倪宇昕，王 勇，鄧艷芳

(1.華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院 口腔科,廣東 深圳518052；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院)

菌斑生物膜是細菌與細胞外基質的共同聚合體，其對常規(guī)抗菌藥的抵抗力要高于浮游細菌[1-3]。多種疾病的發(fā)生都與難以根除的特定細菌生物膜的形成有關[2,4]?？莶菅挎邨U菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌形成的生物膜能導致發(fā)病率和死亡率增加[5-9]。針對這一難題，學者已經(jīng)研發(fā)了多種破除細菌生物膜的新方法[10]。其中，D-氨基酸因為抑制生物膜形成而被認為是對抗細菌生物膜的有效方法[1,5-8]。除了直接的抗菌作用外，D-氨基酸還會影響宿主免疫系統(tǒng)。D-苯丙氨酸通過G偶聯(lián)蛋白受體調節(jié)嗜中性粒細胞的趨化性，D-苯丙氨酸和D-亮氨酸通過甜味受體抑制先天免疫，D-色氨酸調節(jié)呼吸道的免疫耐受性[11]。巨噬細胞在防御病原體以及組織修復重塑中起著不可或缺的作用。根據(jù)微環(huán)境的差異，巨噬細胞表現(xiàn)出不同的功能表型，即促炎的M1極化或抗炎的M2極化[12]。IFN-γ能誘導巨噬細胞的M1表型，其特征是TNF-α，IL-6和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等炎性細胞因子升高[13]。而IL-4或IL-13會促進巨噬細胞M2極化的發(fā)生，隨后于IL-10和TGF-β升高而IL-12降低?；诰奘杉毎闹委煵呗栽诼匝仔约膊14-15]、自身免疫性疾病[16-17]和腫瘤[18-19]的治療中已展示較好前景。然而D-氨基酸是否直接影響巨噬細胞極化還不明確。因此，本研究通過體外實驗明確了D-纈氨酸對RAW264.7巨噬細胞M1極化的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和主要試劑D-纈氨酸購自Sigma-Aldrich公司(上海，中國)。LPS、IFN-γ、Elisa試劑盒和iNOS檢測試劑盒購自碧云天公司(北京，中國)。CCK-8試劑盒和引物購自生工生物(上海，中國)。熒光顯微鏡購自奧林巴斯(日本)。RAW264.7細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心(北京，中國)。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組液氮中取出凍存細胞，迅速放入37℃水浴融化，吸至培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清)，置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、100%濕度)中培養(yǎng)。每2-3天更換一次細胞培養(yǎng)基，當細胞融合到70%到80%時傳代。按著培養(yǎng)液中D-纈氨酸的濃度分組：不含D-纈氨酸的是對照組，含有D-纈氨酸的是實驗組，每組均重復進行3次。

1.3 細胞毒性測定將RAW264.7細胞與D-纈氨酸共同孵育24 h后，向各組細胞中加入CCK-8試劑，4 h后利用酶標儀進行吸光度的測定，以對照組吸光度為1，對實驗組的吸光度進行相對定量計算。

1.4 誘導RAW264.7細胞M1極化向細胞培養(yǎng)液中分別加入LPS (1 μg/ml)和IFN-γ(20 ng/ml)制成M1誘導培養(yǎng)液，用于后續(xù)M1誘導實驗。

1.5 實時定量 PCR法檢測利用M1誘導液培養(yǎng)RAW264.7細胞，實驗組中D-纈氨酸濃度為80 mM。培養(yǎng)24 h后利用Trizol提取細胞總RNA，測定濃度后進行逆轉錄得到cDNA，隨后使用進行real time PCR實驗。使用的引物正反序列如下：

IL-6:5′-CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG-3′，5′-CCACCTCAATGGACAGAATATCA-3′；

IL-1β：5′-AGTTGACGGACCCCAAAAG-3′，5′-TTTGAAGCTGGATGCTCTCAT-3′；

TNF-α：5′-GCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGG-3′，5′-ATGATCTGAGTGTGAGGGTCTGG-3′；

iNOS：5′-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3′，5′-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3′；

β-肌動蛋白：5′-CCACCATGTACCCAGGCATT-3′，5′-AGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′。

結果使用2-ΔΔCT方法計算基因相對差異。

1.6 iNOS檢測實驗開始前將將檢測試劑加入M1誘導液中，4 h后更換培養(yǎng)液為普通培養(yǎng)液，用熒光顯微鏡觀察細胞并在同參數(shù)下拍照，對比不同組中細胞表達iNOS的差異。

1.7 Elisa檢測利用M1誘導液培養(yǎng)細胞48 h，吸取培養(yǎng)液上清，離心后用于Elisa檢測IL-1β、IL-6和TNFα。

1.8 統(tǒng)計學分析結果以平均值±標準偏差(M±SD)方式呈現(xiàn)。使用GraphPad Prism 6.0軟件進行單因素方差分析，并定義P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度D-纈氨酸對Raw264.7細胞毒性本研究評估了濃度為0 mM至400 mM的D-纈氨酸對RAW264.7細胞的細胞毒性。如表1所示，結果顯示最佳生存力為50 mM，隨著濃度增加，呈現(xiàn)一定的細胞毒性。因此，將50 mM D-纈氨酸用于實驗。

表1 不同濃度D-纈氨酸對Raw264.7細胞24 h毒性分析

2.2 D-纈氨酸減少炎性因子的表達使用實時定量PCR方法分析D-纈氨酸是否影響炎細胞因子的轉錄，在LPS /IFN-γ刺激RAW264.7細胞后，IL-6，IL-1β，TNF-α和iNOS的mRNA水平高于未刺激的RAW264.7細胞。在LPS /IFN-γ誘導的RAW264.7細胞M1極化過程中添加50 mM D-纈氨酸則會嚴重抑制這些基因的轉錄(表2)。使用ELISA來確定D-纈氨酸是否在蛋白質水平上影響IL-6，IL-1β和TNF-α的表達，與未刺激的細胞相比，LPS刺激的RAW264.7細胞呈現(xiàn)IL-6，IL-1β和TNF-α的水平升高。此外，在LPS /IFN-γ誘導的巨噬細胞M1極化過程中添加50 mM D-纈氨酸可部分抑制這一作用(表3)。使用熒光顯微鏡檢測iNOS的表達量。如圖1所示，在LPS /IFN-γ的存在下，細胞中的熒光急劇增加，而D-纈氨酸的添加則抑制了這種增強，提示細胞中iNOS表達下降，這與PCR結果一致。

表2 實時定量PCR結果

表3 Elisa結果 (pg/ml)

圖1 細胞iNOS熒光檢測(40×)

3 討論

D-氨基酸對于細菌生物膜的破除作用已在多個研究中被證實。D-酪氨酸聯(lián)合丁胺卡那霉素對銅綠假單胞菌生物膜的影響，補充D-酪氨酸克服了銅綠假單胞菌生物膜對AMK的耐藥性[8]。Leiman等人的一項研究也報道了D型氨基酸對枯草芽孢桿菌生物膜形成的破除作用，該抑制作用是由于D型氨基酸對蛋白質合成的抑制而產(chǎn)生的[20]。此外，有學者研究了D型氨基酸對抗菌肽的作用，證實其能夠促進抗菌肽的作用[21]。但是關于D型氨基酸對宿主免疫系統(tǒng)的影響還不明確，因此本研究中針對這一問題進行了初步探索。

因為D型氨基酸不存在于人體內，所以首先需要明確D-纈氨酸的細胞毒性，結果表明低濃度時沒有明顯的細胞毒性，而高濃度時呈現(xiàn)出一定毒性，據(jù)此選擇了50 mM作為后續(xù)實驗的濃度，也提示在具體應用時應當考慮潛在的毒性反應。在應用D型氨基酸進行細菌破膜效應時，需要面對相對復雜的體內環(huán)境，特別是對細菌清除直接相關的巨噬細胞。巨噬細胞是參與先天性免疫應答的重要調節(jié)劑，并且已經(jīng)被認為是組織炎癥進展中的關鍵因素。巨噬細胞的兩種不同表型，由經(jīng)典活化的巨噬細胞(M1)和交替活化的巨噬細胞(M2)組成，在炎癥和組織修復過程中發(fā)揮不同作用。M1巨噬細胞可以由單核細胞在LPS和IFN-γ刺激下，通過經(jīng)典的NF-κB信號通路誘導，而M2巨噬細胞可由單核細胞通過M-CSF和IL-4刺激而來。

本研究采用LPS聯(lián)合IFN-γ的方法誘導M1巨噬細胞。通過對標志物的熒光定量PCR結果和Elisa結果分析，表明成功的實現(xiàn)了誘導。單純應用D-纈氨酸不會引起顯著的炎性因子升高，但是在誘導液條件下，卻能夠抑制炎癥反應，明顯降低IL1β、IL6和TNFα的表達。通過分析細胞中iNOS的表達也證實了D-纈氨酸的抗炎作用，綜合這些證據(jù)，可以明確適宜濃度的D-纈氨酸具有一定的抗炎效果，從而發(fā)揮抗菌和抗炎的協(xié)同效果，從而具有較好的應用前景。但是受限于本研究中采用的體外研究方法，仍需要更多的體內實驗驗證這一作用，此外關于其可能的抗炎機制也需要在今后的研究中進一步發(fā)掘。