方圓 吳迅 林宇 王海燕 吳慧平 鞠玉亮

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/植物病蟲害生物學(xué)與綠色防控安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036；2. 天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測中心，天津 300461）

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）是一種遷移性內(nèi)寄生植物線蟲，引起的松樹萎蔫病，被稱為松樹的“癌癥”［1］。松樹萎蔫病是松林最嚴(yán)重的病害，已對(duì)東亞松林資源和松林生態(tài)系統(tǒng)造成毀滅性破壞，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［2-4］。我國于1982年首次在南京紫金山黑松上發(fā)現(xiàn)松材線蟲［5］，截至2018年，松材線蟲已擴(kuò)散至我國18個(gè)省的588個(gè)縣級(jí)行政區(qū)域，累計(jì)致死松樹達(dá)數(shù)十億株，造成經(jīng)濟(jì)損失超數(shù)十億元（國家林業(yè)和草原局2019年第4號(hào)公告）。傘滑刃屬包含100多個(gè)描述種，其中，松材線蟲與擬松材線蟲（B. mucronatus）的親緣關(guān)系最近［6］。擬松材線蟲與松材線蟲占據(jù)相同的生態(tài)位，兩者在形態(tài)、生活習(xí)性、傳播媒介、寄主等方面有許多相似的生物學(xué)特性［7］。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為擬松材線蟲不致病或致病力較弱，但近年來大量研究表明擬松材線蟲不同種群致病性存在明顯分化，增加了松材線蟲的檢測和防控難度［8-9］。

松材線蟲防控關(guān)鍵環(huán)節(jié)主要包括3個(gè)方面，即病害檢疫與疫情監(jiān)測、疫木除治和媒介昆蟲防治，其中，病害檢疫的核心內(nèi)容是松材線蟲的檢測鑒定［10］。傳統(tǒng)檢測方法主要依據(jù)松材線蟲的形態(tài)學(xué)特征，而松材線蟲與擬松材線蟲的形態(tài)特征極為相似，唯一不同點(diǎn)僅在于擬松材線蟲雌蟲尾端的尾尖突。然而，不同地理群體松材線蟲雌蟲尾尖突有較大變化，僅根據(jù)形態(tài)特征來判斷，往往是不可靠的，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤診斷［11］。近二十年來，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的分子檢測技術(shù)在植物線蟲分子診斷方面應(yīng)用廣泛［12-13］。常規(guī)PCR、PCR-RFLP、PCR-SCAR、雙重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)已大量應(yīng)用于松材線蟲和擬松材線蟲的快速、同步或定量檢測鑒定［14-18］。以PCR為基礎(chǔ)的分子技術(shù)為松材線蟲的檢疫鑒定提供成熟可靠的技術(shù)，同時(shí)也存在對(duì)儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)人員專業(yè)背景要求高的特點(diǎn)。

近年來，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在植物線蟲檢測方面受到越來越多的關(guān)注，其中，應(yīng)用較多的主要為環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）。LAMP可在60-65℃條件下依靠3對(duì)引物完成對(duì)核酸的特異性擴(kuò)增，已廣泛應(yīng)用于松材線蟲、根結(jié)線蟲、短體線蟲、水稻干尖線蟲等的分子檢測［12，19-22］。RPA在30-42℃恒溫條件下，利用1對(duì)長約30-35 bp的RPA引物在重組酶、單鏈結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶3種酶的作用下完成對(duì)核酸的指數(shù)擴(kuò)增。RPA技術(shù)已用于松材線蟲、根結(jié)線蟲、菊花滑刃線蟲的可視化快速檢測［23-27］。Cha等［24］首次將RPA技術(shù)應(yīng)用于植物線蟲快速檢測，并結(jié)合SYBR green I紫外顯色法在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)感病松木內(nèi)松材線蟲的可視化快速檢測。

目前，尚未見雙重RPA技術(shù)在植物線蟲檢測鑒定方面的應(yīng)用，本研究以松材線蟲和擬松材線蟲核糖體DNA（rDNA）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS（internal transcribed space）為檢測靶標(biāo)，設(shè)計(jì)RPA引物，優(yōu)化RPA檢測體系，建立可同步檢測松材線蟲和擬松材線蟲的雙重RPA檢測體系，為兩種線蟲的檢疫鑒定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)供試15個(gè)線蟲種群見表1，其中，松材線蟲種群5個(gè)，擬松材線蟲種群4個(gè)，豆傘滑刃線蟲（B. doui）種群1個(gè)，食菌傘滑刃線蟲（B. fungivous）種群1個(gè)，萊奴爾夫滑刃線蟲（B. rainulfi）種群1個(gè)，菊花滑刃線蟲（Aphelenchoides ritzemabosi）種群1個(gè)，水稻干尖線蟲（A. besseyi）種群2個(gè)。所有線蟲種群都已進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子鑒定，并由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物線蟲實(shí)驗(yàn)室保存。

表1 供試線蟲種群Table 1 Population information of nematodes

1.2 方法

1.2.1 單條線蟲DNA提取 單條線蟲DNA提取參考容萬韜等［28］的方法，體式顯微鏡下挑取單條線蟲，置于含8 μL ddH2O的載玻片中，用解剖針將線蟲切斷，加入2 μL裂解液，于56℃溫育1 h，95℃處理10 min，離心取上清于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙重RPA引物設(shè)計(jì) RPA引物設(shè)計(jì)原則要求引物長30-35 bp，3'端富含GC，5'端含有嘧啶，擴(kuò)增片段小于500 bp。依據(jù)www.twistdx.co.uk提供的RPA引物設(shè)計(jì)建議，對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲ITS區(qū)差異序列進(jìn)行分析，并對(duì)趙立榮等［14］所開發(fā)PCR引物進(jìn)行改造，設(shè)計(jì)雙重RPA引物Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R（表2）。其中引物對(duì)Bx-rpa-F/Bxm-rpa-R用于檢測松材線蟲，Bm-rpa-F/Bxmrpa-R用于鑒定擬松材線蟲，兩者共用下游引物Bxm-rpa-R。RPA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 用于雙重RPA的引物及其序列Table 2 Primers and their sequences for duplex-RPA

1.2.3 雙重RPA擴(kuò)增 RPA擴(kuò)增反應(yīng)參照TwistAmp Basic Kit（TwistDx Limited，Cambridge，UK）操作說明進(jìn)行，RPA擴(kuò)增體系為50 μL。將2.4 μL PRA引物（10 μmol/L），2 μL模板DNA，29.5 μL TwistAmp rehydration buffer，11.2 μL ddH2O于反應(yīng)管中充分混勻。加入2.5 μL MgAc（280 nmol/L）啟動(dòng)RPA反應(yīng)，于37℃水浴30 min。反應(yīng)結(jié)束后，用SanPrep PCR純化試劑盒（Sangon Biotech，China）純化RPA產(chǎn)物，并在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.2.4 雙重RPA反應(yīng)條件優(yōu)化 為確定雙重RPA的最佳反應(yīng)條件，對(duì)反應(yīng)體系中RPA引物濃度配比進(jìn)行優(yōu)化。在50 μL反應(yīng)體系中，松材線蟲和擬松材線蟲DNA提取液按1∶1配比作為模板，設(shè)置不同引物濃度配比進(jìn)行RPA反應(yīng)，即10 μmol/L引物Bx-rpa-F、Bm-rpa-F、Bxm-rpa-R分別按2.4∶0∶2.4、2.1∶0.3∶2.4、1.8∶0.6∶2.4、1.5∶0.9∶2.4、1.2∶1.2∶2.4、0.9∶1.5∶2.4、0.6∶1.8∶2.4、0.3∶2.1∶2.4、0∶2.4∶2.4 μL的量添加。

1.2.5 常規(guī)PCR檢測 常規(guī)PCR反應(yīng)體系為25 μL，具體為1 μL模板DNA，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，12.5 μL×TaqPCR MasterMix，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。1.2.6 雙重RPA特異性和靈敏度分析 選取表1所列15個(gè)線蟲種群，提取單條線蟲DNA，檢測Bxrpa-F、Bm-rpa-F、Bxm-rpa-R用于松材線蟲與擬松材線蟲雙重RPA檢測的特異性。同時(shí)，以ddH2O為陰性對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。分別制備松材線蟲和擬松材線蟲大量線蟲DNA提取液和單條線蟲DNA提取液進(jìn)行雙重RPA靈敏度檢測。單條線蟲DNA稀釋至20 μL，分別取2 μL（即初始濃度為1/10條線蟲DNA），按10倍梯度稀釋法分別稀釋101、102、103、104、105倍。取2 μL稀釋液分別進(jìn)行RPA擴(kuò)增，檢測Bx-rpa-F/Bm-rpa-F/Bxm-rpa-R對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲的檢測靈敏度。此外，取相同稀釋液進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，比較RPA與PCR的檢測靈敏度。

1.2.7 雙重RPA鑒定松木樣品中松材線蟲與擬松材線蟲 為測試雙重RPA的實(shí)用性，分離采集自安徽省松材線蟲疫區(qū)的9份松木樣品中的線蟲進(jìn)行雙重RPA檢測（表3）。松木樣品中線蟲DNA的提取參考Kikuchi等［12］的方法，DNA提取液用ddH2O稀釋至100 ng/μL，在-20℃保存?zhèn)溆谩４送?，通過鏡檢的方法確認(rèn)并鑒定松木樣品中松材線蟲與擬松材線蟲。

表3 松木樣本中松材線蟲與擬松材線蟲的雙重RPA檢測Table 3 Duplex-RPA detection for B. xylophilus and B. mucronatus

2 結(jié)果

2.1 RPA檢測方法的建立

在本研究中，通過對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲的ITS序列進(jìn)行差異分析，分別設(shè)計(jì)松材線蟲和擬松材線蟲特異性上游引物Bx-rpa-F和Bm-rpa-F，以及兩者共同下游引物Bxm-rpa-R。通過減少引物數(shù)量的方式提高引物擴(kuò)增效率，避免非特異性擴(kuò)增片段的產(chǎn)生。以Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R為引物進(jìn)行RPA反應(yīng)，對(duì)松材線蟲DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物為364 bp，對(duì)擬松材線蟲DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物為189 bp，對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲DNA等量混合物的擴(kuò)增產(chǎn)物為364 bp、189 bp，陰性對(duì)照未檢測到擴(kuò)增條帶，表明Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R可用于松材線蟲和擬松材線蟲的雙重RPA檢測（圖1）。

圖1 松材線蟲和擬松材線蟲雙重RPA檢測Fig. 1 Duplex-RPA assay for detecting B. xylophilus and B. mucronatus

2.2 RPA引物最佳濃度配比

松材線蟲和擬松材線蟲等量混合物作為模板，設(shè) 置Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R不 同 引 物濃度配比進(jìn)行雙重RPA擴(kuò)增。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，RPA引物Bx-rpa-F和Bxm-rpa-R僅能從混合DNA樣本中檢測到松材線蟲，而Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R僅能從混合DNA樣本中檢測到擬松材線蟲。Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R三條引物組合可同時(shí)檢測到松材線蟲和擬松材線蟲，但不同引物配比間的擴(kuò)增效果差異明顯，當(dāng)三者添加量為1.5∶0.9∶2.4 μL 時(shí)，雙重RPA擴(kuò)增效果最佳。

圖2 不同引物配比下的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Amplified products with different primer ratios

2.3 雙重RPA特異性檢測

利用本研究建立的雙重RPA檢測體系，分別對(duì)15個(gè)不同線蟲種群的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖3所示，5個(gè)松材線蟲種群均擴(kuò)增出364 bp的特異性條帶，4個(gè)擬松材線蟲種群均擴(kuò)增到189 bp條帶，而其它6個(gè)線蟲種群及陰性對(duì)照均無擴(kuò)增，表明以Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R為基礎(chǔ)的雙重RPA檢測具有較好的特異性。

圖3 雙重RPA特異性檢測Fig.3 Specificity test of duplex-RPA

2.4 雙重RPA靈敏度檢測

以Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R（添 加 量1.5∶0.9∶2.4 μL）為引物組合，分別以松材線蟲和擬松材線蟲大量線蟲DNA提取液和單條線蟲DNA提取液為模板進(jìn)行雙重RPA靈敏度檢測。將松材線蟲和擬松材線蟲初始濃度為1/10條線蟲的DNA模板，按10倍梯度稀釋后進(jìn)行雙重RPA檢測。當(dāng)松材線蟲模板稀釋10倍時(shí)，能檢測到RPA擴(kuò)增條帶，而PCR在模板稀釋100倍時(shí)仍能檢測到目的條帶，表明雙重RPA檢測對(duì)松材線蟲的檢測靈敏度為10 pg/μL，相當(dāng)于1/100條線蟲（圖4-A）；當(dāng)擬松材線蟲模板稀釋10倍時(shí)，未檢測到擴(kuò)增條帶，而PCR在模板稀釋100倍時(shí)仍有特異性擴(kuò)增，表明雙重RPA對(duì)擬松材線蟲的檢測靈敏度為100 pg/μL，相當(dāng)于1/10條線蟲（圖4-B）。同時(shí)，松材線蟲與擬松材線蟲稀釋液等比例混合作為模板時(shí)，雙重RPA檢測靈敏度與兩種線蟲單獨(dú)作為模板時(shí)一致（圖4-C）。此外，通過與常規(guī)PCR檢測靈敏度比較發(fā)現(xiàn)，常規(guī)PCR對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲的檢測靈敏度為1/1 000條線蟲，高于RPA檢測靈敏度。

圖4 雙重RPA靈敏度檢測Fig. 4 Sensitivity test of duplex-RPA

2.5 松木樣本中松材線蟲和擬松材線蟲的雙重RPA檢測

采集安徽省松材線蟲疫區(qū)的9份松木樣品，利用本研究建立的雙重RPA檢測體系對(duì)其中的松材線蟲和擬松材線蟲進(jìn)行檢測鑒定。結(jié)果如圖5所示，采集自南陵地區(qū)的3份松木中2份攜帶松材線蟲、1份同時(shí)攜帶松材線蟲和擬松材線蟲；滁州地區(qū)1份松木攜帶松材線蟲、2份松木同時(shí)攜帶松材線蟲和擬松材線蟲；桐城地區(qū)的3份樣品僅攜帶松材線蟲或擬松材線蟲。雙重RPA檢測結(jié)果與鏡檢結(jié)果一致，表明雙重RPA可用于松木樣本中松材線蟲和擬松材線蟲的同步檢測。

圖5 松木樣品中松材線蟲和擬松材線蟲雙重RPA檢測Fig.5 Duplex-RPA assay for detecting B. xylophilus and B. mucronatus from wood samples

3 討論

近年來，松樹萎蔫病發(fā)生呈現(xiàn)新趨勢：向西、向北快速擴(kuò)散態(tài)勢，最西端達(dá)四川省涼山州，最北端已在遼寧北部多個(gè)縣區(qū)，發(fā)生區(qū)域突破了傳統(tǒng)理論提出的松材線蟲年均氣溫10℃以上的適生界線；發(fā)現(xiàn)云杉花墨天牛等新的傳播媒介；危害對(duì)象由過去的馬尾松、黑松擴(kuò)大到紅松、落葉松等松樹種類［29-31］。此外，松樹萎蔫病已逼近三峽庫區(qū)、秦巴山、廬山、黃山等生態(tài)區(qū)或國家重點(diǎn)風(fēng)景名勝區(qū)，嚴(yán)重威脅其生態(tài)安全，防控任務(wù)十分緊迫。在自然條件下，擬松材線蟲往往與松材線蟲同時(shí)發(fā)生，且兩者形態(tài)和生物學(xué)習(xí)性近似，為松材線蟲的檢疫鑒定增加難度。

Cha等［24］針對(duì)松材線蟲5S rDNA序列設(shè)計(jì)引物，建立松材線蟲RPA恒溫?cái)U(kuò)增體系，該體系可在10 min內(nèi)完成對(duì)核酸的指數(shù)擴(kuò)增，檢測靈敏度為1.6 pg松材線蟲基因組DNA，檢測效率較常規(guī)PCR和LAMP技術(shù)極大提高，但仍無法滿足對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲同步檢測的需求。本研究以松材線蟲和擬松材線蟲ITS序列為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)雙重RPA引物，可在37℃恒溫條件下30 min內(nèi)完成對(duì)靶標(biāo)核酸的特異性擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)松材線蟲和擬松材線蟲的同步快速檢測。

在特異性方面，本研究參考趙立榮等［14］的引物設(shè)計(jì)策略，開發(fā)松材線蟲特異性上游引物Bxrpa-F、擬松材線蟲特異性上游引物Bm-rpa-F和兩者同用下游引物Bxm-rpa-R，在一個(gè)雙重RPA反應(yīng)中添加3條引物，降低非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的幾率。同時(shí)，通過3條引物的最佳濃度配比優(yōu)化，確定雙重RPA反應(yīng)中Bx-rpa-F/Bm-rpa-F/Bxm-rpa-R的添加比例為5∶3∶8時(shí)，雙重RPA擴(kuò)增效果最佳。在靈敏度方面，雙重RPA對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲的檢測靈敏度分別為1/100、1/10條線蟲，低于常規(guī)PCR的1/1 000條線蟲，且低于已報(bào)道的LAMP 2.5×10-5條松材線蟲的檢測靈敏度［12］。雙重RPA檢測靈敏度雖低于常規(guī)PCR技術(shù)，但其足以檢測單條松材線蟲和擬松材線蟲，滿足對(duì)兩種線蟲快速檢測的需求。在實(shí)用性方面，雙重RPA從松木樣品線蟲DNA提取液中同步檢測到松材線蟲和擬松材線蟲，且擺脫P(yáng)CR儀的限制，拓寬應(yīng)用場景。

4 結(jié)論

本研究建立的雙重RPA檢測方法操作簡便、檢測效率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、對(duì)儀器設(shè)備要求低，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲的同步檢測，此方法可滿足檢疫部門或基層部門對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲檢疫鑒定的需求。