張潔 夏明聰 朱文倩 梁娟 孫潤紅 徐文 武超 楊麗榮

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 河南省生物農(nóng)藥工程研究中心 河南省作物保護(hù)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

根結(jié)線蟲（Meloidogynesp.）是一種世界性分布的植物寄生線蟲［1］，能夠侵染超過3 000多種植物，包括多種大田作物、陸地蔬菜、樹木及園林花卉等［2］，每年給世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，生產(chǎn)上亟需安全有效的防控方法［3-5］。化學(xué)農(nóng)藥對人畜和生態(tài)環(huán)境造成的危害越來越嚴(yán)重，對化學(xué)農(nóng)藥的使用限制也越來越嚴(yán)格［6］。為推進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展方式轉(zhuǎn)變，有效控制農(nóng)藥使用量，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出了農(nóng)藥使用量零增長的目標(biāo)。生防微生物對生態(tài)環(huán)境安全友好，具有增產(chǎn)防病的長期效果，符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和綠色植保理念的需求，是保障現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)的重要手段［7-9］，也是實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥“減施增效”的有效途徑。

芽胞桿菌（Bacillussp.）具有高效多功能、抗逆性強(qiáng)、親和性好等特點(diǎn)，是一類重要的植物病害生防資源［10］。目前，芽胞桿菌對植物寄生線蟲的生物防治已受到廣泛研究［11］。Xiang等［12］等測定了662株植物根際促生細(xì)菌對南方根結(jié)線蟲（M. incognita）二齡幼蟲的致死活性，結(jié)果顯示Bacillussp.對二齡線蟲比其他屬的細(xì)菌表現(xiàn)出更高的致死率。史鳳玉等［13］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）和巨大芽胞桿菌（B. megaterium）的胞外分泌物具有強(qiáng)烈的殺線蟲活性。Gao等［14］報道蠟質(zhì)芽胞桿菌（B. cereus）S2發(fā)酵液中鞘氨醇的對秀麗桿線蟲和南方根結(jié)線蟲具有較強(qiáng)的致死活性。但是目前被開發(fā)成殺線蟲商品制劑的芽胞桿菌菌株較少，只有堅強(qiáng)芽胞桿菌（B. firmus）等被開發(fā)成產(chǎn)品并運(yùn)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中［6，15］，大大限制了線蟲生防菌的應(yīng)用和推廣。因此，亟需挖掘?qū)κ卟烁Y(jié)線蟲具有生物活性的優(yōu)良芽胞桿菌菌株，為高效生物殺線劑的開發(fā)提供依據(jù)。

自然衰退現(xiàn)象在植物線蟲病害中普遍發(fā)生，有學(xué)者將病害癥狀逐漸減輕或消失的土壤稱為抑制性土壤［16］。目前主要認(rèn)為土壤中的微生物是引起植物寄生線蟲病抑制性土壤的主要因子，也是引起線蟲病害自然衰退的主要原因［17］。研究表明，在植物寄生線蟲的衰退土壤中有很多線蟲的天敵，但是用福爾馬林等藥劑處理后，天敵受到滅殺或抑制，線蟲病害反而加重發(fā)生［18］。因此，利用植物寄生線蟲的自然衰退現(xiàn)象從土壤中尋找線蟲的天敵，為防控植物寄生線蟲病害提供了一條新思路。本研究從根結(jié)線蟲病的抑制性土壤中分離和篩選芽胞桿菌，并初步研究優(yōu)良菌株的生防機(jī)理，以期為蔬菜根結(jié)線蟲病的綠色防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤及根結(jié)線蟲 在開封市祥符區(qū)鄢陵府根結(jié)線蟲病逐漸減輕的蔬菜大棚中采集抑制性土壤用于分離芽胞桿菌，在嚴(yán)重發(fā)生根結(jié)線蟲病的茄科蔬菜大棚中采集發(fā)病根結(jié)分離卵囊用于生物活性測定，病原線蟲經(jīng)鑒定為南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂15 g/L，pH 7.2；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：牛肉膏3 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 7.2。

1.1.3 供試番茄品種 中雜9號，購于中蔬種業(yè)科技有限公司。

1.1.4 供試試劑 總糖含量測定試劑盒（ZT-2-Y），考馬斯亮藍(lán)法蛋白含量測試盒（KMSP-1-W），過氧化氫酶試劑盒（CAT-1-Y），乙酰膽堿酯酶測試盒（ACHE-1-W），羧酸酯酶測試盒（CARE-1-W），購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生防菌株的分離和純化 將采集到的8份根圍土壤樣品過篩后80℃水浴10 min，經(jīng)梯度稀釋后涂布于NA平板中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3 d后，挑取NA平板上形態(tài)不同的單菌落進(jìn)一步劃線純化，將純化后的細(xì)菌單菌落4℃保藏于NA斜面培養(yǎng)基。

1.2.2 生防細(xì)菌的初篩 將分離得到的菌株接種于NB培養(yǎng)基，28℃、160 r/min培養(yǎng)48 h 后，10 000 r/min離心5 min，用0.22 μm的微孔濾膜濾除菌體，得發(fā)酵濾液。將發(fā)病根結(jié)剪成小片段，用1%次氯酸鈉消毒2 min，用玻璃棒拍打收集卵粒，經(jīng)沖洗與離心制備2 000 粒/mL的卵粒懸浮液，將卵粒置于25℃的恒溫箱中孵化3-7 d后收集2齡幼蟲，經(jīng)沖洗與離心制備2 000條/mL的線蟲懸浮液。向200 μL菌株發(fā)酵濾液中加入 50 μL線蟲懸浮液，以空白液體培養(yǎng)基為對照，置于25℃培養(yǎng)箱中，48 h后通過滴加4% NaOH溶液判斷線蟲的死活［19］，計算線蟲死亡率和校正死亡率［20］，每處理6次重復(fù)。向200 μL菌株發(fā)酵濾液加入50 μL卵懸浮液，以空白液體培養(yǎng)基為對照，25℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d后調(diào)查各處理中孵化出的二齡幼蟲的數(shù)量，計算孵化率和卵孵化抑制率［20］，每處理6次重復(fù)。

1.2.3 室內(nèi)盆栽防效測定 利用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)測定初篩得到的4株芽胞桿菌對南方根結(jié)線蟲的防治效果，具體方法如下：將不同細(xì)菌菌株接種于NB液體培養(yǎng)基，30℃，150 r/min培養(yǎng)至OD600nm值為0.8-1.0得細(xì)菌發(fā)酵液。盆栽試驗(yàn)設(shè)置6個處理：（1）NB-04 10 mL/株灌根；（2）NB-36 10 mL/株灌根處理；（3）NB-12 10 mL/株灌根；（4）NB-18 10 mL/株灌根；（5）0.5%阿維菌素顆粒劑2 g/株穴施；（6）空白對照。每盆移栽1株番茄苗，每處理12個重復(fù)，澆透水后放在25℃人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，番茄移栽一周后接種根結(jié)線蟲，在距離番茄根2 cm的無菌土中對稱打2個1 cm深的小孔，注入線蟲懸液，每株接種1 000條。移栽40 d后，根據(jù)分級標(biāo)準(zhǔn)［21］進(jìn)行病情調(diào)查，計算根結(jié)指數(shù)和防治效果［22］，同時調(diào)查番茄的株高及鮮重。

1.2.4 菌株鑒定 將篩選所得菌株劃線接種于NA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)16 h后，利用掃描電鏡觀察其菌體大小、形狀及其排列方式，30℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行革蘭氏染色，觀察其是否產(chǎn)生芽胞及芽胞位置。利用細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取NB-04菌株的基因組DNA，采用16S通用引物比對分析，并利用Mega 8.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 NB-04菌株生防機(jī)理初步研究 在體視鏡下從發(fā)病根結(jié)中挑取卵囊，用1%次氯酸鈉表面消毒1 min后，用無菌水沖洗3次備用。將NB-04菌株接種于NB培養(yǎng)基，28℃，160 r/min培養(yǎng)48 h后，10 000 r/min離心5 min，用0.22 μm的微孔濾膜濾除菌體，得NB-04發(fā)酵濾液。取飽滿且大小一致的50粒卵囊放入1.5 mL離心管中，每管加入500 μL NB-04發(fā)酵濾液，以加入無菌LB培養(yǎng)基為對照，密封置于25℃培養(yǎng)箱中，在24、48、72 和96 h后加入1 mL緩沖液（pH 6. 0），在冰浴中充分勻漿后，4℃，10 000 r/min下離心10 min，取上清液作為酶源，根據(jù)相關(guān)試劑盒說明書分別測定NB-04發(fā)酵濾液對根結(jié)線蟲卵囊過氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶活性的影響，每處理重復(fù)3次。同時測定NB-04發(fā)酵濾液處理對根結(jié)線蟲卵囊總糖和總蛋白含量的影響，具體方法如下：各處理取飽滿且大小一致的50粒卵囊放入1.5 mL離心管中，每管加入500 μL NB-04發(fā)酵濾液，以加入等量的無菌LB培養(yǎng)基為對照，密封置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照說明書要求測定卵囊總糖和總蛋白的含量，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 根圍土壤芽胞桿菌的分離與篩選

從土壤樣品中共分離到62株芽胞細(xì)菌，其中，發(fā)酵濾液對二齡幼蟲校正死亡率高于35%的菌株共有16株，占分離總數(shù)的25.8%（表1）。NB-04菌株發(fā)酵液處理48 h后校正死亡率達(dá)84.9%，NB-36、NB-18、NB-21、NB-12等菌株發(fā)酵濾液對二齡線蟲的校正死亡率也都超過70%，分別為75.1%、72.4%、72.1%和70.5%。同時測定這些菌株對卵孵化的影響，結(jié)果顯示，NB-36菌株處理的卵孵化率最低，為12.0%，卵孵化抑制率達(dá)到81.1%，其次為NB-12菌株、NB-04菌株、NB-31菌株和NB-11菌株處理，卵孵化抑制率分別達(dá)到78.7%、78.6%、76.7%和76.2%。

表1 不同細(xì)菌發(fā)酵濾液對根結(jié)線蟲二齡幼蟲的死亡率和卵孵化率的影響Table 1 Effects of the bacterial fermentation filtrates on the mortality and egg hatch rates of M. incognita J2

2.2 室內(nèi)盆栽防效測定

從表2可以看出，4株芽胞桿菌中，NB-04菌液灌根處理的根結(jié)指數(shù)最低，為31.1，防治效果最好，達(dá)到61.6%，接近阿維菌素的防治效果（69.2%），同時顯著增加了番茄的株高和鮮重。此外，NB-36和NB-12菌液灌根處理的防治效果也都超過50%，分別為57.2%和50.1%。由此可見，NB-04具有較好的生防潛力。

表2 不同生防菌株對南方根結(jié)線蟲的盆栽防治效果及番茄植株生長的影響Table 2 Pot control effects of biocontrol strains against M. incognita and their influences on tomato plant growth

2.3 菌株鑒定

菌株NB-04在NA培養(yǎng)基上菌落為乳白色不透明，表面粗糙，邊緣不規(guī)則（圖1-A），掃描電鏡結(jié)果顯示NB-04菌體呈短桿狀，大小為2.21 μm×0.58 μm（圖1-B）；革蘭氏染色陽性，孢中生至近頂生，大小為1.64 μm×0.72 μm（圖1-C）。16S 序列分析結(jié)果表明，菌株NB-04的16S序列與甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌的16S序列的同源性達(dá)99%；基于16S基因，采用鄰接法構(gòu)建菌株NB-04及其相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明（圖2），NB-04菌株與甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將NB-04菌株鑒定為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌（B.methylotrophicus）。

圖1 NB-04的形態(tài)學(xué)特征 Fig. 1 Mophological characteristics of NB-04

圖2 NB-04菌株基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain NB-04 based on 16S rDNA gene sequence

2.4 NB-04菌株發(fā)酵濾液對根結(jié)線蟲卵囊酶活性的影響

2.4.1 對根結(jié)線蟲卵囊過氧化氫酶活性的影響 NB-04發(fā)酵濾液處理24 h后，根結(jié)線蟲卵囊過氧化氫酶活性略高于LB培養(yǎng)基對照，隨著處理時間延長過氧化氫酶活性逐漸降低，對照組根結(jié)線蟲卵囊過氧化氫酶活性逐漸升高（圖3）。與對照組相比，96 h后NB-04發(fā)酵濾液對卵囊過氧化氫酶活性降低46.4%，說明NB-04菌株發(fā)酵濾液能夠有效降低根結(jié)線蟲卵粒內(nèi)過氧化氫酶活性。

圖3 NB-04菌株發(fā)酵液對根結(jié)線蟲卵囊過氧化氫酶活性的影響Fig. 3 Effects of NB-04 fermentation filtrates on the catalase activities of M. incognita egg masses

2.4.2 對根結(jié)線蟲卵囊羧酸酯酶活性的影響 NB-04發(fā)酵濾液處理后卵囊羧酸酯酶活性具有先升高后降低的趨勢，48 h比24 h活性上升0.27 nmol/mg，表現(xiàn)為激活作用，隨后逐漸降低，而且NB-04發(fā)酵濾液處理后卵囊羧酸酯酶活性始終低于對照處理（圖4），96 h后NB-04發(fā)酵濾液處理羧酸酯酶活性比對照降低89.1%。對照中卵囊羧酸酯酶活性逐漸增高，這可能與卵自身發(fā)育、孵化引起的酶活性變化有關(guān)。

圖4 NB-04菌株發(fā)酵液對根結(jié)線蟲卵囊羧酸酯酶活性的 影響Fig. 4 Effects of NB-04 fermentation filtrates on the carboxylesterase activities of M. incognita egg masses

2.4.3 對根結(jié)線蟲卵囊乙酰膽堿酯酶活性的影響 對照中乙酰膽堿酯酶活性逐漸降低，而NB-04發(fā)酵濾液處理具有先增高后降低的趨勢，但是始終低于同時期的對照（圖5）。96 h后NB-04發(fā)酵濾液處理乙酰膽堿酯酶的活性比對照降低52.8%，說明NB-04菌株發(fā)酵濾液能夠顯著降低根結(jié)線蟲卵囊乙酰膽堿酯酶活性。

圖5 NB-04菌株發(fā)酵液對根結(jié)線蟲卵囊乙酰膽堿酯酶活性的影響Fig. 5 Effects of NB-04 fermentation filtrates on the acetylcholinesterase activities of of M. incognita egg masses

2.4.4 對根結(jié)線蟲卵囊總糖和總蛋白含量的影響 NB-04發(fā)酵濾液處理24 h后，根結(jié)線蟲卵囊總糖量為9.6 μg/μL，對照組根結(jié)線蟲卵囊總糖量為13.2 μg/μL，比對照顯著降低降低27.3%，說明NB-04菌株發(fā)酵濾液處理能夠顯著降低根結(jié)線蟲卵囊的總糖量。NB-04發(fā)酵濾液處理24 h后，根結(jié)線蟲卵囊總蛋白量為26.6 μg/μL，而對照總蛋白量為54.8 μg/μL，約為處理組總蛋白含量的2倍，二者差異顯著，表明NB-04菌株發(fā)酵濾液處理能夠顯著降低根結(jié)線蟲卵囊的總蛋白量（圖6）。

圖6 NB-04菌株發(fā)酵液對根結(jié)線蟲卵囊總糖（A）和總蛋白（B）含量的影響Fig. 6 Effects of NB-04 fermention on the content of total sugar（A）and protein（B）of of M. incognita eggs

3 討論

分離和篩選安全高效的生防菌株是蔬菜根結(jié)線蟲病生物防治及生防制劑開發(fā)的基礎(chǔ)［6］。為挖掘蔬菜根結(jié)線蟲病的優(yōu)良生防菌株，本研究從蔬菜根結(jié)線蟲病的抑制性土壤中分離芽胞桿菌，通過室內(nèi)離體測定和盆栽試驗(yàn)篩選生防菌，獲得高效生防菌株NB-04，并進(jìn)一步將其鑒定為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌（B. methylotrophicus），豐富了根結(jié)線蟲的生防資源。

甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌是一種與枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌親緣性很高的細(xì)菌［23］，其中枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌目前已被廣泛用于線蟲病害的生物防治中［24］，但是目前甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌防治根結(jié)線蟲的報道較少。Zhou等［25］報道甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌R2-2菌株對南方根結(jié)線蟲具有較強(qiáng)的拮抗活性，其菌液蘸根和種子處理均能夠降低番茄根結(jié)線蟲病的發(fā)生，防治效果分別達(dá)61.0%和40.0%。本研究中甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌NB-04菌液灌根處理對番茄根結(jié)線蟲病的室內(nèi)防治效果達(dá)61.6%，接近阿維菌素的防治效果，同時顯著增加了番茄的株高和鮮重，表現(xiàn)出較好的生防潛力，下一步將驗(yàn)證該菌株對根結(jié)線蟲病的田間防治效果，為該菌株的開發(fā)利用提供依據(jù)

此外，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌已被報道用于其他真菌病害的生物防治中，Ge等［26］從吉林長白山休眠火山土中分離到一株甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌（B. methylotrophicus），能夠抑制多種植物病原菌的生長及孢子萌發(fā)，在室內(nèi)盆栽試驗(yàn)中對番茄灰霉病的防治效果達(dá)60%，并能顯著促進(jìn)番茄植株的生長。Radhakrishnan等［27］報道芝麻葉面噴施甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌KE2菌株能夠顯著促進(jìn)芝麻生長并增強(qiáng)其逆境代謝，從而改善芝麻植株的健康狀況。甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌NB-04菌株對蔬菜真菌性病害的生防潛力有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌NB-04發(fā)酵濾液能夠顯著降低南方根結(jié)線蟲卵囊的過氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的活性。過氧化氫酶是一種重要的抗氧化保護(hù)性酶，推測NB-04發(fā)酵濾液脅迫線蟲的抗氧化保護(hù)酶長時間抑制在正常水平之下，從而導(dǎo)致線蟲機(jī)體的損傷或死亡。此外，羧酸酯酶是許多殺蟲劑的重要代謝酶，乙酰膽堿酯酶是有機(jī)磷和氨基甲酸脂類藥劑的靶標(biāo)酶［28］，因此NB-04菌株發(fā)酵液誘導(dǎo)的線蟲解毒酶和靶標(biāo)酶與殺蟲劑可能是相同的。此外，本研究發(fā)現(xiàn)NB-04發(fā)酵濾液能夠顯著降低線蟲卵囊的總糖和總蛋白含量。總糖和蛋白質(zhì)是線蟲維持生命和生長發(fā)育的重要營養(yǎng)物質(zhì)，其中糖作為線蟲化學(xué)感受器的重要組成部分影響著線蟲的趨向性，蛋白質(zhì)作為線蟲體表角質(zhì)層的主要成分有助于線蟲抵御外界不良環(huán)境［29］，因此，NB-04菌株的發(fā)酵濾液還可能通過破壞線蟲糖和蛋白質(zhì)的代謝活動而殺死線蟲。下一步可以考慮將NB-04菌株與植物農(nóng)藥、有機(jī)肥、生物熏蒸、陽光消毒等結(jié)合使用，以提高其對線蟲的防治效果。

4 結(jié)論

從蔬菜根結(jié)線蟲病的抑制性土壤中分離芽胞桿菌，并利用室內(nèi)離體測定和盆栽試驗(yàn)篩選獲得高效生防菌株NB-04，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征將其鑒定為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌（B. methylotrophicus）。初步研究了NB-04菌株對根結(jié)線蟲的生防機(jī)理，結(jié)果顯示NB-04菌株發(fā)酵濾液能夠顯著降低根結(jié)線蟲卵囊過氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的活性以及卵囊總糖和總蛋白含量，為蔬菜根結(jié)線蟲病的綠色防治提供依據(jù)。