吳天玉，劉湘鄂,許 海

(1.荊州市第三人民醫(yī)院 婦科,湖北 荊州434000；2.荊州市第三人民醫(yī)院 泌尿外科,湖北 荊州434000;3.湖北中醫(yī)藥大學黃家湖醫(yī)院 婦科,湖北 武漢430070)

順鉑是其主要化療藥物之一，克服耐藥在子宮內(nèi)膜癌臨床治療中至關(guān)重要。有研究報道，非編碼RNA在子宮內(nèi)膜癌細胞對紫杉醇[1-2]、卡鉑[3]耐藥機制中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)OXD2-AS1與微小RNA(miR)-185-5p相互作用，調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞細胞的增殖，遷移和侵襲[4]。肌腱同源盒1蛋白 (SIX1)在子宮內(nèi)膜中異常表達，是人類子宮內(nèi)膜癌的生物標志物[5]。但lncRNAFOXD2-AS1在子宮內(nèi)膜癌中的作用機制尚不清楚，探討lncRNA FOXD2-AS1通過調(diào)控miR-185/SIX1分子軸參與子宮內(nèi)膜癌細胞對順鉑敏感性的分子機制，為臨床化療耐藥尋找新的治療靶點和分子標志物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DDP(貨號：P4394)、兔源單克隆SIX1抗體(貨號：HPA001893)購自Sigma公司；BCA蛋白試劑盒(貨號：354234)購自上海恒斐生物科技有限公司；GAPDH抗體(貨號：ab181602)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(貨號：ab205718)單抗均購自abcam公司；DMEM培養(yǎng)基(貨號：10567014)購自Gibco公司；ECL化學發(fā)光試劑盒(貨號：P0018S)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；顯微鏡購自上海炳宇光學儀器有限公司；化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細胞和正常子宮內(nèi)膜HESC細胞均購自中科院上海細胞研究所，將HEC-1-B、HESC細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)，當細胞融合80%左右時，用胰蛋白酶消化進行傳代，細胞處于對數(shù)生長期進行后續(xù)實驗。

1.3 子宮內(nèi)膜癌DDP耐藥細胞株[6]構(gòu)建

取對數(shù)生長期的HEC-1-B細胞，調(diào)整濃度為1×107個/ml，DDP開始作用濃度為2 μmol/L，刺激48 h后，無顯著死亡，DDP濃度按4、8、12、16、20、24 μmol/L逐步增加，最終在DDP 22 μmol/L下能夠穩(wěn)定生長，獲得耐藥細胞株HEC-1-B/DDP，并長期培養(yǎng)維持其耐藥性。

1.4 qRT-PCR檢測各組細胞中FOXD2-AS1、miR-185和SIX1表達水平

提取各組細胞中總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行qPCR檢測，用U6和GAPDH為內(nèi)參，引物序列如表1所示。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行計算。

表1 引物序列

1.5 MTT法檢測各組細胞活性及藥物敏感性

取對數(shù)生長期的HEC-1-B、HEC-1-B/DDP細胞，調(diào)整濃度為1×105個/ml，接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h，每孔設(shè)置6個平行孔，然后，每孔加入20 μL MMT，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后，每孔加入200 μL DMSO，用酶標儀測定在570 nm處的吸光值(A值)。

1.6 Transwell檢測各組細胞遷移、侵襲能力

調(diào)整細胞濃度為2×105/mL接種于Transwell上室，下室加250 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出小室，PBS沖洗后，用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，沖洗干燥后于倒置顯微鏡下隨機選取5個視野進行觀察并計算遷移數(shù)。細胞侵襲能力檢測：制備50 μL Matrigel膠(200-300 μg/mL)，鋪在Transwell小室的上室于恒溫培養(yǎng)箱過夜，待Matrigel膠凝固。

1.7 Western blot檢測細胞中SIX1蛋白表達水平

提取各組細胞總蛋白，BCA蛋白試劑盒測其濃度，按蛋白30 μg /孔上樣進行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入一抗(抗SIX1抗體，1∶1000)，4℃下過夜培養(yǎng)，次日加二抗(1∶5000)，溫室中培養(yǎng)1 h，洗膜，ECL化學發(fā)光法進行顯色，GAPDH用作內(nèi)參，掃描膠片，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 HEC-1-B/DDP細胞藥物敏感性檢測結(jié)果

DDP對HEC-1-B的IC50值為15.36±0.91 μmol/L，HEC-1-B/DDP的IC50值為112.42±10.05 μmol/L，HEC-1-B/DDP的RI值為7.32±0.52。HEC-1-B/DDP細胞耐藥性良好，可用于后續(xù)實驗，見表2。

表2 HEC-1-B/DDP細胞耐藥敏感性檢測結(jié)果

2.2 HESC、HEC-1-B及HEC-1-B/DDP細胞中FOXD2-AS1表達水平

與HESC組相比，HEC-1-B組細胞中FOXD2-AS1表達顯著升高(P<0.05)；與HEC-1-B組相比，HEC-1-B/DDP組細胞中FOXD2-AS1表達顯著升高(P<0.05)，見表3。

表3 HESC、HEC-1-B及HEC-1-B/DDP細胞中FOXD2-AS1表達水平

2.3 低表達FOXD2-AS1對HEC-1-B細胞活性、遷移、侵襲的影響

與si-con組相比，si-FOXD2-AS1組細胞FOXD2-AS1表達、遷移、侵襲顯著降低(P<0.05)，細胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)，見圖1。

2.4 低表達FOXD2-AS1對HEC-1-B/DDP細胞藥物敏感性的影響

與HEC-1-B/DDP組相比，si-FOXD2-AS1組細胞RI值顯著降低(P<0.05)，見表4、5。

圖1 各組HEC-1-B細胞遷移、侵襲結(jié)果圖

表4 低表達FOXD2-AS1對HEC-1-B/DDP細胞藥物敏感性的影響

表5 各組HEC-1-B/DDP細胞RI值比較結(jié)果

2.5 HEC-1-B細胞中FOXD2-AS1對miR-185表達的影響

與si-con組相比，si-FOXD2-AS1組miR-185表達顯著升高(P<0.05)；與pcDNA組相比，pcDNA-FOXD2-AS1組miR-185表達顯著降低(P<0.05)，見表6。

表6 HEC-1-B細胞中FOXD2-AS1對miR-185表達的影響

2.6 過表達miR-185對HEC-1-B細胞活性、遷移、侵襲的影響

與miR-con組相比，miR-185-5p組細胞中miR-185表達、細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，細胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組HEC-1-B細胞遷移、侵襲結(jié)果圖

2.7 過表達miR-185對HEC-1-B/DDP細胞藥物敏感性的影響

與HEC-1-B/DDP組相比，miR-185-5p組細胞RI值顯著降低(P<0.05)，見表7、8。

表7 過表達miR-185對HEC-1-B/DDP細胞藥物敏感性的影響

表8 各組HEC-1-B/DDP細胞RI值比較結(jié)果

2.8 HEC-1-B細胞中miR-185對SIX1表達的調(diào)控作用

與miR-con組相比，miR-185組細胞中SIX1 mRNA及蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見表9。

3 討論

lncRNA在多種癌中失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和化學耐藥性密切相關(guān)[7]。lncRNAFOXD2-AS1在非小細胞肺癌、喉癌等多種癌細胞中表達升高，參與癌細胞增殖、遷移和侵襲等過程[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，與HESC組相比，HEC-1-B組細胞中FOXD2-AS1表達顯著升高，提示FOXD2-AS1與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生密切相關(guān)。與si-con組相比，si-FOXD2-AS1組細胞FOXD2-AS1表達、遷移、侵襲顯著降低，細胞增殖抑制率顯著增加，提示抑制FOXD2-AS1表達可以抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移和侵襲。與HEC-1-B組相比，HEC-1-B/DDP組細胞中FOXD2-AS1表達顯著升高，提示FOXD2-AS1表達可能影響子宮內(nèi)膜癌細胞對順鉑敏感性。而低表達FOXD2-AS1的HEC-1-B/DDP細胞的RI值較HEC-1-B/DDP細胞顯著降低，提示FOXD2-AS1表達降低對HEC-1-B/DDP細胞藥物耐藥性減弱，敏感性增強。

表9 過表達miR-185對SIX1表達的影響

多種LncRNA對miRNA具有海綿吸附作用，共同參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[10]。研究發(fā)現(xiàn)，與si-con組相比，si-FOXD2-AS1組miR-185表達顯著升高，與pcDNA組相比，pcDNA-FOXD2-AS1組miR-185表達顯著降低，提示在子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-185表達與FOXD2-AS1相關(guān)，Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，敲低FOXD2-AS1，miR-185表達升高，抑制肝癌細胞增殖，侵襲和遷移。推測在子宮內(nèi)膜癌細胞中FOXD2-AS1可以靶向作用于miR-185，影響細胞增殖、侵襲、遷移等生物學活性和對順鉑藥物敏感性。

SIX1屬于SIX轉(zhuǎn)錄因子家族，參與細胞生長、分化，SIX1在乳腺癌[12]、宮頸癌[13]等多種腫瘤細胞中異常表達且在癌細胞增殖、遷移、侵襲等過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，與miR-con組相比，miR-185組細胞中細胞增殖抑制率顯著升高，細胞遷移、侵襲數(shù)、SIX1 mRNA及蛋白表達顯著降低，提示miR-185表達與SIX1 mRNA及蛋白表達趨勢相反，其可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移、侵襲。過表達miR-185組HEC-1-B/DDP的RI值較HEC-1-B/DDP細胞RI值顯著降低，提示在子宮內(nèi)膜癌細胞中，過表達miR-185靶向作用SIX1，細胞順鉑耐藥性降低，敏感性升高。推測FOXD2-AS1可以通過調(diào)控miR-185/SIX1軸誘導子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移、侵襲且影響細胞對順鉑敏感性。綜上，F(xiàn)OXD2-AS1可通過下調(diào)miR-185-5p對SIX1的抑制作用，進而促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移、侵襲作用，下調(diào)細胞對DDP的敏感性。