史許鋒,劉 侃,王 莉,王煥萍,張敬麗,武海英

(河南省人民醫(yī)院產(chǎn)科,鄭州 450003)

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種嚴重的母體炎癥性疾病,具有內(nèi)皮細胞功能障礙,尚缺乏有效的治療和預防方法。子癇前期是一種妊娠特異性綜合征,全球發(fā)病率在2%~8%之間,是導致早產(chǎn)、孕產(chǎn)婦死亡的主要原因[1-2]。PE定義為妊娠20周或之后伴有新發(fā)蛋白尿,子宮胎盤功能障礙或其他母體器官功能障礙的妊娠高血壓[3]。除終止妊娠外,尚無有效的PE治療方法,對PE高風險孕婦的預防措施也很有限[4]。此外,有PE病史的女性患心血管疾病的風險更高[5]。因此,預防PE對預防女性心血管疾病具有重要意義。

PE的發(fā)病機制仍不清楚,有證據(jù)表明它與局部和全身性血管內(nèi)皮損傷以及炎癥的過度活化有關(guān)[6]。PE患者胎盤中抗血管生成分子和炎性因子分泌明顯增加,從而導致內(nèi)皮表面分子模式的急劇變化,并導致全身性內(nèi)皮功能障礙、血管收縮和隨后的高血壓[7]。因此,調(diào)節(jié)抗血管生成因子的平衡,減少過度的炎癥激活以及保護內(nèi)皮功能是治療和預防PE的關(guān)鍵目標。葫蘆巴堿(trigonelline)為傳統(tǒng)中藥益母草的有效成分,具有抗氧化、保護心腎、提高生育等作用,以往研究指出,葫蘆巴堿的使用可以通過JAK/Stat3等信號通路而抑制炎癥機制的過度激活,促進血管新生,并通過NO-cGMP途徑起血管舒張作用,最終發(fā)揮血管保護作用[8]。此外,在異氟醚麻醉的小鼠模型中,葫蘆巴堿的預防性使用可以抑制異氟醚麻醉誘導的心肌凋亡[9]。然而,預防性使用葫蘆巴堿對于PE癥狀的治療作用尚未見報道,因此,本研究旨在確定妊娠早期使用葫蘆巴堿對于一氧化氮合酶拮抗劑N-硝基-1-精氨酸甲酯(LNAME)誘導的PE大鼠的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性SD大鼠28只,8~10周齡,體重200~220 g。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006),將大鼠飼養(yǎng)于鄭州大學動物實驗中心[SYXK(豫)2019-00013]。溫度控制在(23±3)℃,濕度(50±10)%和光照-黑暗周期(12 h∶12 h)的條件下,自由進食和飲水。本實驗的研究過程遵循實驗動物3R原則。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準((2019)倫審第(38)號)。

1.2 主要試劑與儀器

LNAME(江藍純生物試劑有限公司,中國);葫蘆巴堿(安諾倫生物科技有限公司,中國);CMC(安諾倫生物科技有限公司,中國);高碘酸席夫(Schiff,美國);PrimeScript RT試劑盒(成都靈動生物技術(shù)有限公司,中國);TB Green Premix Ex Taq II(Takara Biotechnology,日本);總蛋白提取試劑(維潤賽潤生物試劑有限公司,中國);聚偏二氟乙烯膜(Millipore,美國);HPR偶聯(lián)的二抗(博拓生物科技股份有限公司,中國);sFlt-1酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、PlGF ELISA試劑盒,NO ELISA試劑盒,eNOS ELISA試劑盒,TNF-αELISA試劑盒和IL-6 ELISA試劑盒(試劑盒均購置于利翰生物科技有限公司,中國);光學顯微鏡(Leica Microsystems,德國);MS550D換能器和Visual Sonic超聲系統(tǒng)(Visual Sonic,美國);ABI Prism 7300系統(tǒng)(Applied Biosystems,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 治療方法

將雌性大鼠與雄性大鼠(2∶1)交配,并且檢測到陰栓時記為妊娠日GD 0,然后將雌性大鼠從GD 0隨機分為四組,每組7只。對照組:GD 9-20時通過經(jīng)口管飼法給予0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC);LNAME組:GD 9-20時皮下注射75 mg/(kg·d)的LNAME[10];低劑量葫蘆巴堿組(LT組,n=7):GD 9-20時皮下注射75 mg/(kg·d)的LNAME,并以2 mg/(kg·d)的劑量經(jīng)口管飼法給予葫蘆巴堿-20溶于CMC;(4)高劑量葫蘆巴堿組(HT組):GD 9-20時皮下注射75 mg/(kg·d)的LNAME,并以10 mg/(kg·d)的劑量經(jīng)口管飼法給予葫蘆巴堿-20(溶于CMC)。

LNAME是一種一氧化氮合成酶抑制劑,孕鼠注射LNAME可產(chǎn)生與人類PE類似的表型,主要表現(xiàn)在高血壓和蛋白尿,通過上述可以判斷PE模型的情況。

1.3.2 血壓測量

使用無創(chuàng)自動血壓分析儀(第一三共株式會社,日本)通過尾袖法[11]在有意識大鼠中測量收縮壓(SBP),舒張壓(DBP)和平均動脈壓(MAP)。

1.3.3 蛋白尿監(jiān)測

在GD 0和GD 18時采用代謝籠收集24 h的尿液,將樣品儲存在-80℃并進行分析以評估蛋白質(zhì)濃度(Thermo Scientific,美國)。

1.3.4 高頻超聲成像

在GD 19時使用高頻超聲成像檢測母體血流介導的股動脈擴張(FDM)和股動脈壁切應力(WSS),使用MS550 D換能器和Visual Sonic超聲系統(tǒng)獲得圖像,測量值(靜態(tài)圖像和視頻剪輯/電影循環(huán))以數(shù)字方式存儲,用于脫機分析血流介導的擴張[12]。

1.3.5 組織取樣

在GD 20時脫頸處死檢查子宮的胎盤和胎兒的重量和長度,同時切除母鼠腎,將胎盤和腎轉(zhuǎn)移到液氮中,并保存在-80℃進行Western blot印跡或聚合酶鏈反應(PCR)分析,或保存在4%多聚甲醛中進行組織學檢查。

1.3.6 組織學和免疫組化

將胎盤組織樣品在4%多聚甲醛中固定48 h,包埋在石蠟中,切成5μm厚的切片,并用蘇木精和曙紅染色;將腎組織切成3μm厚的切片,用高碘酸席夫染色后評估腎小球硬化指數(shù)[13]。

對于免疫組織化學,將切片與抗大鼠抗p-NFκB p65(Abcam,英國,1∶500)抗體一起孵育,使用光學顯微鏡進行顯微鏡分析,通過Image J對結(jié)果進行定量分析。

1.3.7 sFlt-1、PlGF、NO、eNOS、TNF-α和IL-6激活測定

在GD 20時從主動脈收集血液到抗凝管中,以2000 r/min離心15 min分離血漿,根據(jù)制造商的說明,使用sFlt-1酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、PlGF ELISA試劑盒、NO ELISA試劑盒、eNOS ELISA試劑盒、TNF-αELISA試劑盒和IL-6 ELISA試劑盒測量sFlt-1、PlGF、NO、eNOS、TNF-α和IL-6的血漿濃度。

1.3.8 實時定量PCR

按照制造商的說明使用TRIzol提取組織總RNA,通過Agilent 2100生物分析儀檢測RNA的完整性,使用PrimeScript RT試劑盒從等量的不同樣品RNA中合成cDNA,并使用TB Green Premix Ex Taq II用于進行PCR反應,以GAPDH用作內(nèi)部對照,通過ABI Prism 7300系統(tǒng)測量TNF-α、IL-6、NF-κB p65和GAPDH的表達。引物組的序列列于表1。

表1 PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.3.9 蛋白質(zhì)印跡分析

按照制造商的說明使用總蛋白提取試劑提取組織總蛋白,在100℃下加熱5 min,將蛋白質(zhì)裂解物(35 mg)在Tris-甘氨酸緩沖的10%SDS-PAGE上通過電泳分級分離,并將印跡轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,將膜在室溫下封閉2 h,然后與p-IκBα、IκBα、p-NF-κB p65和NF-κB p65的相應一抗孵育過夜,隨后將膜與HPR偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h,將蛋白質(zhì)表達標準化為GAPDH的表達,使用增強化學發(fā)光法(ECL,Keygen)檢測蛋白信號,并使用Image J 2x軟件分析條帶。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 24.0(美國SPSS Inc.)進行,結(jié)果表示為平均數(shù)±標準差(±s)。如果數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且具有均一的方差,則使用t方差單向分析后通過最低顯著性差異(LSD)進行t檢驗,以計算各個研究組之間的差異;方差不一致時,則使用Dunnett T3分析組之間的差異。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 葫蘆巴堿可預防PE大鼠的妊娠高血壓,蛋白尿,低母體體重和胎鼠生長受限

妊娠初期四組血壓無明顯差異,在GD10時,LT和HT組的血壓顯著低于LNAME組的血壓,且LT和HT組的血壓在整個懷孕期間仍與對照組相似(P＞0.05,圖1A、1B、1C);此外,GD 0時四組蛋白尿之間無顯著差異(P＞0.05),而在GD18上,LT和HT組的蛋白尿明顯低于LNAME組(P＜0.001),LNAME組的蛋白尿明顯高于對照組(P＜0.001),LT,HT和對照組之間則無顯著差異(P＞0.05,圖1D)。Control組胎兒數(shù)量(11.5±1.7)與L-NAME組(12.4±0.8)、LT組(11.8±2.1)、HT組(12.6±1.6)之間無顯著差異(P＞0.05)。LNAME組的體重降低,胎兒身長(P＜0.001)和體重(P＜0.01)顯著低于其他組,而LT和HT組母體體重和胎鼠生長被明顯保護(圖1E、1H、1I),四組胎盤直徑或重量無顯著差異(P＞0.05,圖1F)

圖1 葫蘆巴堿對子癇前期癥狀的影響(ˉx±s)Note.A~C,Blood pressure in four groups of pregnant rats.D,Proteinuria.E,Weight gain in pregnant rats.F,Placental length.Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared with LNAME group,#P＜0.05,###P＜0.001.Figure 1 Effect of Trigonelline on preeclampsia

2.2 葫蘆巴堿可以緩解PE樣大鼠的胎盤和腎組織學損傷

對照組的胎盤迷路區(qū)規(guī)則且血液豐富,而LNAME組大鼠胎盤迷路區(qū)混亂并存在合胞性結(jié)節(jié),這些結(jié)節(jié)可能阻礙胎盤的血液供應并降低胎盤的功能,在預防性使用葫蘆巴堿后,大鼠胎盤迷路區(qū)顯示出明顯的改善,結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少(圖2A,P＜0.001),此外,LNAME組的腎小球硬化指數(shù)顯著高于對照組,與LNAME組相比,LT和HT組的腎小球硬化指數(shù)被明顯改善(P＜0.01,圖2B、2C)。

圖2 葫蘆巴堿減輕LNAME誘發(fā)的先兆子癇樣大鼠的胎盤和腎的形態(tài)損傷(ˉx±s)Note.A,HE staining images of placenta(n=4,Keywords syncytial nodules marked with arrows).B,PAS staining images of the kidneys(Glomerular sclerosis marked with arrows,n=3).C,Glomerular sclerosis index(n=3).Compared with control group,***P＜0.001.Compared with LNAME group,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 2 Trigonelline attenuates LNAME induced morphological damage to the placenta and kidneys in preeclampsia rats

2.3 葫蘆巴堿可改善PE大鼠血漿中的內(nèi)皮依賴性血管舒張,內(nèi)皮功能生物標志物和平衡的血管生成分子

四組大鼠基線股動脈直徑差異無統(tǒng)計學意義(圖3A、3B,P＞0.05),缺血5 min后,對照組,LT組和HT組的FMD隨時間逐漸增加,在120 s達到峰值,LNAME組在240 s達到峰值,LNAME組的FMD峰值顯著低于對照組,LT和HT組(圖3C);此外,四組之間基線WSS沒有顯著差異,缺血后四組WSS隨時間變化,與LNAME組相比,葫蘆巴堿使LT和HT組的WSS明顯降低(圖3D)。

圖3 葫蘆巴堿對內(nèi)皮功能和血管生成因子的影響(ˉx±s)Note.A,Femoral artery diameter in four groups of rats.B,Pulse Doppler images.C,Blood flow-mediated dilation.D,Wall shear stress.E,NO in plasma.F,eNOS.G,sFlt-1.H,PlGF.I,sFlt-1/PlGF ratios.Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.001,***P＜0.001.Compared with LNAME group,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 3 Effects of Trigonelline on endothelial function and angiogenic factors

與LNAME組相比,LT和HT組的血漿NO恢復到正常水平,與對照組相似(圖3E,P＞0.05),血漿eNOS水平得到改善(圖3F,P＜0.001),與LNAME組相比,LT和HT組的血漿sFlt-1水平顯著降低(圖3G),HT組的血漿PlGF值恢復至與對照組相似的水平(圖3H,P＞0.05),同時,LT和HT組的sFlt-1/PlGF比率明顯低于LNAME組的比率(圖3I,P＜0.001)。

2.4 葫蘆巴堿可以抑制PE樣大鼠血漿和組織中炎性細胞因子的釋放

LNAME誘導的大鼠的血漿TNF-α和IL-6水平顯著高于對照組(P＜0.01),而LT和HT組的血漿水平顯著降低(P＜0.01,圖4A、4B),與對照組相比,LNAME組血漿與腎中TNF-α和IL-6的mRNA水平顯著增加(P＜0.001),而LT和HT組TNF-α和IL-6的mRNA水平明顯降低,且HT組的表現(xiàn)優(yōu)于LT組(圖4C、4D、4E、4F)。

圖4 葫蘆巴堿的預防性給藥可以下調(diào)血漿,胎盤和腎中的炎性細胞因子(ˉx±s)Note.A/B,Levels of TNF-αand IL-6 in plasma of four groups of rats.C/D,Expression of TNF-αand IL-6 mRNA in rat placenta of four groups.E/F,TNF-αand IL-6 mRNA expression in the kidney of four groups of rats.Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared with LNAME group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 4 Prophylactic administration of Trigonelline can downregulate inflammatory cytokines in plasma,placenta and kidney

2.5 葫蘆巴堿可抑制PE大鼠胎盤中的炎癥

免疫組織化學分析顯示,LT和HT組的胎盤中p-NF-κB水平明顯低于LNAME組(P＜0.001),NFκB的mRNA表達明顯降低(P＜0.001),而HT組的表現(xiàn)優(yōu)于LT組(圖5A、5B、5C),此外,與LNAME組相比,葫蘆巴堿組中p-IκBα與IκBα的比率以及NF-κB與p-NF-κB的比率顯著降低(圖5D、5E、5F、5G,P＜0.001),這些數(shù)據(jù)表明葫蘆巴堿抑制LNAME誘導的PE樣大鼠胎盤中的炎癥可能與IκBα/NFκB信號通路有關(guān)。

圖5 葫蘆巴堿抑制PE大鼠胎盤中的IκBα/NF-κB信號通路(ˉx±s)Note.A,Immunohistochemical staining of placental tissue p-NF-κB in four groups of rats.B,p-NF-κB expression in the placenta.C,NF-κB mRNA level.D,Western blot images of p-NF-κB and IκBα.E,Ratio of p-NF-κB to IκBα.F,Western blot images of p-NF-κB and NF-κB.G,Ratio of p-NF-κB to IκBα.Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared with LNAME group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 5 Inhibition of IκBα/NF-κB signaling pathway in PE rat placenta by Trigonelline

2.6 葫蘆巴堿可以抑制PE大鼠腎的炎癥

免疫組織化學分析顯示,LT和HT組的腎中p-NF-κB與NF-κB的mRNA水平明顯低于LNAME組(P＜0.01),而HT組的表現(xiàn)優(yōu)于LT組(圖6A、6B、6C),此外,與LNAME組相比,葫蘆巴堿組中p-IκBα與IκBα的比率以及NF-κB與p-NF-κB的比率顯著降低(圖6D、6E、6F、6G,P＜0.01)。這些數(shù)據(jù)表明葫蘆巴堿抑制LNAME誘導的PE樣大鼠腎的炎癥可能與IκBα/NF-κB信號通路有關(guān)。

圖6 葫蘆巴堿抑制PE大鼠腎中的IκBα/NF-κB信號通路(±s)Note.A,Immunohistochemical staining p-NF-κB renal tissue in four groups of rats.B,p-NF-κB expression in the kidneys.C,NF-κB mRNA level.D,Western blot images of p-NF-κB and IκBα.E,Ratio of p-IκBαto IκBα.F,Western blot images of p-NF-κB and NF-κB.G,Ratio of p-NF-κB to NF-κB.Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared to the LNAME group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 6 Inhibition of IκBα/NF-κB signaling pathway in PE rat kidney by Trigonelline

3 討論

由于妊娠期間宮內(nèi)暴露于高血壓,妊娠高血壓的母親及其后代都有長期的心血管后遺癥,因此,患有PE高危因素的孕婦的患者應進行預防性干預[14-15]。但是,預防PE的措施是有限的,而阿司匹林是唯一具有可靠預防PE的藥物[16]。研究表明[17],PE與炎癥反應和內(nèi)皮功能障礙有關(guān),葫蘆巴堿可以通過抑制炎癥舒張血管平滑肌而發(fā)揮內(nèi)皮功能保護作用。因此,在這項研究中,我們使用葫蘆巴堿進行PE的預防性治療。

葫蘆巴堿的預防性給藥可預防LNAME誘導的PE樣妊娠大鼠的高血壓,同時降低孕鼠尿蛋白,將胎盤的長度和重量恢復至正常水平,此外,由于葫蘆巴堿可以緩解胎兒生長限制,孕期孕鼠的體重增加相應增加,此外,在妊娠早期服用葫蘆巴堿時,血壓不低于正常水平,這表明葫蘆巴堿不會因降低血壓而降低母體灌注。最后,胎盤和腎的組織學檢查表明葫蘆巴堿起保護作用,而蛋白印跡和PCR分析提示葫蘆巴堿的保護作用與IκBα/NF-κB途徑抑制相關(guān)。

葫蘆巴堿的預防性給藥可預防LNAME誘導的PE樣妊娠大鼠模型中血流介導的FMD峰值明顯較低,而FMD是一種通過測量短暫性腦缺血后動脈直徑的變化來評估內(nèi)皮功能的技術(shù),與使用內(nèi)皮素,一氧化氮和其他生物標記物相比,FMD具有無創(chuàng),可靠且具有系列特征的特點,被廣泛用于評估內(nèi)皮功能,或者懷孕期間的心血管風險[18]。葫蘆巴堿改善可以內(nèi)皮舒張功能從而表現(xiàn)為FMD峰值的增加,同時降低血管壁的切應力,并恢復NO和eNOS的血漿水平,改善由LNAME誘導的PE樣大鼠的內(nèi)皮功能障礙。PE的病理機制與異常循環(huán)血管生成因子有關(guān),可溶性酪氨酸激酶-1(sFlt-1)與循環(huán)的PlGF和VEGF結(jié)合,從而降低其在子宮胎盤和母體循環(huán)中的水平,導致內(nèi)皮功能障礙,血管收縮和高血壓[19-20]。本研究的結(jié)果顯示,葫蘆巴堿改善孕鼠sFlt-1和PlGF的平衡,并降低了sFlt-1/PlGF,表明葫蘆巴堿可以保護LNAME誘導的PE樣大鼠的內(nèi)皮功能。與健康對照組孕婦和非孕婦相比,PE婦女的TNF-α和IL-6水平顯著升高,并導致內(nèi)皮功能障礙[20]。近期文獻報道[21],甲醛吸入可引起小鼠肺和全身損傷,而葫蘆巴堿的給藥可降低血漿中的TNF-α,IL-6和KC/GRO水平,并降低胎盤中TNF-α的表達。我們的數(shù)據(jù)表明,葫蘆巴堿的預防性給藥可降低血漿中TNF-α和IL-6的水平,同時抑制LNAME誘導的PE樣大鼠模型的胎盤和腎臟中TNF-α和IL-6的表達,這表明葫蘆巴堿可降低LNAME誘導的PE模型中的炎性細胞因子。NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥的重要因素,它在炎癥反應的激活中起著關(guān)鍵作用,而炎癥反應涉及許多重要的人類疾病[22],例如心血管疾病和PE,此外,研究表明[23],NF-κB信號的激活加劇妊娠孕婦的內(nèi)皮功能障礙。本研究的結(jié)果指出,葫蘆巴堿對胎盤和腎的保護作用可能與IκBα/NF-κB信號通路有關(guān),通過抑制其表達和激活而降低胎盤和腎的炎癥狀態(tài)。

總之,本研究的結(jié)果表明,葫蘆巴堿在LNAME誘導的PE樣大鼠模型中的預防性使用可減輕PE癥狀,促進胎兒生長,保護內(nèi)皮功能并抑制IκBα/NF-κB途徑以減少炎癥反應。