20%～30%[1].纖維素是其中含量最高的組分，所以家畜難以高效分解利用，故用來做家畜飼料的僅占我國秸稈總量15%～20%[2].纖維素能夠利用植物的光合作用不斷進行積累，是世界上分布最廣、數(shù)量最大的可再生資源[3].然而，廣泛的纖維素資源將被廢棄或直接焚燒，造成極為嚴重的資源浪費，同時對環(huán)境產(chǎn)生巨大污染[4].為此，當前纖維素資源的開發(fā)和使用成了目前能源和環(huán)境的焦點問題.

纖維素是葡萄糖由β-1,4-糖苷鍵鏈接形成的生物大分子多聚糖，是構成植物細胞壁的重要組成部分之一，是自然界中含量最豐富的的碳水化合物[5].但是纖維素中含有大量的氫鍵，同時纖維素含結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)，且結(jié)晶區(qū)較非結(jié)晶區(qū)更難降解.所以纖維素不易被降解，利用率低.通過微生物產(chǎn)生的酶作用，可以降低纖維素的聚合度生成葡萄糖[6]，提高纖維素的利用率.

目前纖維素降解方式為化學水解與生物酶解法[7]，化學水解法存在成本較高、操作較復雜，同時會導致二次污染等嚴重問題.而生物酶解法卻擁有反應條件溫和、設備要求簡單、操作流程方便等優(yōu)勢，具有降解效率高、成本相對較低與安全環(huán)保等特點，是降解纖維素的較為理想的方法.生物酶解纖維素的第一步一般為纖維素酶，纖維素酶不是特稱某一種酶，而是一個酶系的合稱.其中包括內(nèi)切和外切-β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶[8].纖維素酶廣泛存在于動物、植物和微生物中.

自然界中存在大量能夠產(chǎn)生纖維素酶的的微生物.至今，研究者已發(fā)現(xiàn)能分解纖維素的菌包括真菌、細菌和放線菌共53屬，其中木霉菌和曲霉菌兩種真菌產(chǎn)酶量最大、酶系最全[9]，為篩選纖維素降解菌提供了重要的參考依據(jù).盡管利用生物酶解法有眾多優(yōu)勢，但是酶活力低一直是制約纖維素酶實際應用的一個重要原因[10].本試驗從三臺某木材廠存放木材下面的土壤和腐朽的木材作為研究對象，篩選出一株可高效降解纖維素的細菌.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 2019年7月采集三臺縣某木材廠存放多年木材下面的土壤和腐朽的木材.

1.1.2 試劑和設備 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、剛果紅、DNS試劑，PCR試劑盒，新華濾紙；紫外可見光分光度計、高速冷凍離心機、恒溫培養(yǎng)箱、臺式恒溫培養(yǎng)搖床、超凈工作臺、梯度PCR儀、電泳系統(tǒng)、凝聚成像儀、超低溫冰箱等.

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，瓊脂20.0，pH 7.2-7.4.

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(g/L)[6]：CMC-Na 8.0，KH2PO41.5，NaH2PO4·7H2O 2.5，MgSO4·7H2O 0.3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005，ZnCl20.001 5，MnSO40.001 5，(NH4)2SO42.0，pH 7.2.

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[6]：NaCl 3.0 g、K2HPO41.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl20.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 mg，MnSO41.5 mg，ZnCl21.5 mg，CoCl22.0 mg，pH 調(diào)至7.2.以上培養(yǎng)基121 ℃高溫滅菌20 min.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株篩選 將采集土壤和腐朽木材混合浸泡在無菌0.9% NaCl溶液中，放置搖床振蕩8 h.量取樣本重懸液，依次梯度稀釋到濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，分別量取稀釋液濃度10-4～10-6稀釋度0.6 mL，涂布在羧甲基纖維素鈉固體平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)60～96 h.將篩選獲得的纖維素降解菌做好標記，在點接至CMC-Na固體平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)60 h后，取1.0 mg/mL的剛果紅染液適量倒入培養(yǎng)皿中，染色30 min，棄去染液，隨后加入1.0 mol/L的NaCl溶液，浸泡20 min，根據(jù)透明圈與菌體直徑比篩選高效降解纖維素的菌株[7].選擇比值大菌落進行平板劃線純化，連續(xù)挑選獲得純培養(yǎng)的單菌落，觀察菌落形態(tài).將該菌株接種斜面上培養(yǎng)48 h，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 酶活性分析 (1) CMCase[9]菌液在4 ℃、6 000 r/min的條件下離心15 min，取0.50 mL上清液(粗酶液)，加入0.50 mL 0.4 %羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，50℃恒溫水浴鍋中溫育1.5 h，然后加入4 mL DNS試劑，放入沸水浴10 min終止反應，放置冷卻后在520 nm下測吸光值，粗酶液沸水浴處理10 min后作為陰性對照，每個樣品做3個平行試驗.

(2)濾紙?zhí)腔?FPase)[11]將培養(yǎng)好的菌液在4 ℃、5 000 r/min的條件下離心20 min，取0.5 mL上清液(粗酶液).將新華濾紙剪成規(guī)格為10 mm×60 mm的條形，放入大試管中，取粗酶液0.5 mL，加入醋酸緩沖液1.0 mL，50 ℃恒溫水浴1.0 h后取出，加入2.0 mL DNS試劑將反應終止，搖勻后于100 ℃水浴顯色10 min，室溫冷卻后，在520 nm下測吸光值進行還原糖測定，粗酶液100 ℃水浴處理10 min作陰性對照，每個樣品做3個平行試驗.

1.2.3 酶活測定 酶活力單位定義：在1.0 min內(nèi)每毫升酶液催化底物生成1.0 μg葡萄糖所需要的酶量，即1.0 U/mL.酶活力計算公式：Y=(1000×A×V)/(0.5×T)，式中A：根據(jù)標準曲線獲得凈葡萄糖的濃度(g/L)；V：總體積；0.5：測定時；量取粗酶液的毫升數(shù)；T：酶解反應時間.

1.3 菌株分子生物學鑒定

1.3.1 形態(tài)觀察 菌株在高氏一號培固體養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)36 h后進行菌落形態(tài)觀察，放于4 ℃冰箱中保存.挑取單一菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)結(jié)構.

1.3.2 基因組提取與16S rRNA基因擴增 基因組DNA提?。簠⒖嘉墨I[12]方法提取細菌總DNA，略有修改.0.9%瓊脂糖電泳檢測.PCR反應體系：37.5 uL ddH2O、5.0 uL 10×PCR buffer、4.0 uL dNTPs (各2.5 mmol/L)、1.0 uL F27：(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) (20 umol/L)、1.0 uL R1492：(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) (20 umol/L)、2.0 uL模板、0.5 uL Taq DNA聚合酶(5.0 ug/uL)，反應總體積為50 uL.擴增循環(huán)體系：94 ℃預變性3.5 min，94 ℃變性35 s，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s.經(jīng)33個循環(huán)后，72 ℃延伸9 min.PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%電泳檢測后，其產(chǎn)物回收純化與pMD-19T載體連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞JM109，篩選陽性重組子，郵寄成都擎科梓熙生物技術公司測序，其核酸序列用于構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.3.3 基于16S rRNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹 通過測序獲得的16S rRNA序列用NCBI中BLAST搜索與GenBank數(shù)據(jù)庫進行相似性分析，從而獲得相應菌株16S rRNA序列，在Clustal X(1.83)程序包中進行序列比對分析.基于軟件MEGA6.06中的鄰接法(Neighbor-Joining)法構建系統(tǒng)進化樹[13]，確定菌株分類地位.

1.4 單因素優(yōu)化

培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，本試驗對篩選出的菌種的培養(yǎng)條件做了以下單因素的優(yōu)化試驗：培養(yǎng)時長、氮源及濃度、碳源及濃度、酸堿度、培養(yǎng)溫度、接種量.培養(yǎng)時間的控制是在培養(yǎng)的發(fā)酵液每隔12 h取樣測其酶活.碳源為玉米粉、微晶纖維素、蔗糖、CMC、麥芽糖、乳糖、淀粉、葡萄糖為碳源，其濃度為10 g/L；氮源為牛肉膏、NH4Cl、NaNO3、NH4NO3、KNO3、(NH4)2SO4、胰蛋白胨、尿素、酵母膏為氮源，其濃度為5 g/L.

1.5 酶學性質(zhì)

1.5.1溫度 采用最適條件對菌株進行培養(yǎng)，獲得粗酶液，考察不同溫度(20、30、40、50、60 ℃)對CMCase與FPase活性的影響.測定在不同溫度下該菌種產(chǎn)生酶的穩(wěn)定性，確定其溫度適應范圍.

1.5.2 pH 采用最適條件對菌株進行培養(yǎng)，獲得粗酶液，考察不同pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)對CMCase與FPase活性的影響.于最適溫度下酶解30 min，測定兩種酶活性.隨后測定在不同pH下該菌株產(chǎn)生酶的穩(wěn)定性，確定其pH適應范圍.

1.6 綜合最佳條件進行培養(yǎng)測定

在確定的最佳碳源和氮源及其最佳濃度、溫度、pH及裝液量下，將菌恒溫160 r/min下?lián)u床培養(yǎng)相應時間后測定Lip酶酶活，與上各單因素測定酶活比較在綜合條件下其酶活是否有大的改進，從而可以了解菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

通過初篩培養(yǎng)分離得到20株菌可產(chǎn)生纖維素酶，對其進行純培養(yǎng)菌株.在纖維素培養(yǎng)基上經(jīng)過剛果紅染色后，觀察試驗中菌落大小與透明圈大的大小如表1所示.以培養(yǎng)80 h后透明圈直徑與菌落直徑之比進行了評估，共有9株纖維素降解菌株水解圈大于3，其中菌株XW08透明圈直徑與菌落直徑最大為6.28，其次XW05為4.46和XW15為4.09，選擇XW08作為目標菌株進行液體培養(yǎng)，測其CMCase酶活性和FPase活性.對分離出的20株菌做兩種酶活力測定試驗，結(jié)果如表2所示.獲得菌株XW08的CMCase和FPase酶活力最大，分別為6.12和6.56，結(jié)合初篩結(jié)果，將XW08作為待測菌種進一步后續(xù)試驗.

2.2 基因組提取與PCR擴增

采用常規(guī)SDS法提取DNA，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示基因組提取條帶比較清晰、整齊和均勻，濃度較高，可用于16S rRNA基因序列擴增.采用通用引物擴增，將16S rRNA基因郵寄到成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序，將測序片段采用DNA Baser軟件拼接在一起，得到16S rRNA基因序列.

2.3 菌株XW08鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察 菌株XW08在含CMCase的營養(yǎng)瓊脂固體平板上生長，有土腥味，白色，菌落小而致密，邊緣不規(guī)則，表面粗糙，干而不透明，正反面顏色不一致，不易挑起，不產(chǎn)生色素.通過形態(tài)觀察，初步判定為放線菌.經(jīng)革蘭氏染色后，發(fā)現(xiàn)細胞呈桿狀，革蘭氏染色為紫色，呈陽性.

2.3.2 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹構建 將測序得到的菌株XW08的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫中已注冊的16S rDNA序列用BLAST搜索進行序列相似性比較分析，其結(jié)果如圖1所示.供試菌株的16S rDNA序列與鏈霉菌屬的菌株同源相似度大部分在97 %以上，目前認為，當2個細菌的16S rDNA的相似性大于95%時，可將其歸為同一屬，而同源性較高的序列均來自Streptomyces，初步將此菌株歸為鏈霉菌屬.同時XW08在系統(tǒng)發(fā)育樹上與StreptomycesexfoliatusHBUM174569 (FJ486375)和Streptomycessp. MJM1121 (KP137363)聚集在同一個分支中，且16S rDNA序列的同源相似性為99%以上.結(jié)合其形態(tài)特征及生理生化特性與鏈霉菌屬較為一致，因此，將菌株XW08屬于鏈霉菌屬，命名為Streptomycessp. XW08.

圖1 基于16S rDNA序列構建菌株XW08和相關菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain xw08 and related bacteria based on 16S rDNA sequence

2.4 發(fā)酵條件對產(chǎn)酶活性的影響

2.4.1 培養(yǎng)時間 圖2中顯示從12 h開始CMCase和FPase的產(chǎn)量都開始緩慢上升直至60 h，60 h過后兩種酶的酶活開始大幅度上升，至72 h時酶的活力達到最大，而72 h過后酶活力開始急速下降.且由圖中可知CMCase相比FPase活力更高，在72 h時CMCase活性達到了5.68 U/mL，F(xiàn)Pase活性達到4.36 U/mL.因此，后續(xù)培養(yǎng)時間為72 h.

圖2 培養(yǎng)時間產(chǎn)酶活性的影響Fig.2 Effect of culture time on enzyme activity

2.4.2 最適碳源與濃度 碳源的種類與性能對纖維素酶活力會產(chǎn)生較大影響，況且菌株種類對于不同的碳源及其最適濃度也會產(chǎn)生不同的代謝偏好.本試驗考察不同碳源對酶活的影響，由圖3可知，以淀粉為唯一碳源產(chǎn)酶活力最高，CMCase和FPase活力都為最高分別達到了5.65和4.32 U/mL，葡萄糖次之.因此淀粉是XW08菌種的最適碳源.分別設置5、10、20、30、40、50 g/L 6個濃度考察淀粉對酶活性的影響，由圖4可知當?shù)矸酆吭?～10 g/L時，兩種酶活力緩慢上升，隨著淀粉濃度升高酶活力迅速上升.在20 g/L時兩種酶的酶活力均達到最高分別為8.12、6.54 U/mL.當過了20 g/L時酶活力都開始下降.由此得出最適淀粉含量為20 g/L.

2.4.3 最適氮源與濃度 氮源是組成蛋白質(zhì)酶和核酸的重要元素，對于纖維素酶的形成有重大影響.由圖5可知，當胰蛋白胨和酵母膏作為氮源時，CMCase和FPase活性都較高，以酵母膏為唯一氮源時CMCase和FPase活性分別為7.22、5.96 U/mL.所以酵母膏是菌株XW08最適氮源.分別設置1、2、4、6、8、10 g/L 6個濃度，來考察酵母膏對酶活性的影響，由圖6得到在酵母膏含量為6 g/L時CMCase和FPase的活力最高，分別為8.23、6.65 U/mL.當含量小于6 g/L時隨著酵母膏濃度增加酶活力增加，而濃度高于6 g/L兩種酶活力開始逐漸降低.由此得出酵母膏含量達到6 g/L時，菌株產(chǎn)酶的量最多.

2.4.4 初始pH值 培養(yǎng)環(huán)境對于產(chǎn)纖維素酶的菌株生長有一定的影響，過酸或過堿都會有不同的影響.由圖7中數(shù)據(jù)可得隨著酸堿度的增加CMCase和FPase的酶活都在上升，菌株的產(chǎn)酶量不斷增加，pH6.0時CMCase和FPase酶活達到最高，分別為14.12、10.86 U/mL，而pH高于6.0時酶活性急速下降.為此，該菌株的較適生長酸堿度為6.0.

2.4.5 溫度 不同溫度對微生物生存及代謝的影響極其重要，本試驗中分別測定20 ℃～42 ℃溫度區(qū)間對XW08菌株產(chǎn)酶活力的影響，見圖8.溫度范圍在20 ℃～35 ℃范圍時酶的產(chǎn)量相對緩慢上升，在25 ℃時兩種酶的產(chǎn)量相差最小，在35℃時CMCase酶和FPase的產(chǎn)量最高，分別為27.52、21.28 U/mL，25 ℃～35 ℃的酶活力測出均在15 U/mL以上，溫度適應范圍較廣.為此，35 ℃為該菌種的較適生長溫度.

2.4.6 接種量 接種量過多，菌株生長繁殖的速度較快，資源有限，菌群生長發(fā)育則會受到限制.接種量少，菌株適應期增長，需要更多時間來繁殖達到對數(shù)生長期，影響產(chǎn)酶活性.由圖9可得當接種量在2%～5%時兩種酶的產(chǎn)量都比較高，均在25 U/mL以上.當接種量達到5%時，兩種酶的產(chǎn)量達到最大，CMCase和FPase分別為38.35、32.28 U/mL.在接種量超過5%之后，接種量的多少對酶的產(chǎn)量造成的影響不大，則較適的接種量為5%.

圖9 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of inoculation amount on enzyme production

2.5 酶學性質(zhì)

2.5.1 最適pH與穩(wěn)定性 菌種生長時會受到外界條件的影響，酶是一種具有高度特異性和高效催化化學反應能力的物質(zhì)，使化學反應在極為溫和的條件下也能發(fā)生反應.雖然有這些優(yōu)點，但其不穩(wěn)定，易被破環(huán).由圖10可知，酶在pH5.5～7.5的活性都比較高，在pH為6.0時，兩種酶活性最高，CMCase和FPase分別為38.68和29.32 U/mL.當pH低于5.0或高于7.0時，酶的活性下降速度較快，酶活性明顯受到抑制.所以酶在中性環(huán)境下活性最佳，最適pH為6.0.酶在不同pH條件下處理1.5 h，考察酶的穩(wěn)定性，由圖11可知隨之pH增高逐漸升高，而在pH5.5～7.5酶活力都比較高，CMCase和FPase

活性最高，分別為38.24、30.85 U/mL，最適應的pH5.5～7.5.

2.5.2 最適溫度與穩(wěn)定性 酶是一種蛋白成分，不同溫度條件下對酶的活性有較大影響，溫度過高會對酶產(chǎn)生不可逆的破壞，即蛋白質(zhì)的變性.由圖12可知隨之溫度的升高，酶的活性迅速增高，當溫度為50 ℃時，CMCase和FPase的活性達到最高，分別為42.68和36.32 U/mL.高于50 ℃時酶活性迅速受到抑制，因此，溫度對該酶活性有較大影響.酶在不同溫度條件下處理1.5 h，考察酶的穩(wěn)定性，見圖13.結(jié)果表明，XW08菌株的溫度適應范圍較寬，30 ℃～60 ℃的溫度對菌株XW08酶活性影響較小，兩種酶的活性都比較高，高于60℃兩種酶的活性開始大幅度受到抑制，而高于80 ℃ 1.5 h后，CMCase和FPase酶活性降低到最高酶活的17.76%以下.因此，菌株最適應的溫度在30 ℃～60 ℃.

2.6 XW08綜合優(yōu)化條件培養(yǎng)

根據(jù)前面的優(yōu)化結(jié)果，即20 g/L淀粉，6 g/L酵母膏，pH6.0、35 ℃和裝液量為70 mL的條件下，對接種XW08后的三角瓶置于160 r/min搖床上進行搖床培養(yǎng)72 h，取部分5 000 r/min離心15 min得到取上清液為粗酶液.測定CMCase和FPase酶活性分別為43.56、36.72 U/mL.

3 討論

從木材廠的土壤和朽木中分離篩選得到的Streptomycessp. XW08(纖維素分解鏈霉菌XW08)，通過對菌株的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)菌株XW08在遺傳上與鏈霉菌屬相似度極高，因此，將該菌命名為Streptomycessp. XW08.XW08菌株為分離的20個菌株中初始CMCase與FPase酶活最高，分別為6.12與6.56 U/mL.在經(jīng)過本次試驗的各項培養(yǎng)條件優(yōu)化后，該菌株單位酶活明顯增加，最優(yōu)條件下培養(yǎng)72 h后，CMCase和FPase酶活分別達到43.56、36.72 U/mL.菌株XW08的CMCase活性明顯高于王偉等[14]報道的鏈霉屬菌株YDL3和HLF4，也高于王洪媛等[15]和李子昂等[16]報道的菌株，在CMCase活性上具有獨特優(yōu)勢.雖然XW08菌株在條件優(yōu)化后產(chǎn)酶活性在已報道的菌株中處于較高水平，但是酶活性大小不僅與菌株及其來源、培養(yǎng)基組成成分、培養(yǎng)時間與測定酶活采用的方法等有關，還與纖維素酶的反應條件(底物濃度、時間和溫度等)有關[17]，因此，對其工藝仍需進一步深入研究.這些將為采用生物法降解纖維素提供試驗依據(jù)，進而提高纖維素資源利用率.