金娜 王學(xué)艷 劉倩 彭德良 彭煥 簡恒

（1. 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院園藝系，北京 102442；2. 北京市朝陽區(qū)社會(huì)保險(xiǎn)基金管理中心，北京 100020；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，北京 100083；4. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100083）

根結(jié)線蟲是威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要病原物，其寄主范圍廣泛，造成經(jīng)濟(jì)損失極大，被認(rèn)為是世界上最具破壞性的植物病原物之一。而目前許多化學(xué)殺線劑因其對生態(tài)環(huán)境的破壞已被禁用，因此符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)無公害、可持續(xù)理念的生物防治日益受到重視［1］。生物防治作為一種對環(huán)境友好的防治措施，可為根結(jié)線蟲防治提供新方法［2］。紅灰鏈霉菌（Streptomyces rubrogriseus）HDZ-9-47可寄生南方根結(jié)線蟲的卵，抑制卵孵化；又可以產(chǎn)生具有殺線蟲活性的代謝產(chǎn)物，殺死二齡幼蟲；在溫室及田間試驗(yàn)中對南方根結(jié)線蟲的防效可達(dá)50%以上，是一種很有潛力的防治根結(jié)線蟲的生防因子，具有廣闊的開發(fā)前景［3］。生物熏蒸是利用植物分解過程中釋放的活性物質(zhì)抑制或殺死土壤有害生物的方法［4-5］。王紀(jì)磊等［6］研究發(fā)現(xiàn)花椒籽熏蒸土壤后番茄根結(jié)線蟲的根結(jié)指數(shù)和根結(jié)線蟲數(shù)較對照分別下降73. 6%和85. 4%，防治效果優(yōu)于阿維菌素。利用甘藍(lán)、花椰菜等植物材料進(jìn)行土壤生物熏蒸，對真菌、細(xì)菌和線蟲等植物病害也具有一定的抑制作用［4］。本文以甘藍(lán)作為生物熏蒸材料處理番茄連作土，探究土壤生物熏蒸及土壤生物熏蒸與生防菌HDZ-9-47發(fā)酵液聯(lián)合施用對蔬菜根結(jié)線蟲的防治效果及對番茄植株生長、產(chǎn)量的影響，明確土壤生物熏蒸對番茄根系線蟲群落的影響，以期為利用生物熏蒸綠色防控蔬菜根結(jié)線蟲提供理論依據(jù)，為設(shè)施蔬菜生產(chǎn)安全和蔬菜產(chǎn)品質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植株 選用對根結(jié)線蟲敏感的番茄（Lycopersiconesculentum）東圣1號品種，種子播種于育苗盤中，以1∶1∶1的蛭石、草炭土和沙子作為基質(zhì)，精心管理，待小苗長至3-4葉期備用。

1.1.2 供試化學(xué)農(nóng)藥 噻唑膦（日本石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)杜）顆粒劑，商品名福氣多，有效成分10%。

1.1.3 熏蒸材料 甘藍(lán)（Brassica oleraceaL.）。在熏蒸前將甘藍(lán)切成大小約5 cm×5 cm的碎片。

1.1.4 生防菌紅灰鏈霉菌（Streptomyces rubrogriseus）HDZ-9-47菌株從感染植物根部的根結(jié)線蟲卵和雌蟲中分離得到，由中國科學(xué)院微生物所真菌系統(tǒng)學(xué)及生物學(xué)研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 生防菌劑制備 將菌株接種于高氏培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)7 d后，在超凈工作臺(tái)中將培養(yǎng)基切割成小塊，轉(zhuǎn)移入裝有25 mL無菌水和一小塊無菌脫脂棉的50 mL離心管中，將離心管置于微型渦旋混合儀上充分振蕩，使得大部分孢子洗脫，用滅菌的移液器抵住脫脂棉吸出孢子，并用無菌水調(diào)配成1012/mL的孢子懸浮液。以此接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基（玉米粉12.75 g/L，豆粕12.25 g/L，蛋白胨 7.25 g/L，硫酸鎂2.2 g/L，硝酸銨 1 g/L，碳酸鈣1 g/L，磷酸氫二鉀 1 g/L，硫酸錳0.338 g/L，pH 7.2）中28℃、160 r/min連續(xù)培養(yǎng)5 d［3］。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理方法 分別于2017年3月1日-7月12日春茬、8月1日-12月31日秋茬在北京市通州區(qū)大運(yùn)河蔬菜配送中心溫室大棚分別評估土壤生物熏蒸對蔬菜根結(jié)線蟲的田間防效及對土壤線蟲群落的影響。該地區(qū)在試驗(yàn)前種植番茄和黃瓜，南方根結(jié)線蟲發(fā)生較重。試驗(yàn)處理如下：

（1）土壤熏蒸處理：先將甘藍(lán)切碎，以3.5 kg/m2的用量混入土壤，添加0.1 kg/m2的碳酸氫銨，翻耕，澆足水分后覆蓋地膜。20 d后揭膜，再次翻耕，充分晾曬散濕后定植。

（2）按照處理（1）的方法進(jìn)行生物熏蒸，熏蒸20 d后，在定植時(shí)以穴施的方法每株苗接入200 mL紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液。

（3）噻唑膦按2 kg/667 m2劑量拌土撒施。

（4）空白對照：不做任何處理，表示為：CK。

每處理4個(gè)小區(qū)，每小區(qū)10 m2，各小區(qū)按照完全隨機(jī)排列，每次調(diào)查每處理取樣9-12株番茄。

1.2.3 病害調(diào)查 春茬分別在定植前、定植60 d、90 d取土樣，深度為0-20 cm，每處理每行取3個(gè)點(diǎn)，調(diào)查根結(jié)級數(shù)和防治效果。根結(jié)指數(shù)調(diào)查采用0-10級分法［7］。定植90 d時(shí)調(diào)查番茄莖粗及產(chǎn)量。

病情指數(shù)=∑（病級株數(shù)×該級代表數(shù)值）/ （調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高一級的代表數(shù)值）×100

防效%=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%

1.2.4 土壤線蟲的分離和固定 秋茬分別在定植前、定植60 d、90 d、120 d取土樣，深度為0-20 cm，每處理每行取3個(gè)點(diǎn)，采用懸浮離心法分離土壤中的線蟲，過程如下：

100 g土樣中加入100 mL水充分?jǐn)嚢?，靜置30 s后將上層渾濁液倒入離心管。重復(fù)上述步驟，渾濁液倒入離心管。將懸濁液2 000 r/min 離心5 min，上清液倒入干凈燒杯。在沉淀中加入100 mL 20%的鹽溶液，攪拌混勻1 500 r/min 離心1 min，上清液倒入干凈燒杯，沉淀中加入50 mL 20%的鹽溶液，攪拌混勻1 500 r/min 離心1 min，上清液倒入干凈燒杯。將3份上清液過500目篩網(wǎng)，用少量清水將篩面上線蟲洗入50 mL量杯中［3］。

將上述分離的線蟲，65℃水浴2 min殺死，加入TAF（福爾馬林（40%甲醛）70 mL，三乙醇胺20 mL，蒸餾水 910 mL）固定液至2 mL，固定24 h。將TAF固定的線蟲樣本與30%甘油1∶1混勻，60℃水浴3 h。

1.2.5 土壤線蟲的鑒定 于400倍顯微鏡下，依據(jù)Goodey分類系統(tǒng)，《植物線蟲志》［8］、《植物線蟲學(xué)》［9］、《中國土壤動(dòng)物檢索圖鑒》［10］鑒定到屬，再將屬按營養(yǎng)類群歸類，即食細(xì)菌類線蟲、食真菌類線蟲、植物寄生類線蟲和捕食-雜食類線蟲。

1.2.6 線蟲群落指數(shù)計(jì)算 采用自由生活線蟲成熟度指數(shù)MI（maturity index）和植物寄生線蟲成熟度指數(shù)PPI（plant parasite index）表達(dá)各生境土壤線蟲群落功能結(jié)構(gòu)特征。計(jì)算公式如下［11］：

式中，CPi為非植物寄生性（植物寄生性）線蟲第i類群colonizer-persister值；n為非植物寄生性（植物寄生性）土壤線蟲類群數(shù)；Pi為土壤線蟲群落非植物寄生性（植物寄生性）土壤線蟲第i類群的個(gè)體數(shù)占群落總個(gè)體數(shù)的比例。

采用國內(nèi)外學(xué)者普遍運(yùn)用的Shannon-Wiener指數(shù)與Pielou均勻度指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)相結(jié)合研究土壤線蟲的群落多樣性。公式如下：

式中，Pi為土壤線蟲群落第i類群個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比例；S為土壤線蟲群落線蟲類群數(shù)，N為土壤線蟲群落全部類群的個(gè)體總數(shù)［11］。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS13.0軟件，采用Duncan新復(fù)極差法分析各處理差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 土壤生物熏蒸對番茄根結(jié)線蟲的防治效果

土壤生物熏蒸可以顯著降低番茄根部的根結(jié)級數(shù)（P＜ 0.05，表1，圖1）。在定植60 d和90 d時(shí)，土壤生物熏蒸后對蔬菜根結(jié)線蟲的防效分別達(dá)58.6%和45.8%，與化學(xué)農(nóng)藥對照噻唑膦的防效無顯著差異（P ＞0.05）。生物熏蒸后再施用紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液處理在定植60 d和90 d時(shí)對根結(jié)線蟲的防治效果分別達(dá)65.5%和55.0%，高于單獨(dú)生物熏蒸。結(jié)果表明土壤生物熏蒸能夠有效防治蔬菜根結(jié)線蟲病的發(fā)生，生物熏蒸與紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液聯(lián)合施用的效果更佳。

圖1 田間小區(qū)各處理番茄根部90 d發(fā)病狀況 Fig. 1 Disease situation for the tomato roots at 90 d under different treatments in the tomato field

表1 田間小區(qū)各處理的根結(jié)級數(shù)及防效Table 1 Root-knot series and control efficacy under different treatments in the tomato field

2.2 土壤生物熏蒸對番茄產(chǎn)量及莖粗的影響

不同處理的番茄產(chǎn)量結(jié)果見圖2。對照的番茄產(chǎn)量為2.3 kg/株，土壤生物熏蒸及生物熏蒸后再施用HDZ-9-47發(fā)酵液處理對番茄都有一定的增產(chǎn)作用，土壤生物熏蒸較對照增產(chǎn)0.4 kg/株（P＜ 0.05），生物熏蒸和HDZ-9-47發(fā)酵液聯(lián)合施用處理增產(chǎn)0.6 kg/株（P＜ 0.05），噻唑膦增產(chǎn)0.1 kg/ 株。如圖2所示，不同處理的莖粗在定植90 d時(shí)與對照沒有顯著性差異。綜上所述，生物熏蒸及生物熏蒸后施用HDZ-9-47發(fā)酵液處理可以提高番茄產(chǎn)量，但對番茄莖粗無顯著性影響。

圖2 土壤生物熏蒸對番茄產(chǎn)量及莖粗的影響Fig.2 Effect of biofumigation on tomato yield and stem diameter in the tomato field

2.3 土壤生物熏蒸對線蟲各營養(yǎng)類群的影響

為了進(jìn)一步明確生物熏蒸對土壤線蟲群落的影響，在秋季進(jìn)行了該研究，從各處理土樣中共鑒定出6目12科22屬的線蟲（表2），分別歸屬于四大營養(yǎng)類群，植物寄生類、食真菌類、食細(xì)菌類和雜食/捕食類，其中植物寄生類1目3科6屬，都屬于墊刃目，非植物寄生有5目9科16屬。

表2 田間小區(qū)土壤線蟲功能類群及cp值Table 2 Functional groups and cp values of soil nematode in the tomato field

將生物熏蒸和CK處理的各營養(yǎng)類群所占土壤線蟲數(shù)量的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明在定植60和90 d時(shí)植物寄生類線蟲數(shù)量所占比例較大，顯著高于其他類群。食真菌類線蟲、食細(xì)菌類線蟲和雜食/捕食類線蟲數(shù)量所占比例較小。定植30、60和90 d時(shí)生物熏蒸處理中的食細(xì)菌類和捕食/雜食類線蟲數(shù)量的比例要高于CK處理，食真菌類線蟲和植物寄生類線蟲的數(shù)量比例要低于CK處理。結(jié)果表明生物熏蒸能降低土壤中植物寄生類線蟲和食真菌類線蟲的數(shù)量比例；提高土壤中食細(xì)菌類和捕食/雜食類線蟲的數(shù)量比例（圖3）。

圖3 不同處理各營養(yǎng)類群在土壤線蟲中所占比例Fig. 3 Ratio of every trophic group to soil nematode under different treatments

MI（自由生活線蟲成熟度指數(shù)）、PPI（植物寄生線蟲成熟度指數(shù)）、和PPI/MI是指示土壤群落功能類群特征的常用指數(shù)。MI指數(shù)和PPI指數(shù)分別指示土壤自由生活線蟲和植物寄生線蟲r-選擇和k-選擇所占的比例，顯示了線蟲的生活周期、繁殖力和抗干擾能力的強(qiáng)弱，用來評價(jià)外界干擾活動(dòng)對土壤線蟲群落的影響［10］。MI指數(shù)越低，表示環(huán)境系統(tǒng)所受的干擾越大。PPI建立在線蟲地理分布、食性類型、土壤類型和演替等因素之上。PPI指數(shù)越高表明植物寄生線蟲量越大。PPI/MI更能反映農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)豐富度，且在一定條件下，Ml和PPI的值相反。定植前不同處理土壤自由生活線蟲成熟度指數(shù)（MI）、植物寄生線蟲成熟度指數(shù)（PPI）和PPI/MI差異不顯著（P ＞0.05）。定植60、90和120 d生物熏蒸處理中的MI指數(shù)高于對照處理，表明生物熏蒸降低土壤環(huán)境所受的干擾。各處理MI均在定植60 d時(shí)達(dá)到最小值，表明定植60 d時(shí)土壤環(huán)境受到的干擾最嚴(yán)重。定植60、90和120 d生物熏蒸處理中PPI和PPI/M低于對照處理，表明生物熏蒸處理降低了土壤中植物寄生線蟲的數(shù)量（圖4）。

圖4 不同處理線蟲功能類群特征Fig.4 Characters of nematode functional groups under different treatments

生物多樣性指數(shù)是群落生物組成結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)，反映了群落內(nèi)物種的多寡和生態(tài)系統(tǒng)中食物網(wǎng)的復(fù)雜程度，從而反映各生境間的相似性和差異性。一方面，群落內(nèi)組成的屬愈豐富，群落多樣性越大；另一方面，群落內(nèi)個(gè)體在屬間分配越均勻，群落多樣性越大。多樣性指數(shù)H'指的是土壤中所有線蟲及由這些生物與環(huán)境相互作用構(gòu)成的生態(tài)系統(tǒng)的多樣化程度，它給予稀有種更多的權(quán)重，值越大，多樣性越高。豐富度指數(shù)SR即土壤所含線蟲類群的多寡，SR值大，表明土壤中線蟲的類群多。均勻度指數(shù)J值范圍為0-1之間，J值越大，種間個(gè)體數(shù)分布越均勻［10］。定植30、60、90和120 d時(shí)，生物熏蒸處理的多樣性指數(shù)H'高于對照處理，表明生物熏蒸可增加土壤線蟲多樣性。多樣性指數(shù)H'在各處理中有先降低再升高的趨勢；在定植60 d時(shí)達(dá)到最小值，表明各處理在定植60 d時(shí)線蟲多樣性最低。生物熏蒸處理豐富度指數(shù)SR低于對照處理，表明生物熏蒸可顯著降低土壤線蟲類群數(shù)量。生物熏蒸處理均勻度指數(shù)J高于對照處理，表明生物熏蒸處理種間個(gè)體數(shù)較CK處理分布均勻（圖5）。

圖5 不同處理土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)Fig. 5 Structure of soil nematode community under different treatments

3 討論

根結(jié)線蟲是一類全球性分布、寄主范圍廣泛、對重要經(jīng)濟(jì)作物造成巨大損失的重要植物寄生線蟲。目前，對根結(jié)線蟲的防治方法主要包括輪作防病、抗線蟲品種的培育、殺線蟲藥劑、物理防治方法及免疫和抗性砧木的使用。但輪作和使用抗性品種存在一定的局限性，長期使用化學(xué)農(nóng)藥帶來了一系列副作用，因此需尋找環(huán)境友好的替代方法防治蔬菜根結(jié)線蟲［4］。生物熏蒸作為一種安全有效手段在防治蔬菜根結(jié)線蟲病中越來越受到重視［3］。本文研究了甘藍(lán)生物熏蒸對蔬菜根結(jié)線蟲的防治效果。結(jié)果顯示土壤生物熏蒸可以較好的防治根結(jié)線蟲對番茄的危害，在定植60和90 d防效分別達(dá)58.6%和45.8%。本研究以蕓薹屬植物甘藍(lán)為生物熏蒸材料，其植物組織中含有大量的硫代葡糖酸脂，該物質(zhì)在腐爛過程中可被自身產(chǎn)生的植物源酶黑芥子酶水解而形成揮發(fā)性和殺生性很強(qiáng)的異硫氰酸脂類物質(zhì)，從而殺死土壤中的線蟲，致使田間初始蟲口密度下降。熏蒸后，膜下溫度可高達(dá)55℃，高溫也對線蟲等有致死作用［4，13］。李世東等［14］研究發(fā)現(xiàn)用甘藍(lán)生物熏蒸處理對土壤中線蟲有明顯的滅殺作用，對番茄根結(jié)線蟲的防治效果可達(dá)48%。曹素芳［15］比較了球莖甘藍(lán)、甘藍(lán)、大白菜、小白菜、芥蘭、油菜和菠菜對南方根結(jié)線蟲的生物熏蒸效果。結(jié)果表明，球莖甘藍(lán)的熏蒸效果最好。紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液和生物熏蒸在防治番茄根結(jié)線蟲具有協(xié)同效應(yīng)，兩者聯(lián)合施用的防效較單獨(dú)生物熏蒸提高近10%。Jin等［16］研究發(fā)現(xiàn)生防菌和生物熏蒸聯(lián)合施用可以通過調(diào)整土壤微生物群落來協(xié)同防治根結(jié)線蟲病，其防治效果高于兩者單獨(dú)施用。

線蟲群落是土壤動(dòng)物中非常有效的指示群體，可用于指示土壤的健康狀況。很多學(xué)者也開始利用土壤線蟲群落來判斷指示用藥的安全性。段玉璽［17］發(fā)現(xiàn)涕滅威可降低大豆田土壤線蟲生物多樣性；陳立杰等［17］研究表明施用生防顆粒劑不僅可以防治土壤中大豆孢囊線蟲和其他植物寄生線蟲，而且提高了非植物寄生線蟲的數(shù)量，改變了土壤生態(tài)區(qū)系，對土壤生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了積極影響。梁文舉［18］研究發(fā)現(xiàn)生防顆粒劑的施用對大豆田土壤線蟲生物多樣性有促進(jìn)作用，而乙草胺和呋喃丹致使土壤線蟲群落受到擾動(dòng)，食物網(wǎng)受到脅迫。本文評價(jià)了甘藍(lán)生物熏蒸對土壤線蟲群落的影響。研究結(jié)果顯示定植60、90和120 d時(shí)甘藍(lán)生物熏蒸處理中的植物寄生類線蟲數(shù)量所占比例分別為50%、47.06%和62.5%，顯著低于對照處理中的83.38%、86.54%和88.11%；定植30、60、90和120 d時(shí)甘藍(lán)生物熏蒸處理中的食真菌類線蟲數(shù)量所占比例分別為8.33%、6%、4%和3%，顯著低于對照處理中的12.5%、7%、5.77%和6.29%。定植30、60、90和120 d時(shí)甘藍(lán)生物熏蒸處理中的食細(xì)菌類線蟲數(shù)量所占比例分別為26.67%、20%、23.53%和18.75%，顯著高于對照處理中的15.63%、7.69%、5.77%和3.5%；定植30、60、90和120 d時(shí)甘藍(lán)生物熏蒸處理中的捕食/雜食類線蟲數(shù)量所占比例分別為31.67%、24%、25.41%和15.75%，顯著低于對照處理中的12.5%、1.92%、1.92%和2.1%。結(jié)果表明甘藍(lán)生物熏蒸可以降低土壤中植物寄生類線蟲和食真菌類線蟲的數(shù)量比例；提高土壤中食細(xì)菌類線蟲和捕食/雜食類線蟲的數(shù)量比例。雜食/捕食類線蟲參與土壤有機(jī)物的分解和養(yǎng)分循環(huán)過程，能夠間接的對植物生長產(chǎn)生有益影響。食細(xì)菌和食真菌線蟲通過取食活動(dòng)刺激土壤的分解作用和氮素礦化作用，進(jìn)而提高了植物對土壤養(yǎng)分的利用率。而植物寄生線蟲的種群數(shù)量增大會(huì)對農(nóng)作物造成危害，但非植物寄生線蟲數(shù)量增長和空間占位將對植物寄生線蟲群體有一定的抑制作用［19］。結(jié)果說明甘藍(lán)生物熏蒸對土壤環(huán)境產(chǎn)生了積極的影響。此外本研究發(fā)現(xiàn)生物熏蒸可以增加土壤線蟲群落的MI指數(shù)，降低PPI指數(shù)和PPI/MI，表明生物熏蒸降低了土壤受到干擾的次數(shù)和強(qiáng)度，對植物寄生線蟲也有一定的抑制作用，增加土壤生態(tài)系統(tǒng)豐富度。由于根結(jié)線蟲長期處于優(yōu)勢地位，其空間占位對自由生活線蟲數(shù)量有一定抑制作用，所以空白對照CK處理PPI/MI值較高。而生物熏蒸使得根結(jié)線蟲密度顯著下降，所以PPI/MI值降低，即生物熏蒸減小土壤生態(tài)系統(tǒng)所受到的擾動(dòng)，對環(huán)境健康起到了作用。

本研究中多樣性指數(shù)H'在1左右，豐富度指數(shù)SR均低于1，遠(yuǎn)低于陳瑤對北京地區(qū)栽培感病作物的保護(hù)地所調(diào)查得到的H'平均值1.50和SR平均值2.42［20］。兩項(xiàng)指標(biāo)較小，表明供試溫室土壤多樣性較低。陳瑤研究不同復(fù)種對土壤線蟲群落的影響，不同作物對土壤線蟲群落產(chǎn)生不同的影響，幾種作物復(fù)種之后土壤線蟲多樣性較大。而本研究供試溫室連續(xù)7季種植相同作物，相同的農(nóng)藝措施使得土壤線蟲種類變少，優(yōu)勢種群趨向一致，且植物寄生線蟲的空間占位對非植物寄生線蟲數(shù)量增長有一定抑制作用，所以溫室土壤多樣性嚴(yán)重降低。

4 結(jié)論

甘藍(lán)熏蒸可以較好的防治蔬菜根結(jié)線蟲，且對土壤線蟲群落安全，與其他措施如生物殺線劑配合在防治蔬菜根結(jié)線蟲中具有巨大潛力。