李中華 綜述 趙自剛審校

細(xì)胞自噬(Autophagy)廣泛發(fā)生于真核細(xì)胞，是一種將細(xì)胞質(zhì)成分、受損細(xì)胞器或感染因子運輸?shù)饺苊阁w進行降解的高度保守的分解代謝過程。當(dāng)機體發(fā)生饑餓、生長因子缺乏或高能量需求時，自噬激活可以補充代謝所需能量，以及應(yīng)對多種應(yīng)激如缺氧、感染等[1, 2]?；A(chǔ)水平的自噬，通過清除應(yīng)激、衰老和疾病過程中產(chǎn)生的多泛素化蛋白聚集體，降解入侵病原體，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放并參與抗原提呈和淋巴細(xì)胞發(fā)育，有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[3]。腸缺血常繼發(fā)于小腸移植和腹主動脈瘤等手術(shù)過程中，也是失血性休克、感染性休克等危重病理過程引起腸道應(yīng)激性缺血、恢復(fù)再灌的常見病理生理過程。及時恢復(fù)腸道血液灌注，避免腸缺血性損傷、腸屏障功能障礙和腸源性細(xì)菌、內(nèi)毒素移位，對防止全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)、遠隔器官功能障礙與結(jié)構(gòu)損傷，甚至多器官功能障礙綜合征或多器官衰竭的發(fā)生至關(guān)重要。近年來，自噬在腸缺血性損傷中的作用日益受到關(guān)注，但具體作用仍存在爭議。有研究報道自噬激活有助于減輕腸缺血性損傷，但也有研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬有助于減輕腸黏膜屏障損傷[4, 5]。靶向自噬可能成為防治腸缺血性損傷的一種有效策略。

1 自噬在維持腸道穩(wěn)態(tài)中的作用

1.1 自噬方式與過程

根據(jù)運輸方式和生理功能，自噬主要分為三種：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，其中巨自噬即為我們通常所說的自噬，它是一種通過雙層膜結(jié)合囊泡(即自噬體)吞噬待降解物質(zhì)后，與溶酶體融合降解的方式[6]。自噬一般包括啟動、成核、伸長、融合和降解等環(huán)節(jié)，主要受自噬相關(guān)基因(Autophagy-related Gene，ATG)的調(diào)節(jié)。自噬的啟動由unc-51樣激酶1(Unc-51 Like Kinase 1，ULK1)復(fù)合物[由ULK1、ATG13、200kDa的家族相互作用蛋白(Family Interacting Protein of 200kDa, FIP200)和ATG101等構(gòu)成]激活。成核和伸長則由ULK1復(fù)合物誘導(dǎo)III類磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase，PI3K)復(fù)合物(由Beclin1、ATG14、液泡蛋白分選蛋白[Vacuolar Sorting Protein，Vps)15、Vps34、III類PI3K等組成]完成[7]，III 類 PI3K將磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3-磷酸(Phosphatidylinositol 3-Phosphate，PI3P)，PI3P招募下游自噬相關(guān)蛋白進行膜的伸長；隨后ATG5-ATG12-ATG16L1復(fù)合物以及ATG7和ATG3誘導(dǎo)微管相關(guān)蛋白輕鏈3(Microtubule-associated Protein Light Chain 3，LC3)由可溶解形式(LC3-I)轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄问?LC3-II)，LC3-II與自噬泡的內(nèi)膜和外膜結(jié)合成自噬體。之后的融合與降解過程為自噬體在Ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白7(Ras-related In Brain 7， Rab7)、突觸結(jié)合蛋白17(Synaptotagmin-17，syt-17)、膜泡關(guān)聯(lián)膜蛋白8(Vesicle Associated Membrane Protein-8，VAMP8)和溶酶體相關(guān)膜蛋白2(Lysosomal Associated Membrane Protein 2, LAMP2)等的介導(dǎo)下，與溶酶體融合成自噬溶酶體，分泌溶酶體酸性水解酶，降解其內(nèi)容物并釋放到細(xì)胞質(zhì)中，完成自噬[8]。

1.2 腸黏膜屏障和自噬

腸黏膜屏障由黏液層、腸上皮細(xì)胞(Intestinal Epithelial Cells，IECs)以及黏膜下炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞層所構(gòu)成，其動態(tài)平衡對于腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。黏液層包含多種蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類物質(zhì)，其作用是避免上皮細(xì)胞直接接觸腸道微生物。黏膜下層的炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，可通過胞吞、抗原呈遞、分泌細(xì)胞因子等方式觸發(fā)自我防御，抵抗病原體入侵。IECs是由位于腸道黏膜Lieberkühn隱窩的腸道干細(xì)胞(Intestinal Stem Cells，ISCs)逐步分化而來，包括吸收性腸細(xì)胞和各種類型的分泌細(xì)胞如Paneth細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等。生理狀態(tài)下IECs增殖與凋亡趨于平衡，以維持腸黏膜屏障的完整性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，正常發(fā)揮營養(yǎng)吸收和分泌黏液及功能蛋白的作用。研究表明，自噬可調(diào)控IECs的發(fā)育，進而調(diào)節(jié)其數(shù)量[9]。自噬在ISCs中呈區(qū)域限制性分布，一般在黏膜中含有增殖性的前體細(xì)胞或干細(xì)胞區(qū)域，且與ISCs存活相關(guān)。自噬缺陷的ISCs在衰老過程中更易發(fā)生DNA損傷、細(xì)胞周期阻滯和凋亡，使其數(shù)量顯著減少[10, 11]。

吸收性腸細(xì)胞具有運輸水、營養(yǎng)物質(zhì)和離子、抵御病原體侵入和有毒物質(zhì)泄漏、調(diào)節(jié)共生微生物群豐度和免疫反應(yīng)等作用。腸細(xì)胞的自噬激活可有效抑制大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、糞腸球菌和福氏志賀菌等的復(fù)制、侵襲和播散；還可以通過靶向降解腸細(xì)胞間緊密連接(Tight Junction，TJ)的孔隙通道蛋白Claudin-2，使細(xì)胞旁通透降低，從而增強腸細(xì)胞間TJ屏障功能。但有研究發(fā)現(xiàn)腸細(xì)胞的自噬激活可能降低跨上皮細(xì)胞電阻，使細(xì)胞旁通透性增強，并破壞閉鎖小帶蛋白1(Zonula Occludens-1，ZO-1)和閉鎖蛋白(Occludin)，降低腸屏障功能[12]；還有研究報道鼠傷寒沙門菌可能利用自噬來促進其在細(xì)胞內(nèi)增殖[13]，反映出自噬在吸收性腸細(xì)胞的作用存在爭議，需進一步深入驗證。

具有分泌功能的Paneth細(xì)胞能夠儲存并分泌抗微生物肽(Antimicrobial Peptides，AMP)如溶菌酶、防御素、抗菌肽及隱蛋白等，用于生產(chǎn)抗菌材料，保護并增強ISCs功能。自噬是Paneth細(xì)胞發(fā)揮上述功能的重要調(diào)節(jié)因子，主要參與并調(diào)節(jié)Paneth細(xì)胞分泌顆粒的形成及功能。自噬受損可能導(dǎo)致AMP減少，引起腸道生態(tài)失調(diào)，自噬相關(guān)基因ATG16L1、ATG4B、ATG5、ATG7缺失會導(dǎo)致Paneth細(xì)胞相關(guān)功能的喪失[14]。Paneth細(xì)胞一系列分泌途徑中，分泌性自噬途徑可以抵御入侵細(xì)菌，因其在Paneth細(xì)胞分泌溶菌酶過程中起重要作用[15]。

杯狀細(xì)胞也是一種分泌細(xì)胞，可產(chǎn)生多種黏蛋白如Muc2、Muc5AC和Muc6等，這些黏蛋白經(jīng)過交聯(lián)形成腸黏膜屏障的黏膜層，具有防止Toll樣受體過度活化，抵御入侵微生物，保護IECs的作用[14]。已有研究表明了自噬調(diào)控杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白的作用機制與活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)有關(guān)， ROS可參與自噬蛋白 LC3 啟動杯狀細(xì)胞黏蛋白顆粒的積聚和分泌，但當(dāng)自噬基因缺失(如ATG5、ATG7和LC3)時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ROS的增加可能減少黏蛋白的產(chǎn)生[16]。

1.3 自噬與腸道炎癥反應(yīng)

越來越多的研究表明，腸道菌群紊亂與腸道炎癥性疾病密切相關(guān)。自噬相關(guān)基因ATG16L1缺失會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)和腸道炎癥的發(fā)生[17], ATG16L1突變小鼠在感染鼠傷寒桿菌后不能通過Paneth細(xì)胞的分泌性自噬途徑分泌溶菌酶，也會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，這或許是克羅恩病的原因[18]；將ATG16L1 T316A(相當(dāng)于人體T300A)敲入小鼠的巨噬細(xì)胞中可使ATG16L1蛋白表達顯著減少、自噬功能減低和促炎細(xì)胞因子IL-1β表達增加，使其更易于發(fā)生腸道炎癥[7]。此外，免疫相關(guān)GTP酶M蛋白(Immunity-related GTPase Family M Protein，IRGM)、酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-Binding Oligomerization Domain 2，NOD2)和富含亮氨酸的重復(fù)激酶2(Leucine-rich Repeat Kinase-2，LRRK2)等自噬相關(guān)基因的功能障礙也能導(dǎo)致腸道炎癥[7]。IRGM 的多態(tài)性可致實驗動物自噬功能失調(diào)，使腸道炎性反應(yīng)持續(xù)存在。NOD2被腸道細(xì)菌產(chǎn)物激活后，即招募ATG16L1至隔離膜上，形成自噬體。但當(dāng)自噬被抑制，NOD2的刺激將會引起促炎細(xì)胞因子反應(yīng)性增加。LRRK2與異源自噬(即自噬降解入侵微生物如細(xì)菌、病毒等的過程)和Paneth細(xì)胞的分泌性自噬相關(guān)，LRRK2 缺失可導(dǎo)致Paneth細(xì)胞的自噬功能受損，促使炎癥性腸病發(fā)生[19]。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬與腸道炎癥之間的聯(lián)系機制主要與炎癥小體相關(guān)，自噬可以通過促進ROS生成、下調(diào) IL-1β 前體而控制炎癥小體的表達[7]。當(dāng)自噬缺陷時，炎癥小體活化，產(chǎn)生較多的促炎細(xì)胞因子，引起腸道炎癥反應(yīng)[20]。此外，自噬也通過調(diào)節(jié)共生細(xì)菌的免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)黏液分泌和miRNA沉默通路等，阻止腸道炎癥反應(yīng)[21]。還有研究報道，腸上皮細(xì)胞的自噬缺陷可使腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)增加而引起腸細(xì)胞死亡，以及使腸道炎癥敏感性增加[22]。

2 腸缺血激活自噬有助于改善腸道損傷

2.1 腸缺血的病變特點

腸缺血引起血管功能障礙有四種類型：栓塞性動脈閉塞(40%-50%)、血栓性動脈閉塞(20%-35%)、非閉塞性形式(5%-15%)和靜脈腸系膜血栓形成(5%-15%)[23]。一般短時間和輕度缺血情況下，腸系膜血管可代償性收縮以滿足重要器官的血液灌注，而不會損害腸道系統(tǒng)。但當(dāng)機體長時間或重度缺血時，這種血容量的重新分配則會導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道缺血，引起一定程度的腸道損傷。腸缺血性損傷首先從對低灌注和對缺氧高度敏感的黏膜絨毛開始，表現(xiàn)為絨毛斷裂和出血。一旦腸黏膜屏障完整性破壞，可能迅速引起炎癥介質(zhì)的聚集和細(xì)菌內(nèi)毒素及其它微生物成分進入血液，引發(fā)局部和全身炎癥反應(yīng)，甚至引起SIRS，加劇腸道灌注不足和損傷[24]。有效液體復(fù)蘇可以逆轉(zhuǎn)缺血狀態(tài)，避免腸組織的不可逆壞死，但液體再灌注可能造成ROS的產(chǎn)生，并超出局部組織的清除能力，使自由基擴散到周圍區(qū)域，引發(fā)惡性炎癥循環(huán)。炎性細(xì)胞因子進入體循環(huán)，還可能引起遠端器官如肝和肺的炎癥損傷[25]。

2.2 腸缺血激活自噬及分子機制

近年來，人們越來越關(guān)注腸缺血性損傷與自噬之間的相互聯(lián)系。許多研究結(jié)果表明腸缺血損傷后，與自噬體形成密切相關(guān)的LC3-II/LC3-I比值升高，與自噬活性呈負(fù)相關(guān)的p62表達下調(diào)，電鏡檢查自噬體數(shù)目明顯增多[26-28]，都充分佐證了腸缺血損傷后自噬增強。自噬的激活因子是磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(Adenosine 5'-Monophosphate-Activated Protein Kinase，AMPK)。在缺血的初始階段，腸上皮細(xì)胞的低ATP水平激活A(yù)MPK，然后經(jīng)過直接或間接的ULK1作用來調(diào)控自噬的發(fā)生。位于AMPK上游的兩個激酶，鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶2(Recombinant Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase Kinase 2，CAMKK2)和腫瘤抑制因子肝激酶B1(Liver Kinase B1，LKB1)，主要負(fù)責(zé)調(diào)控AMPK亞單位的磷酸化；腸缺血性損傷過程中能量耗竭激活A(yù)MPK有賴于LKB1，細(xì)胞內(nèi)鈣超載激活A(yù)MPK依賴于CAMKK2[29]。有研究者觀察到芍藥苷可使腸缺血再灌注損傷大鼠p-LKB1與p-AMPK表達同步增加，而p-CAMKK2則無明顯變化[27]，揭示LKB1/AMPK可能是腸缺血自噬激活的重要信號通路。

2.3 自噬對腸道損傷的改善作用

研究表明自噬激活有助于減輕腸缺血性損傷。ATG4B對miR-665-3p抑制介導(dǎo)的腸保護起到關(guān)鍵作用，可能是自噬激活改善腸缺血性損傷的關(guān)鍵靶點。miR-665-3p抑制可以刺激自噬活性，降低血液TNF-α和IL-6水平，抑制NOD樣受體家族3(Nucleotide Binding Oligomerization Domain-like Receptors，NLRP3)炎癥小體表達和IL-1β成熟，并阻礙Caspase-3的激活，減輕炎癥和凋亡，有助于改善腸缺血性損傷。芍藥苷預(yù)處理對大鼠腸缺血再灌注損傷保護機制可能是通過增加腸道缺血損傷的自噬通量，減輕腸道炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的[27]。核因子E2相關(guān)因子(Nuclear Factor E2 Related Factors，Nrf2)改善腸缺血性損傷作用通過AKT/糖原合成酶激酶-3β(Gglycogensynthesis Kinase-3β，GSK-3β)信號通路激活自噬，減少氧化應(yīng)激，改善腸缺血性損傷[30]。自噬還可顯著抑制NLRP3炎癥小體活化[28]，改善腸缺血性損傷，降低放射性和燒傷性因素引起腸缺血時的ROS與自由基水平升高，減少氧化應(yīng)激，減輕腸道損傷[31]。

3 抑制過度自噬有利于減輕腸道損傷

研究顯示，腸缺血性損傷可能引起自噬的過度激活，而抑制過度自噬有助于減輕腸損傷[4, 32]。Li等[26]在一項腸缺血再灌注實驗研究中發(fā)現(xiàn)，缺血前給予自噬激活劑雷帕霉素大鼠腸損傷加重，而在腸缺血前給予自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)大鼠腸損傷明顯減輕，兩者腸損傷程度與其自噬水平變化呈正相關(guān)關(guān)系，亦即自噬過度加劇腸損傷，抑制過度自噬可以減輕腸損傷。El-Malkey等[5]也報道了相同結(jié)果，而且認(rèn)為這種過量的自噬表達可以用氧化應(yīng)激反應(yīng)來解釋，ROS誘導(dǎo)的Beclin-1和LC3增加可能是過度自噬的主要原因。Beclin 1和LC3是自噬的中心調(diào)節(jié)蛋白， Beclin-1過表達不僅提升LC3-II水平，促進自噬體形成，而且抑制自噬體清除[33]。

過度自噬可能與一些觸發(fā)因素如ROS爆發(fā)、線粒體Ca2+超載、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等等有關(guān)[27]。這些因素可以通過激活Bcl-2腺病毒E1B 19kDa相關(guān)蛋白3(Bcl-2/Adenovirus E1B 19kDa Interacting Protein 3，BNIP3)，引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore，mPTP)開放增加，促使自噬過度表達[34]。另外ROS 水平升高，不僅導(dǎo)致 Beclin-1過表達，增加自噬流量[35]，還使ATG4發(fā)生氧化，使其活性降低，促進LC3脂質(zhì)化，從而增強自噬激活[36]。

自噬是一個動態(tài)過程，在缺血性疾病中起有益還是有害作用取決于機體氧供的改變、損傷的程度以及不同器官對缺血的耐受性[37]。適度自噬有利于細(xì)胞在各種應(yīng)激條件下存活，而自噬過度或自噬不足可引發(fā)腸道炎癥、ROS積累等，導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷。而將自噬維持在一個適當(dāng)?shù)乃剑瑢ΡＷo腸道生理功能和抵御各種病理侵害都具有積極意義。

4 小 結(jié)

自噬通過調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的功能和調(diào)控腸道細(xì)菌炎癥反應(yīng)，維持了腸粘膜屏障耐受性和防御性之間的平衡。腸缺血可能通過AMPK對ULK1的直接或間接作用激活自噬，自噬激活則能減輕炎癥反應(yīng)、降低氧化應(yīng)激水平，從而改善腸道損傷。腸缺血性損傷與再灌注會引發(fā)過度自噬而加劇腸損傷，抑制由ROS爆發(fā)誘導(dǎo)的Beclin-1和LC3過高表達可能逆轉(zhuǎn)其負(fù)效應(yīng)。因此，針對腸缺血性損傷時自噬表達水平及其多重作用，研究如何能夠維持適度自噬，避免過度與不足，將是今后工作的重點，也將對未來利用細(xì)胞自噬治療或預(yù)防腸缺血性損傷提供新理論和新方法。

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