王方迪 侯瑞霞 趙新程 李俊琴 張開明 李新華

（山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，太原030009）

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一群中胚層來源的多能干細胞，可通過釋放細胞因子等對微環(huán)境中的T細胞、B細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）、樹突狀細胞（DC細胞）等免疫細胞的活化、增殖和炎癥因子的釋放等發(fā)揮抑制作用，因而被認為是一種免疫抑制細胞［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者的皮損MSCs具有特殊的細胞因子表達特點和功能，可能參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展，本實驗室從銀屑病患者皮損處分離出的真皮間充質(zhì)干細胞（dermal mesenchymal stem cells，DMSCs）的炎癥相關(guān)基因如白細胞介素1β（IL-1β）、趨化因子14（CXCL14）等表達異常，對T細胞增殖的抑制作用減弱［2-4］，另外CAMPANATI等［5］也發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損中分離出的MSCs的Th1、Th17型 炎 癥 因 子 高 表 達 如IFN-γ、IL-17、IL-23、TNF-α等，ORCIANI等［6］同樣研究發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損處MSCs的血管內(nèi)皮生成因子（VEGF）及NO分泌增多。MSCs的功能可受到IFN-γ、TNF-α等炎癥因子的影響［7］，因此推測銀屑病患者皮損異常表達的Th1/Th17炎癥因子可能誘導了局部DMSCs功能的異常。為探討銀屑病皮損處DMSCs異常的原因，進一步明確DMSCs在銀屑病發(fā)病過程中的作用，本研究擬用銀屑病患者血清作用于正常DMSCs，觀察其對DMSCs免疫功能相關(guān)細胞因子表達水平的影響以及其對PHA誘導的T細胞增殖的抑制作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標本來源收集銀屑病患者20例，均經(jīng)臨床和病理確診為尋常型銀屑病，男13例，女7例，年齡18~60歲，病程10~20年，選擇20例同期在我院體檢正常的志愿者作為對照組及5例在我院泌尿外科、整形外科進行手術(shù)的健康志愿者的多余皮膚組織，年齡、性別與銀屑病患者相匹配，所有志愿者均排除銀屑病等免疫相關(guān)性疾病。本研究已通過太原市中心醫(yī)院倫理委員會批準，所有樣本取材前均征得本人同意，并簽署知情同意書。所有對象均排除其他慢性炎癥性疾病以及自身免疫疾病，取材前1個月內(nèi)未系統(tǒng)使用過糖皮質(zhì)激素、生物制劑及免疫抑制劑等。

1.1.2 主要試劑與儀器DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國HyClone公司；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、Dispase酶、淋巴細胞分離液及胰蛋白酶購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olym?pus公司；MACS CD3磁珠、LS分選柱和Vario MACS分選器購自德國Miltenyi Biotec公司；37℃恒溫培養(yǎng)箱購自美國Sheldon Manufactuing Inc公司；實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；SYBR premix EX?TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 DMSCs的分離和培養(yǎng)用本實驗室之前研究描述的方法進行5例皮膚組織的DMSCs的分離和培養(yǎng)［8］，無菌條件下切取皮膚組織1 mm3大小，去除皮下組織及角質(zhì)層，加入0.25% Dispase酶37℃消化2~4 h，分離真、表皮，收集真皮部分，進一步將組織塊剪碎，吸管吹打，篩網(wǎng)過濾，濾過液離心棄上清，沉淀中加含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，以1.0×105個/cm2密度接種于T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。72 h后棄去未貼壁細胞，每3~4 d半量換液1次。待細胞融合90%以上時，用0.25%胰酶消化傳代。細胞傳至第三代后收獲計數(shù)，用流式細胞儀分析細胞表面標記物如CD29、CD44、CD34、CD105、CD45及HLA-DR，體外成骨和成脂分化實驗也如之前研究所述［8］。

1.2.2 血清采集及DMSCs培養(yǎng)40例研究對象（20例銀屑病、20例正常對照）均清晨空腹采集靜脈血液5 ml，置于添加了促凝劑的采血管中，4 000 r/min離心5 min后吸取血清，過濾后放置于低溫冰箱-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩４鼶MSCs傳至第三代并有70%以上貼壁后，棄原培養(yǎng)基，將含50%人血清（預實驗摸索確定）的DMEM/F12培養(yǎng)基加入細胞中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后胰酶消化，收獲細胞。

1.2.3 實時熒光定量PCR采用Trizol法提取DMSCs的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)體積為20μl，包括SYBR premix EX TaqⅡ10μl，ROX Reference Dye 0.4 μl，上下游引物各0.4 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 6.8 μl。擴增條件為95℃10 min，95℃30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參進行擴增，每個樣品重復2次，得到每個樣品的Ct值，采用2-ΔΔCt法進行結(jié)果分析。熒光定量引物及序列見表1。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

1.2.4 T細胞分離及共培養(yǎng)采集3例正常對照者（取自上述20例體檢者）外周血5 ml，EDTA抗凝，采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（periph?eral blood mononuclear cells，PBMCs）［4］，分 離 出 的PBMCs用PBS洗2次，根據(jù)說明書用MACS CD3磁珠，LS分選柱和VarioMACS分選器分選出T細胞，調(diào) 整 細 胞 濃 度 為6.7×105個/ml，血 清 刺 激 后 的DMSCs為4×105個/ml待用。用PHA（植物凝集素）刺激T細胞誘導其活化，PHA加入細胞懸液的濃度為50μg/ml。

本實驗分為3組：①正常血清組：正常血清作用的DMSCs（HD-tr-DMSCs）+T細胞；②銀屑病血清組：銀屑病血清作用的DMSCs（Pso-tr-DMSCs）+T細胞；③單獨T細胞培養(yǎng)為對照。所有培養(yǎng)組均用12孔Transwell板共培養(yǎng)，DMSCs種于上室（500 μl/孔），T細胞種于下室（1.5 ml/孔）（DMSCs∶T=1∶5），并置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育72 h，收集懸浮細胞以備后續(xù)檢測。

1.2.5 CCK-8檢測T細胞的增殖率T細胞與不同刺激作用的DMSCs共培養(yǎng)72 h后收獲，用相同的稀釋倍數(shù)將細胞按每孔100μl接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入10μl CCK-8，繼續(xù)孵育4 h，酶標儀檢測450 nm處的吸光度值（即OD值），用OD值反映T細胞的增殖情況。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，大于兩組時組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚間充質(zhì)干細胞的形態(tài)在倒置顯微鏡下觀察，細胞早期未貼壁，呈小圓形，培養(yǎng)2 d后可見長梭形細胞貼壁，隨著培養(yǎng)時間延長，貼壁細胞增多，細胞逐漸增大，基本為梭形成纖維細胞形態(tài)且互相連接，培養(yǎng)14 d左右，細胞90%融合，梭形排列，呈漩渦狀。血清加入細胞后，細胞生長速度加快，形態(tài)未發(fā)生明顯變化，銀屑病組與正常血清組無差別。見圖1。

圖1 血清作用后的DMSCs形態(tài)（×100）Fig.1 Morphology of DMSCs after serum action（×100）

2.2 血清作用后DMSCs的IL-10、PGE2、TLR4表達水平熒光定量PCR檢測結(jié)果見表2，與HD-tr-DMSCs表達水平相比，Pso-tr-DMSCs的IL-10、前列腺素E2（PGE2）、Toll樣受體4（TLR4）低表達，分別為對照組的0.48倍、0.11倍、0.37倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表2 血清作用后各基因mRNA表達水平Tab.2 mRNA expression levels of genes treated with serum

2.3 不同血清刺激后的DMSCs對PHA活化的T細胞增殖能力的影響為明確銀屑病患者血清對DMSCs免疫功能的影響，將Pso-tr-DMSCs與PHA活化后的T細胞共培養(yǎng)，同時以HD-tr-DMSCs以及T細胞單獨培養(yǎng)作為對照。共培養(yǎng)結(jié)束后采用CCK-8法檢測各組T細胞的增殖能力。結(jié)果如圖2所示，相比活化的T細胞單獨培養(yǎng)組，與Pso-tr-DMSCs及HD-tr-DMSCs共培養(yǎng)的T細胞的增殖能力均顯著降低，且Pso-tr-DMSCs組的T細胞增殖能力較HD-tr-DMSCs組高，說明不管是正常血清還是銀屑病血清作用于正常DMSCs后，均可發(fā)揮抑制活化T細胞增殖的作用，且銀屑病血清可使DMSCs的免疫抑制能力減弱，各組差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

圖2 與不同組DMSCs共培養(yǎng)后的T細胞增殖情況Fig.2 Proliferation of T cells co-cultured with different DMSCs

3 討論

銀屑病目前被認為是一種以T細胞為主介導，多種免疫細胞共同參與的自身免疫性疾病［9］。眾多研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者血清中IL-1、IL-6、TNF-α、IL-8、IL-22、IL-17等炎癥性細胞因子高表達，且部分炎癥因子的表達水平與皮損嚴重程度呈正相關(guān)［10］。此外BOEHNCKE等［11］認為，銀屑病的斑塊是由皮損處的細胞與免疫系統(tǒng)的作用紊亂引起的，樹突狀細胞和T細胞是關(guān)鍵的效應(yīng)細胞，皮損處活化的樹突狀細胞釋放TNF-α及IL-23，誘導T細胞活化，Th1、Th17、Th22細胞增殖同時釋放了IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-22等炎癥因子，炎癥因子協(xié)同作用刺激角質(zhì)形成細胞分泌TNF-α、IL-20、IL-8等炎癥趨化因子，各種細胞的功能紊亂及炎癥因子的相互作用在銀屑病皮損局部形成了炎癥性微環(huán)境［6］。

間充質(zhì)干細胞幾乎存在于所有組織中，具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)特性，可通過細胞間直接接觸或者釋放細胞因子、趨化因子等方式發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能［1］。MSCs的免疫調(diào)節(jié)機制尚不完全清楚，據(jù)報道其可能的機制有：①MSCs通過吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）、PGE2、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、IFNγ、TLR4等抑制NK細胞的增殖及殺傷功能［12-14］；②分泌PGE2促使巨噬細胞向抗炎表型分化［15-16］；③通過分泌IL-6、PGE2等抑制抗原提呈細胞如樹突狀細胞的分化成熟［17］；④分泌IDO、TGF-β、IL-10等抑制Th1、Th17的產(chǎn)生及其細胞因子的分泌，促進Th2產(chǎn)生，誘導Treg產(chǎn)生［18-19］；⑤通過細胞間接觸抑制B細胞的增殖及功能［19］。

本研究前期及國內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損中分離的DMSCs在基因表達模式、促血管生成功能及免疫調(diào)節(jié)功能等方面均存在一定異常［2-6］。XU等［7］用炎癥因子TNF-α、IFN-γ刺激骨髓MSCs后，發(fā)現(xiàn)miR-155顯著高表達，且miR-155可通過靶向TAB2抑制誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的產(chǎn)生，從而削弱了MSCs的免疫抑制能力，降低對活化T細胞增殖的抑制作用。因此推測，銀屑病皮損MSCs功能的異常可能由皮損處升高的多種炎癥因子誘導。

MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能主要通過PGE2、IL-10、IDO、TLR4等細胞因子實現(xiàn)。因此，本實驗在體外用銀屑病患者的血清模擬其體內(nèi)的炎癥環(huán)境，觀察其對正常DMSCs的IL-10、PGE2、TLR4表達水平的影響，并將不同血清處理過的DMSCs與PHA活化的T細胞共培養(yǎng)，觀察其對T細胞增殖抑制功能的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者血清處理可引起正常DMSCs低表達抗炎因子TLR4、IL-10、PGE2，且在體外抑制活化T細胞增殖的能力降低，這種異常與銀屑病患者皮損處的DMSCs相似。以上結(jié)果提示，銀屑病患者血清中的炎癥因子確實可以抑制DMSCs抗炎因子的表達，進而降低DMSCs的免疫抑制功能。

研究表明，MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能可受多種因素的影響［20-23］，如前所述，炎癥因子刺激MSCs后高表達的miR-155可通過靶向TAB2降低MSCs的免疫抑制功能，但是，關(guān)于炎癥因子對MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的影響也有不同的報道，如在炎癥早期，促炎細胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-1等水平較低，MSCs會產(chǎn)生大量的促炎因子及趨化因子促進炎癥及免疫反應(yīng)，而在炎癥的晚期，促炎細胞因子水平較高，MSCs則會獲得免疫抑制表型，產(chǎn)生大量的IDO、NO及趨化因子，協(xié)同作用抑制免疫反應(yīng)［20-22］，MSCs表型的變化也與TLR的激活有關(guān)，但目前關(guān)于TLR4活化后會促進免疫還是抑制免疫暫時沒有定論［23］。

綜上所述，銀屑病血清中升高的炎癥因子可能引起其作用的MSCs表型變化，進而引起其細胞因子表達及功能的變化。當然，尚需進一步更詳細的研究來明確患者的血清中引起DMSCs發(fā)生了什么樣的變化，以及這些變化所涉及的分子機制。