陳校力，肖美華，江旭林，湯 俊，李志紅，羅慶偉

（湖北省鄂州市中心醫(yī)院胃腸外科，鄂州 436000）

胃癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，患者預(yù)后較差[1]。近年來(lái)，多靶點(diǎn)抗癌藥物的研發(fā)是新型腫瘤治療藥物研發(fā)的焦點(diǎn)。舒尼替尼是一類口服的小分子多靶點(diǎn)受體酪氨酸激酶抑制劑，可抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用。研究顯示，舒尼替尼可在體外抑制胃癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]，且其臨床治療轉(zhuǎn)移性胃癌的效果較佳，安全性高[3]。但目前舒尼替尼影響胃癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制尚未明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）與微小RNA（miRNA）是兩類與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的小分子非編碼RNA，lncRNA 作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA 與miRNA 靶向結(jié)合，共同影響疾病發(fā)展進(jìn)程[4]。研究顯示，胃癌組織中l(wèi)ncRNA ROR表達(dá)升高，其高表達(dá)的患者預(yù)后不良，下調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)阿霉素和長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的耐藥胃癌細(xì)胞凋亡[5]。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，lncRNA-重編碼調(diào)控因子（ROR）可能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-670-3p，泛素E3連接酶膜相關(guān)鋅指蛋白5（MARCH5）可能是miR-670-3p的靶基因。研究顯示，miR-670-3p 在肝癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲[6]；MARCH5 在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7]。但miR-670-3p/MARCH5 對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響還未知。因此，本研究以lncRNA ROR/miR-670-3p/MARCH5軸為切入點(diǎn)，探討舒尼替尼影響胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑 胃癌細(xì)胞系GC9811-P由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供；胎牛血清（FBS）購(gòu)自浙江天杭生物科技公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、RIPA試劑、二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒和RPMI 1640培養(yǎng)基均購(gòu)自北京索萊寶公司；Trizol 試劑和LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購(gòu)于大連寶生物；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；活化半胱天冬酶-3（Cleaved-caspase-3）和MARCH5抗體購(gòu)自Abcam 公司；PCR 引物、miR-670-3p 模擬物（mimics）及模擬對(duì)照序列（miR-NC）、miR-670-3p抑制劑（anti-miR-670-3p）及抑制劑陰性對(duì)照序列（anti-miR-NC）、lncRNA ROR小干擾RNA（si-ROR）、MARCH5小干擾RNA（si-MARCH5）及小干擾RNA 陰性對(duì)照（si-NC）、lncRNA ROR 過(guò)表達(dá)載體（pcDNA-ROR）、MARCH5 過(guò)表達(dá)載體（pcDNAMARCH5）和空載體（pcDNA-NC）均由上海吉?jiǎng)P基因公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 用含10 % FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)GC9811-P 細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期GC9811-P細(xì)胞接種于6孔板中（1×105個(gè)/孔），用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染miR-670-3p mimics、anti-miR-670-3p、miR-NC、anti-miR-NC、si-ROR、si-MARCH5、si-NC、pcDNA-ROR、pcDNAMARCH5、pcDNA-NC，轉(zhuǎn)染時(shí)間6 h。

1.3 細(xì)胞分組與處理 未轉(zhuǎn)染的GC9811-P細(xì)胞分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，對(duì)照組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，低、中和高劑量組分別用含0.06 μmol/L、0.30 μmol/L 和1.50 μmol/L[2]舒尼替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染si-ROR、si-NC、miR-670-3p mimics、miR-NC和si-MARCH5的細(xì)胞分別記為si-ROR 組、si-NC 組、miR-670-3p 組、miR-NC 組和si-MARCH5 組。轉(zhuǎn)染pcDNA-MARCH5 和pcDNANC的細(xì)胞均用含1.50 μmol/L舒尼替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，并分別記為舒尼替尼+pcDNA-MARCH5組和舒尼替尼+pcDNA-NC組。

1.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞接種于96 孔板中（0.5×103個(gè)/孔），按照分組處理細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，加10 μL CCK-8工作液，再孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A）值。A值越高，細(xì)胞活力越高。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于24孔板中（2.5×104/孔），按照分組處理細(xì)胞，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)后，0.25 %胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，PBS 清洗2 次。參照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說(shuō)明書(shū)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)細(xì)胞lncRNA ROR、miR-670-3p 和MARCH5 表達(dá) Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR擴(kuò)增。引物序列：lncRNA ROR 正向引物：5’-CCTGTCCTCCTGCTCTTTGC-3’，反向：5’-TTTCTTGGGCTGGTTGGTCT-3’；miR-670-3p 正向引物：5’-CTGATCGTGAGGAGAGTGT-3’，反向：5’-GGTCTTCGACATCGGGGCGG-3’；MARCH5 正向引物：5’-AAAATGGGGCCTCTGGTG TA-3’，反向：5’-TGACGGGAATGGTGGGTAAA-3’；β-actin正向引物：5’-ACCTGACCGA CTACCTCATG-3’，反向：5’-CTCGTAGCTCTTCTCCAGGG-3’；U6 正向引物：5’-GACAGA TTCGGTCTGTGGCAC-3’，反向：5’-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3’。lncRNA ROR 和MARCH5 以β-actin 為內(nèi)參，miR-670-3p 以U6 為內(nèi)參，2－△△Ct法計(jì)算lncRNA ROR、miR-670-3p和MARCH5 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞中MARCH5、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá) RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA 法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，行10%SDS-PAGE電泳。將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂奶粉中封閉2 h；一抗MARCH5（1∶1 000）、CyclinD1（1∶800）、Cleaved-caspase-3（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）4 ℃孵育24 h，洗膜；二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜。ECL 顯色，成像系統(tǒng)顯影、曝光、拍照。Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白表達(dá)量。

1.8 lncRNA ROR 與miR-670-3p 及miR-670-3p 與MARCH5靶向關(guān)系驗(yàn)證 LncBase Predicted v.2 和starbase 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，lncRNA ROR 與miR-670-3p 的核苷酸序列存在連續(xù)互補(bǔ)的位點(diǎn)，miR-670-3p 與MARCH5 的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）存在連續(xù)互補(bǔ)的位點(diǎn)。PCR 分別擴(kuò)增分別含miR-670-3p 結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA ROR 與MARCH5 3’UTR序列，構(gòu)建lncRNA ROR與MARCH5的野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒WT-lncRNA ROR 和WTMARCH5。同時(shí)，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變后分別構(gòu)建lncRNA ROR 與MARCH5 的突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒MUT-lncRNA ROR 和MUTMARCH5。分別將WT-lncRNA ROR、MUT-lncRNA ROR、WT-MARCH5、MUT-MARCH5 與miR-670-3p mimics、miR-NC 共轉(zhuǎn)染至GC9811-P 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 舒尼替尼對(duì)GC9811-P 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與NC 組比較，不同劑量舒尼替尼組GC9811-P細(xì)胞活力和CyclinD1 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05），GC9811-P 細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 舒尼替尼對(duì)GC9811-P細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.2 舒尼替尼對(duì)GC9811-P 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ROR、miR-670-3p 和MARCH5 表達(dá)的影響 與NC 組比較，舒尼替尼組GC9811-P 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ROR、MARCH5mRNA 和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），miR-670-3p 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 舒尼替尼對(duì)GC9811-P細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ROR、miR-670-3p和MARCH5表達(dá)的影響

2.3 下調(diào)lncRNA ROR 表達(dá)對(duì)GC9811-P 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-NC 組比較，si-ROR 組GC9811-P細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ROR表達(dá)水平、細(xì)胞活力和CyclinD1 蛋白水平降低（P＜0.05），凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 下調(diào)lncRNA ROR表達(dá)對(duì)GC9811-P細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.4 上調(diào)miR-670-3p表達(dá)對(duì)GC9811-P細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC 組比較，miR-670-3p 組GC9811-P 細(xì)胞的OD450nm和CyclinD1 蛋白水平降低（P＜0.05），細(xì)胞中miR-670-3p 水平、凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 上調(diào)miR-670-3p表達(dá)對(duì)GC9811-P細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5 下調(diào)MARCH5 對(duì)GC9811-P 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-MARCH5組GC9811-P細(xì)胞中MARCH5 水平、細(xì)胞活力及CyclinD1 蛋白水平降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 下調(diào)MARCH表達(dá)對(duì)GC9811-P細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.6 lncRNA ROR 與miR-670-3p 及miR-670-3p 與MARCH5靶向關(guān)系驗(yàn) LncBase Predicted v.2 在線軟件預(yù)測(cè)顯示，lncRNA ROR 與miR-670-3p 的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)；starbase在線軟件預(yù)測(cè)顯示，miR-670-3p 與MARCH5 的3’UTR 存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)。共轉(zhuǎn)染miR-670-3p mimics 與WT-lncRNA ROR 或WT-MARCH5 的細(xì)胞熒光素酶活性均低于共轉(zhuǎn)染miR-NC 與WT-lncRNA ROR 或WTMARCH5 的細(xì)胞（P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染miR-670-3p mimics 與MUT-lncRNA ROR 或MUT-MARCH5 的細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR-NC 與MUT-lncRNA ROR或MUT-MARCH5的細(xì)胞熒光素酶活性比較差異均不顯著（P＞0.05）。si-ROR 組GC9811-P細(xì)胞中miR-670-3p表達(dá)水平顯著高于si-NC組（P＜0.05），pcDNA-ROR組GC9811-P細(xì)胞中miR-670-3p表達(dá)水平顯著低于pcDNA-NC 組（P＜0.05）。miR-670-3p組GC9811-P細(xì)胞中MARCH5蛋白表達(dá)水平顯著低于miR-NC 組（P＜0.05），anti-miR-670-3p 組GC9811-P細(xì)胞中MARCH5蛋白表達(dá)水平顯著高于anti-miR-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 lncRNA ROR與miR-670-3p及miR-670-3p與MARCH5靶向關(guān)系驗(yàn)證

2.7 上調(diào)MARCH5 降低舒尼替尼對(duì)GC9811-P 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與舒尼替尼+pcDNA-NC 組比較，舒尼替尼+pcDNA-MARCH5 組GC9811-P 細(xì)胞活力和CyclinD1 蛋白水平升高（P＜0.05），凋亡率和Cleaved-caspase-3 蛋白水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖7。

圖7 上調(diào)MARCH5降低舒尼替尼對(duì)GC9811-P細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討論

舒尼替尼是一類新型的吲哚類多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，已被用于治療晚期腎癌及對(duì)伊馬替尼抵抗的胃腸道間質(zhì)瘤[8]。此外，舒尼替尼在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用[9-10]。本研究結(jié)果顯示，舒尼替尼可降低胃癌GC9811-P細(xì)胞的增殖能力且加劇GC9811-P細(xì)胞凋亡，這提示其可能具有抗胃癌的作用。CyclinD1是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞通過(guò)G1/S 期檢查點(diǎn)，其表達(dá)增加可促進(jìn)細(xì)胞增殖[11]。Caspase-3 是caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子，其活化后剪切下游分子，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本研究顯示，舒尼替尼作用抑制胃癌GC9811-P 細(xì)胞中CyclinD1 蛋白表達(dá)，而促進(jìn)Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)，進(jìn)一步從蛋白水平說(shuō)明舒尼替尼可抑制胃癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有一定抗胃癌作用。

lncRNA 在真核生物中廣泛存在，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等生命過(guò)程[13]。研究顯示，lncRNA ROR 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，其可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-223-3p，增強(qiáng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力；LncRNA ROR通過(guò)促進(jìn)Notch1蛋白表達(dá)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，并阻礙細(xì)胞凋亡；LncRNA-ROR 在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織，且其高表達(dá)與患者臨床分期和分化程度呈正相關(guān)，過(guò)表達(dá)lncRNA ROR 通過(guò)靶向miR-145上調(diào)FLNB表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14-16]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)lncRNA ROR表達(dá)可抑制GC9811-P 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，這提示lncRNA ROR 在胃癌的發(fā)展中起促癌基因作用，其有可能成為胃癌治療的分子靶點(diǎn)；此外，舒尼替尼對(duì)胃癌GC9811-P 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ROR 表達(dá)起抑制作用，進(jìn)一步提示舒尼替尼可能通過(guò)下調(diào)lncRNA ROR表達(dá)發(fā)揮抗胃癌作用。

LncBase Predicted v.2 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，lncRNA ROR 與miR-670-3p 的核苷酸序列存在連續(xù)互補(bǔ)位點(diǎn)，這提示lncRNA ROR 可能靶向結(jié)合miR-670-3p，本研究利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了這一結(jié)果。同時(shí)，上調(diào)GC9811-P 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ROR的表達(dá)抑制了miR-670-3p表達(dá)，而下調(diào)lncRNA ROR 表達(dá)則促進(jìn)了miR-670-3p 的表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明lncRNA ROR靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-670-3p 表達(dá)，這也與舒尼替尼抑制胃癌GC9811-P 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ROR 表達(dá)而促進(jìn)miR-670-3p 表達(dá)的結(jié)果一致。研究顯示，靶向抑制miR-670-3p的表達(dá)可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移，miR-670-3p作為抑癌基因參與肺癌發(fā)展進(jìn)程[17]。本研究顯示，上調(diào)miR-670-3p 表達(dá)可抑制胃癌GC9811-P 細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示miR-670-3p有可能成為抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的分子靶點(diǎn)。

MARCH5 是一種線粒體外膜蛋白，屬于MARCH 家族成員。Starbase 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，miR-670-3p與MARCH5的核苷酸序列存在連續(xù)互補(bǔ)的位點(diǎn)，這提示MARCH5可能是miR-670-3p的靶基因。本研究利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了MARCH5 是miR-670-3p 的靶基因，且上調(diào)miR-670-3p表達(dá)抑制GC9811-P細(xì)胞中MARCH5蛋白表達(dá)，而下調(diào)miR-670-3p 則促進(jìn)MARCH5 蛋白表達(dá)。研究顯示，MARCH5 在宮頸癌、鼻咽癌和卵巢癌等腫瘤中表法上調(diào)，下調(diào)MARCH5降低了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[18-20]。但目前，MARCH5對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響還未知。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)MARCH5 對(duì)胃癌GC9811-P 細(xì)胞增殖起抑制作用，而對(duì)其凋亡起促進(jìn)作用，這提示通過(guò)采用一定措施降低MARCH5 表達(dá)有可能抑制胃癌的發(fā)展進(jìn)程。本研究還結(jié)果顯示，舒尼替尼可抑制胃癌GC9811-P 細(xì)胞中MARCH5 表達(dá)，而上調(diào)MARCH5表達(dá)逆轉(zhuǎn)了舒尼替尼對(duì)GC9811-P細(xì)胞增殖和凋亡的影響，提示舒尼替尼通過(guò)下調(diào)細(xì)胞中MARCH5表達(dá)抑制GC9811-P細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，舒尼替尼可有效抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)控lncRNA ROR/miR-670-3p/MARCH5軸有關(guān)。