張超，李永帥，章曉聯(lián)，劉光輝

哮喘是一種多種炎癥細胞參與的慢性氣道炎癥性疾病，過敏原導致的氣道炎癥是形成哮喘最核心的病理生理過程之一。氣道上皮細胞被認為是參與對過敏原、病毒等異物入侵的一線免疫防御天然免疫細胞。屋塵螨(house dust mite,HDM)是一類存在于灰塵和填充物中可導致變應性疾病的最常見氣傳過敏原[1]。既往研究表明，HDM接觸氣道上皮后，可以通過樹突狀細胞募集Th2細胞等誘導2型炎癥的形成，刺激產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13等炎癥因子參與過敏反應。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氣道上皮細胞也直接介導過敏原的免疫效應，是重要的固有免疫細胞，其通過產(chǎn)生IL-25、IL-33和胸腺基質(zhì)淋巴生成素構(gòu)成過敏性哮喘的發(fā)生機制之一；同時HDM也可通過激活TLR2通路，增強NF-κB信號轉(zhuǎn)導，促進IL-6等細胞因子的釋放[2-3]。

細胞因子IL-32在1992年首次發(fā)現(xiàn)，由多種細胞(如NK細胞、T細胞、單核細胞和上皮細胞)產(chǎn)生，可在細胞內(nèi)通過I-κB通路和p38-MAPK通路激活NF-κB信號，調(diào)節(jié)信號下游的免疫效應[4-5]。高劑量的IL-2、IFN-γ、TNF-α、Th1細胞因子可誘導外周血單核細胞IL-32 mRNA的表達[6-8]。大量研究表明IL-32的免疫調(diào)節(jié)功能具有多樣性，其生物學效應兼具促炎和抗炎作用[9]。到目前為止，多個研究團隊發(fā)現(xiàn)IL-32的表達異常與炎癥性疾病和過敏性疾病相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，鼻病毒感染可誘導人支氣管上皮細胞哮喘炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，并促進IL-32的表達[10]。哮喘患者誘導痰中IL-32水平的增加與哮喘急性發(fā)作風險呈正相關(guān)[11]，提示在缺少抗炎治療的情況下，抑制IL-32的表達可能具有抑制哮喘氣道炎癥的作用。然而，IL-32在屋塵螨所致過敏性哮喘的固有免疫效應中的作用鮮有報道。本研究觀察HDM對人支氣管上皮細胞IL-32及相關(guān)炎性細胞因子表達水平的影響，探究IL-32表達的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年男性人支氣管上皮細胞(16HBECs)，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)公司。HDM提取物購自北京博蕾德科技發(fā)展有限公司。GAPDH、IL-32、IL-8、IL-1β、TNF-α及NF-κB等相關(guān)PCR引物于武漢擎科生物技術(shù)公司合成。Western blotting檢測法所需兔抗p-p38抗體、兔抗p-p65抗體、兔抗TLR-4抗體購自美國CST公司，鼠抗GAPDH抗體購自Abcam公司；HRP-羊抗鼠IgG購自美國Proteintech公司以及HRP-羊抗兔IgG購自Abcam公司。IL-32、IL-6、IL-8以及IL-1β等細胞因子ELISA試劑盒(96T)購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 人支氣管上皮細胞致敏模型構(gòu)建

將16HBE細胞用KM培養(yǎng)基進行貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加必需血清。將細胞培養(yǎng)瓶置于細胞培養(yǎng)箱中，定時更換培養(yǎng)基。接種16HBE細胞到12孔板上，待細胞生長狀態(tài)到大約80%融合時，隨機分成4組：A為對照組；B、C、D為不同濃度HDM稀釋液刺激組，B、C、D組HDM稀釋液的濃度分別為2、10、20 μg/mL，刺激時長均分別為6、12和24 h。

1.3 RT-PCR檢測16HBE細胞IL-32、IL-8、IL-1β、TNF-α及NF-κB mRNA表達

用RNA Trizol試劑盒提取各組16HBE細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。配制20 μL RT-PCR反應體系，設置反應條件，進行RT-PCR上機檢測。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用ΔΔCt法對目的基因結(jié)果進行定量分析。GAPDH和IL-32、IL-8、IL-1β、TNF-α及NF-κB等引物序列見表1。

表1 GAPDH、IL-32、IL-8、IL-1β、TNF-α及NF-κB等引物序列Table 1 Primer sequences of GAPDH, IL-32,IL-8,IL-1β,TNF-α, and NF-κB

1.4 細胞上清液中IL-32和相關(guān)炎癥因子水平測定

無菌EP管收集各組16HBE細胞上清液，室溫低速離心2次。按照ELISA試劑盒說明書進行人IL-32和IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子表達水平檢測，每個樣品均設兩個復孔，取其平均值。

1.5 細胞內(nèi)p-p38、p-p65、TLR-4蛋白水平免疫印跡分析

將對照組與實驗組16HBE細胞用2×SDS-loading buffer裂解，煮沸后用BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)檢測蛋白的相對分子質(zhì)量大小配制對應的分離膠和濃縮膠，進行蛋白質(zhì)電泳，最后用濕法轉(zhuǎn)膜和發(fā)光顯影，通過對比條帶色深度確定蛋白質(zhì)表達水平。

1.6 統(tǒng)計分析

本研究使用軟件SPSS 25.0和GraphPad Prism V.7.00軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有呈正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)資料以(均數(shù)±標準差)表示，并采用Levene檢驗進行方差齊性檢驗。兩樣本間均數(shù)差異比較采用Student’st-檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析處理。P<0.05，認為結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HDM刺激16HBE細胞后炎癥因子mRNA表達譜變化

16HBE細胞經(jīng)不同濃度HDM刺激24 h后，各刺激組IL-32 mRNA表達水平均較對照組顯著上調(diào)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(圖1A)。HDM各不同刺激濃度下， IL-32 mRNA表達水平均可見時間依賴效應(圖1B～D)。在高濃度(20 μg/mL)HDM刺激條件下，IL-32 mRNA表達水平與對照組相比，在各刺激時長均大量升高，且在刺激24 h達到高峰(P<0.001，圖1D)。

不同濃度HDM刺激16HBE細胞24 h后，細胞內(nèi)IL-8、IL-1β、TNF-α和NF-κB mRNA表達水平均顯著增高，且刺激濃度越高，IL-1β、TNF-α和NF-κB的表達水平越高(P<0.01，圖2A、C)。高濃度(20 μg/mL)HDM刺激下，刺激時間越長，NF-κB及與NF-κB信號通路相關(guān)的IL-8，IL-1β、TNF-α炎癥因子mRNA的表達上調(diào)更為顯著，尤其在刺激24 h時，炎癥因子表達水平達到高峰(P<0.01，圖2B、D)，16HBE細胞內(nèi)NF-κB信號通路處于激活狀態(tài)。

2.2 HDM刺激16HBE細胞后炎癥因子分泌的變化

不同濃度HDM刺激24 h后(圖3A)，16HBE細胞IL-32分泌水平較對照組顯著上調(diào)，呈一定劑量依賴效應。高濃度(20 μg/mL)刺激下，IL-32分泌水平呈明顯的時間依賴性(圖3B)，且在刺激24 h后表達差異更顯著(P<0.01)。

HDM刺激16HBE細胞6 h，僅在高濃度HDM(20 μg/mL)作用下，IL-1β分泌顯著增高(P<0.01。圖4A)。HDM刺激24 h，各濃度刺激條件下， IL-1β、IL-6、IL-8分泌水平均顯著上調(diào)圖(P<0.05，圖4B～D)，且IL-6和IL-8的分泌與HDM呈一定濃度依賴效應。

2.3 HDM刺激16HBE細胞后p-p38、p-p65、TLR-4蛋白表達

不同濃度、不同時長HDM刺激16HBE細胞后， p-p38表達水平與HDM濃度和刺激時長呈現(xiàn)良好的依賴效應(圖5A)。核因子κB相關(guān)磷酸化蛋白p-p65和p-p38蛋白表達變化趨勢相同(圖5B)。HDM刺激6 h后TLR-4表達有所增加(圖5C)。

3 討論

支氣管哮喘具有典型的異質(zhì)性，以可逆性的阻塞性氣流受限，氣道高反應性和復雜的免疫相關(guān)慢性氣道炎癥為主要特征[12-13]。廣泛存在于灰塵與織物中的塵螨，其分布范圍與人類活動密切相關(guān)[14]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在哮喘患者中，環(huán)境中塵螨含量的高低與患者發(fā)病存在關(guān)聯(lián)性，環(huán)境中塵螨濃度越高，越容易引發(fā)哮喘的發(fā)作[15]。哮喘作為一種與氣道上皮細胞相關(guān)的炎癥性疾病，在塵螨過敏原刺激下，氣道上皮細胞內(nèi)各種細胞因子與炎癥介質(zhì)激活，形成錯綜復雜的免疫失衡網(wǎng)絡。IL-32表達異常與類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸道疾病、慢性阻塞性肺疾病[8, 16-17]等多種慢性炎癥性疾病相關(guān)；而在哮喘動物研究和臨床研究中，IL-32參與促炎效應還是抗炎作用尚存在爭議[18-19]。為了探究IL-32是否是塵螨過敏原誘導氣道炎癥的重要介質(zhì)及其是否具備作為過敏性哮喘氣道標志物的優(yōu)勢，本研究使用不同濃度、不同時長HDM刺激16HBE細胞，測定胞內(nèi)p-p38、p-p65、TLR-4蛋白、檢測IL-32 mRNA表達及其上清中釋放水平以及下游IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子的表達水平。

圖 1 HDM過敏原刺激前后16HBE細胞IL-32 mRNA表達

圖 2 HDM過敏原刺激前后16HBE細胞IL-8、IL-1β、TNF-α、NF-κB mRNA表達

圖 3 HDM過敏原刺激前后16HBE細胞IL-32分泌

圖 4 HDM過敏原刺激前后16HBE細胞IL-1β、IL-6、IL-8分泌

各實驗組細胞與對照組細胞相比，細胞內(nèi)IL-32mRNA表達水平顯著增加，呈良好的濃度依賴效應和刺激時間依賴效應，說明高濃度過敏原與其刺激時長在過敏性氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮作用，提示IL-32可能具備成為反映氣道炎癥新型標志物的潛能。IL-6、IL-8、IL-1β均屬于NF-κB信號通路下游的細胞因子，在NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路激活后，IL-8、IL-1β的水平通常上調(diào)。實驗檢測到NF-κB以及信號通路下游的IL-8、IL-1β等炎癥因子mRNA表達水平出現(xiàn)與IL-32一致的平行變化，說明過敏性氣道炎癥中，IL-32可能參與NF-κB通路的活化，IL-32可能是過敏原暴露氣道炎癥中的一種促炎因子。不僅如此，經(jīng)不同濃度HDM刺激16HBE細胞后，分泌性IL-32、IL-6、IL-8、IL-1β也同樣明顯升高，與其mRNA轉(zhuǎn)錄水平保持一致性，進一步表明HDM可能通過激活NF-κB信號通路，以時間依賴性和(或)濃度依賴性促進下游過敏性炎癥因子的分泌量增加；同時說明IL-32是連接這一促炎過程放大的紐帶，為該通路的激活提供了中間誘導介質(zhì)。

圖 5 HDM過敏原刺激前后16HBE細胞內(nèi)p-p38、p-p65、TLR-4表達

研究表明，IL-32可通過激活NF-κB途徑在自身免疫性疾病中發(fā)揮作用。因此，在過敏性氣道炎癥中，本研究進一步探究IL-32與NF-κB途徑的關(guān)聯(lián)性。免疫印跡分析表明在不同濃度HDM刺激下，16HBE細胞內(nèi)NF-κB相關(guān)蛋白p-65磷酸化水平存在差異表達，且p-p65蛋白表達和NF-κB mRNA表達呈重疊效應，均表現(xiàn)為HDM刺激濃度和時長依賴效應，HDM刺激濃度越高，刺激時間越長，p-p65蛋白的表達更為活躍。同時，HDM接觸16HBE細胞后，p-p38蛋白和TLR-4蛋白被激活，TLR-4激活可能引起細胞內(nèi)下游相關(guān)細胞因子活化，促進p38-MAPK通路和NF-κB信號途徑的激活。有研究表明，HDM可激活TLR-4，通過TLR4/MD-2信號路徑激活NF-κB信號通路[20]，介導IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子的釋放，而IL-1β、TNF-α等炎癥因子可以刺激IL-32的上調(diào)[21]。本研究顯示不同濃度HDM刺激，可能激活依賴TLR-4信號介導的級聯(lián)效應，IL-32可能成為TLR4/MD-2信號路徑和NF-κB信號通路緊密聯(lián)系的紐帶，并且和NF-κB、p38MAPK信號通路相互交聯(lián)，共同發(fā)揮促炎效應，構(gòu)成該復雜過敏性氣道炎癥網(wǎng)絡中的重要一環(huán)，但可能的具體機制還不清楚，有待進一步研究。

綜上所述，本研究表明不同濃度HDM刺激人支氣管上皮細胞后，能引發(fā)氣道上皮細胞變性或者損傷，從而可建立過敏性氣道上皮細胞模型。IL-32可能在過敏性氣道炎癥性疾病起到促炎作用，因其具備HDM刺激濃度、刺激時長依賴性，且與IL-1β、IL-6、IL-8等下游炎癥因子表達呈相同趨勢，IL-32可能成為診斷過敏性哮喘和評估疾病嚴重程度的新型標志物，為哮喘的靶向治療提供潛在新方向。