楊 彥 潘志蘭 張志敏

多發(fā)性骨髓瘤是臨床上一種難治性惡性腫瘤，該疾病主要是由于骨髓克隆性漿細(xì)胞惡性增生同時(shí)單克隆免疫球蛋白增加所致[1,2]，是血液系統(tǒng)中第三大惡性腫瘤，其發(fā)病率在血液系統(tǒng)惡性疾病中僅次于淋巴瘤，常見(jiàn)于老年人，具有發(fā)病率高、預(yù)后差、死亡率高等特點(diǎn)。多發(fā)性骨髓瘤的主要臨床特征為骨痛、骨損害、貧血、反復(fù)感染等[3，4]。患者早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，不易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者就診時(shí)病情較嚴(yán)重，對(duì)治療及預(yù)后造成嚴(yán)重影響。目前，對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的研究以探究其發(fā)病機(jī)制、提高治療效果、改善患者預(yù)后為主[5]。隨著研究的不斷深入及醫(yī)療科技水平的不斷提高，免疫抑制劑、蛋白酶抑制劑、自體干細(xì)胞移植等的應(yīng)用治療多發(fā)性骨髓瘤，大大改善了患者預(yù)后，使患者的中位生存時(shí)間從3年增加到6年左右，但患者仍會(huì)復(fù)發(fā)，如何治愈多發(fā)性骨髓瘤仍是醫(yī)學(xué)者需要克服的重要難題，尋找該疾病的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，并探究其與患者預(yù)后的關(guān)系已成為目前臨床研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。

細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)和細(xì)胞周期素D3(Cyclin D3)是細(xì)胞周期素G家族的重要成員，在促進(jìn)細(xì)胞增殖、加速細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變等過(guò)程具有重要作用[6，7]。p21是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子，相關(guān)研究顯示p21的異常表達(dá)可影響細(xì)胞的增殖、分化及腫瘤的發(fā)生[8]。有研究顯示，Cyclin D1、D3、p21與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生密切相關(guān)?；诖耍狙芯繑M通過(guò)檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中Cyclin D1、D3、p21的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系，為臨床治療多發(fā)性骨髓瘤提供有價(jià)值的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象和分組

選取2015-07—2016-12本院收治的多發(fā)性骨髓瘤患者80例為多發(fā)性骨髓瘤組，其中，男性46例，女性34例，年齡49-68歲。同期選取在本院就診患有營(yíng)養(yǎng)性貧血者20例為對(duì)照組，其中，男14例，女6例，年齡48-68歲。多發(fā)性骨髓瘤組與貧血對(duì)照組間性別、年齡等比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)(批號(hào)：20140725)，所有樣品采集均取得患者及家屬知情并簽署同意書，且符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

多發(fā)性骨髓瘤組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2013年制定的《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南》中有關(guān)多發(fā)性骨髓瘤的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)患者及家屬選擇在本院接受治療者；(3)入院前未進(jìn)行放化療治療者；(4)自愿加入本研究者；(5)臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有系統(tǒng)性疾病者；(2)患有其它惡性腫瘤及癌癥者；(3)患有嚴(yán)重內(nèi)分泌疾病者；(4)嚴(yán)重精神疾病不配合治療者。

1.3 主要試劑與儀器

總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：RM102)購(gòu)自于蘭州美伯生物醫(yī)藥科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：KL266)購(gòu)自于上?？道噬锟萍加邢薰荆桓饕镉杀本└侍娘w華生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；本研究中其它化學(xué)藥品均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。離心機(jī)(型號(hào)：JIDI-21D)購(gòu)自于廣州吉迪儀器有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(貨號(hào)：V115896)購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 樣品采集及處理：在無(wú)菌條件下對(duì)所有受試者進(jìn)行骨髓液(5ml)采集，然后肝素抗凝，離心后收集骨髓單個(gè)核細(xì)胞，置于-70℃冰箱中保存待測(cè)。

1.4.2 骨髓中Cyclin D1 mRNA、Cyclin D3 mRNA、p21 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)各組研究對(duì)象骨髓中Cyclin D1、Cyclin D3、p21 mRNA表達(dá)水平。擴(kuò)增體系為10μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃15s，65℃1min，70℃延伸40s，行35個(gè)循環(huán)。各引物序列見(jiàn)表1。采用2-△△Ct法計(jì)算骨髓中Cyclin D1、Cyclin D3、p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 免疫組化染色：采用免疫組化法檢測(cè)各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞Cyclin D1、Cyclin D3、p21蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況。染色結(jié)束后隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行病理切片觀察，并統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，陽(yáng)性細(xì)胞比例分成5個(gè)等級(jí)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，0分；1%-24%，1分；25%-49%，2分；50%-74%，3分；75%-100%，4分。染色強(qiáng)度判斷：無(wú)染色為0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。兩項(xiàng)得分相乘：0-6分為陰性，6分以上為陽(yáng)性。

1.5 隨訪

對(duì)本研究中涉及到的所有多發(fā)性骨髓瘤患者治療出院后進(jìn)行為期3年的門診復(fù)查或電話隨訪，末次隨訪時(shí)間為2019-12-30，死亡患者以死亡時(shí)間作為隨訪截止期，并做好記錄，本次研究中未出現(xiàn)失訪病例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組骨髓中Cyclin D1、D3、p21 mRNA表達(dá)水平比較

多發(fā)性骨髓瘤組Cyclin D1、D3 mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；p21 mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組骨髓中Cyclin D1、D3、p21mRNA表達(dá)水平比較

2.2 兩組骨髓中Cyclin D1、D3、p21蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較

多發(fā)性骨髓瘤組Cyclin D1、D3陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；p21陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 兩組骨髓Cyclin D1、D3、p21蛋白陽(yáng)性率比較

2.3 骨髓中Cyclin D1、D3、p21表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

本次80例多發(fā)性骨髓瘤患者隨訪時(shí)間3年，生存41例，總生存率51.2%。以Cyclin D1、D3、p21 mRNA各自表達(dá)水平的平均值(1.57、0.66、1.29)分別將多發(fā)性骨髓瘤患者分為高表達(dá)組(高于平均值)和低表達(dá)組(低于平均值)。繪制多發(fā)性骨髓瘤患者治療后1—36個(gè)月高、低表達(dá)組的生存曲線。Cyclin D1高表達(dá)組術(shù)后3年總生存率低于Cyclin D1低表達(dá)組(χ2=5.031，P<0.05)；Cyclin D3高表達(dá)組術(shù)后3年總生存率低于Cyclin D3低表達(dá)組(χ2=7.336，P<0.05)；p21高表達(dá)組術(shù)后3年總生存率高于p21低表達(dá)組(χ2=11.361，P<0.01)。見(jiàn)圖1、2、3和表4。

表4 不同Cyclin D1、D3、p21表達(dá)水平患者生存率比較

圖1 不同水平Cyclin D1多發(fā)性骨髓瘤患者3年生存曲線分析

2.4 影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的因素分析

單因素分析顯示，Cyclin D1、D3、p21表達(dá)水平是影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素分析顯示，Cyclin D1、D3高表達(dá)和p21低表達(dá)是影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.884，95%CI為1.714-4.853；HR=2.575，95%CI為1.266-5.239；HR=2.979，95%CI為1.671-5.312；P均<0.05)。詳見(jiàn)表5。

圖2 不同水平Cyclin D3多發(fā)性骨髓瘤患者3年生存曲線分析

圖3 不同水平p21多發(fā)性骨髓瘤患者3年生存曲線分析

表5 影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的因素分析

3 討 論

Cyclin D是細(xì)胞周期的正性調(diào)控因子，其可通過(guò)激活相關(guān)酶的活性改變細(xì)胞周期[10]。Cyclin D1、D3是Cyclin D的兩個(gè)重要成員，在參與DNA合成、促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變及導(dǎo)致細(xì)胞癌變中發(fā)揮重要作用[11]。任婧婧等[12]研究發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)RNA干擾Cyclin D1蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的凋亡。王卓[13]研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D3可作為曲妥珠單抗治療乳腺癌的有效蛋白標(biāo)記物。Rasmussen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在42%(46/110)的多發(fā)性骨髓瘤樣本中檢測(cè)到Cyclin D1，且Cyclin D1 mRNA在多發(fā)性骨髓瘤患者中呈高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，多發(fā)性骨髓瘤組Cyclin D1、D3 mRNA表達(dá)水平及蛋白陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，提示Cyclin D1、D3可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化，進(jìn)而參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展。

p21是一種細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白，位于P53基因下游第6號(hào)染色體上，相對(duì)分子質(zhì)量為21 kDa[15]。大量研究已證實(shí)，p21與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。張軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，p21在卵巢漿液性腺癌患者中表達(dá)降低，且其表達(dá)水平與患者預(yù)后密切相關(guān)。Yao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白脫乙酰激酶抑制劑可通過(guò)靶向p21基因，促進(jìn)p21表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡。Dhyani等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ANKHD1可通過(guò)下調(diào)p21啟動(dòng)子的活性，進(jìn)而促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤組p21 mRNA表達(dá)水平及蛋白陽(yáng)性率顯著低于對(duì)照組，提示p21可能受ANKHD1抑制，進(jìn)而導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展。生存曲線分析表明，Cyclin D1、D3高表達(dá)組術(shù)后3年總生存率低于Cyclin D1、D3低表達(dá)組，p21高表達(dá)組術(shù)后3年總生存率高于p21低表達(dá)組，提示Cyclin D1、D3、p21表達(dá)水平可為多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的預(yù)測(cè)提供參考。Cox多因素分析顯示，Cyclin D1、D3高表達(dá)和p21低表達(dá)是影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示降低Cyclin D1、D3表達(dá)和升高p21表達(dá)可能有助于緩解多發(fā)性骨髓瘤病情的發(fā)展，有利于患者預(yù)后。

綜上所述，Cyclin D1、D3在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)明顯升高，p21的表達(dá)水平降低，三者水平均與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示Cyclin D1、D3、p21可能作為多發(fā)性骨髓瘤的病情評(píng)估及不良預(yù)后預(yù)測(cè)的的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

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