麻杏止咳糖漿的薄層色譜法鑒別及高效液相色譜法測定其中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷

曹蓉蓉，王文金，嚴(yán)筱楠，朱艷華

（榆林市藥品檢驗所，陜西榆林 719000）

麻杏止咳糖漿收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第二十冊［1］，是由麻黃、苦杏仁、甘草（炙）、石膏等4 味藥材加工制成的復(fù)方制劑。麻黃作為麻杏止咳糖漿中的主藥，有宣肺、解表之功效，與石膏相配，既能平喘，又能瀉熱；苦杏仁降肺氣，助麻黃清肺平喘；甘草具有益氣中和、生津止渴作用［2］。麻杏止咳糖漿現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有麻黃(鹽酸麻黃堿)薄層色譜鑒別法，沒有其它指標(biāo)性成分的質(zhì)控方法，不利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。目前有人［3–6］使用高效液相色譜法測定麻黃止咳糖漿中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷等單一成分或幾種有效成分的研究，但對指標(biāo)成分進(jìn)行定量測定，或?qū)ζ渌煞诌M(jìn)行定性鑒別的研究鮮有報道。筆者在文獻(xiàn)［3–17］方法的基礎(chǔ)上，建立高效液相色譜法同時測定麻杏止咳糖漿中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷3種成分，并采用薄層色譜法定性鑒別甘草，為麻杏止咳糖漿的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，配DAD檢測器，安捷倫科技（中國）有限公司。

電子天平：（1）BP190S型，感量為0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；（2）MS205DU型，感量為0.01 mg，梅特勒–托利多儀器（上海）有限公司。

超聲波清洗器：AS11000398型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

自動純水蒸餾器：LHP–18–2型，重慶力德高端水處理設(shè)備研發(fā)有限公司。

硅膠G板：美國Merck公司。

麻杏止咳糖漿樣品：批號分別為1806001、1806002、1806003，陜西德福康制藥有限公司。

甘草陰性樣品：陜西德福康制藥有限公司。

麻黃、苦杏仁陰性樣品：陜西德?？抵扑幱邢薰尽?/p>

鹽酸麻黃堿對照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為100%，批號為171241–201809，中國食品藥品檢定研究院。

鹽酸偽麻黃堿對照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.8%，批號為171237–201510，中國食品藥品檢定研究院。

苦杏仁苷對照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為88.2%，批號為110820–201808，中國食品藥品檢定研究院。

甘草酸單胺鹽對照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為96.2%，批號為110731–202021，中國食品藥品檢定研究院。

甘草對照藥材：批號為120904–201620，中國食品藥品檢定研究院。

乙腈：色譜純，德國西格瑪奧德里奇有限公司。

磷酸：優(yōu)級純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

實驗所用其它試劑均為分析純。

實驗用水為超純水。

1.2 混合對照品溶液配制

取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷各10.00 mg于同一50 mL容量瓶中，用色譜流動相稀釋至標(biāo)線，搖勻，即得各組分質(zhì)量濃度均為0.20 mg／mL的混合對照品溶液。

1.3 色譜條件

色 譜 柱：Phenyl-Ether柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：30℃；流動相：乙腈–0.02 mol／L磷酸溶液（含0.2%的三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）(體積比為5∶95），流量為1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：20 μL；檢測波長：210 nm；理論板數(shù)：按鹽酸麻黃堿計算應(yīng)不低于3 000。

1.4 樣品處理

精密量取麻杏止咳糖漿樣品10 mL于50 mL容量瓶中，加入色譜流動相30 mL，超聲45 min，加入色譜流動相稀釋至標(biāo)線，搖勻，微孔濾膜濾過，作為樣品溶液。

1.5 陰性樣品處理辦法

按照麻杏止咳糖漿處方工藝和處方量，制備未加甘草的對照樣品和未加麻黃、苦杏仁的陰性樣品，按樣品溶液的制備方法分別制成不含甘草、麻黃、苦杏仁的陰性樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 麻杏止咳糖漿中甘草成分的鑒別

參照中國藥典2015年版一部［7］中的提取方法和展開條件，原方法加熱提取時間較長，提取次數(shù)較多，造成試劑用量大、耗時長，故本試驗通過使用不同提取溶劑，將加熱回流改為超聲提取，減少正丁醇提取次數(shù)，建立和優(yōu)化的薄層色譜預(yù)處理方法，操作更加簡便。具體方法：分別取3個批號的麻杏止咳糖漿20 mL，加乙醚40 mL，超聲處理30 min，濾過，棄去醚液，向藥渣中加入甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，將濾液蒸干，向殘渣中加水40 mL使之溶解，用正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用水洗滌2次，棄去洗滌液，將正丁醇提取液蒸干，向殘渣中加入甲醇5 mL使之溶解，作為樣品溶液。另取甘草對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取甘草酸單銨鹽對照品，用甲醇溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度為2 mg／mL的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法（中國藥典2015年版通則0502），吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于用1%氫氧化鈉溶液制備的同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯–甲酸–冰乙酸–水（體積比為15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。樣品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置顯示相同的橙黃色熒光斑點；陰性對照樣品在此位置則沒有斑點。該方法色譜斑點清晰、專屬性較強(qiáng)，可作為本品中甘草的鑒別。

2.2 定量分析

2.2.1 色譜柱

參考中國藥典中麻黃含量測定標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)參考文獻(xiàn)［7–9］，分別考察了ZORBAX Eclipse XDB–C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Phenyl-Ether色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）兩種色譜柱。試驗結(jié)果表明：在同樣使用乙腈和0.02 mol／L磷酸溶液（含0.2%的三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）的流動相體系之下，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷3種成分在Phenyl-Ether色譜柱中可達(dá)到最佳分離效果，故本試驗使用Phenyl-Ether色譜柱。

2.2.2 色譜流動相

分別采用不同體積比的甲醇–水、乙腈–水為流動相對樣品進(jìn)行分離，分離度均不能滿足要求。參考文獻(xiàn)［4，13，17］，分別選擇乙晴–0.1%磷酸溶液（體積比為8∶92）、甲醇–水–乙酸（體積比為70∶28∶2）、乙腈–甲醇–0.1%磷酸溶液(體積比為4.5∶9∶86.5)、乙腈–0.02 mol／L磷酸（含0.2%的三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）（體積比為5∶95）4種流動相進(jìn)行試驗，結(jié)果表明，采用第4種流動相時，加入三乙胺使色譜峰形得到改善，拖尾減少，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷3種成分色譜峰得到良好分離，分離度大于1.5，且保留時間適中，基線平穩(wěn)，陰性對照樣品無干擾峰出現(xiàn)。故選擇乙腈–0.02 mol／L磷酸溶液（含0.2%的三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0） （體積比為5∶95）為色譜流動相。

2.2.3 提取溶劑

鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷3種有效成分在不同溶劑內(nèi)溶解性有很大的不同。分別以0.1%磷酸［3］、甲醇［4］、氨–乙醚［5］、鹽酸–甲醇［12］，70%甲醇［16］、無水乙醇、色譜流動相為提取溶劑，對麻杏止咳糖漿樣品進(jìn)行提取試驗，結(jié)果表明，采用色譜流動相提取樣品時，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷3種成分色譜峰與相鄰峰可完全分離，且提取率較高，因此選擇色譜流動相為提取溶劑。

2.2.4 樣品處理方法

利用色譜流動相作為提取溶劑，分別采取超聲15、30、45、60 min，加熱回流30、60、90 min，超聲30 min加回流30 min和不處理等方式進(jìn)行樣品處理試驗，經(jīng)含量測定發(fā)現(xiàn)，超聲提取45 min后提取含量較高且不再增大，且超聲提取方式比加熱回流操作簡單，提取時間更短，故選擇超聲提取45 min。

2.3 專屬性試驗

取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷對照品溶液，麻杏止咳糖漿樣品溶液，及甘草、麻黃、苦杏仁的陰性樣品溶液各適量，按1.3色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，各色譜峰分離良好，理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿計算大于3 000，陰性樣品在鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷對照品相應(yīng)色譜峰位置未檢出色譜峰。表明本方法系統(tǒng)適用性及專屬性均良好。色譜圖見圖1。

圖1 樣品、對照品、陰性樣品溶液色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取1.2所配制的混合對照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，在1.3色譜條件下進(jìn)行測定，以進(jìn)樣質(zhì)量（X，μg）為橫坐標(biāo)、對應(yīng)色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷的線性方程分別為Y=242.76X+25.63 3，Y=256.39X+12.727，Y=103.34X–19.34，線 性 相 關(guān) 系數(shù)分別為0.999 9、0.999 6、0.999 2，線性范圍分別為1.056～6.336 μg，1.003～6.018 μg，0.889～5.334 μg。

2.5 方法精密度

取同一批號麻杏止咳糖漿樣品6份（批號：1806001），按1.4方法制備成樣品溶液，在1.3色譜條件下進(jìn)行測定，測定結(jié)果列于表1。由表1可知，樣品中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷含量測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%、1.8%、1.6%，表明本方法重復(fù)性精密度良好。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗

取新制備的麻杏止咳糖漿樣品溶液（批號：1806001），于溶液配制后0、2、4、6、8 h按照本方法測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷，記錄色譜峰面積，計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表2。由表2可知，樣品溶液配制8 h內(nèi)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.1%、2.0%、1.6%，表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.7 加標(biāo)回收試驗

取10 mL麻杏止咳糖漿樣品（批號：1806001），按照本法測得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷的含量，加入適量對照品溶液，按照1.4方法處理后再次測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷的含量，計算回收率，結(jié)果列于表3。

表3 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

由表3可知，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和苦杏仁苷的回收率分別100.7%、98.5%、104.4%，表明本方法準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié)語

建立了麻杏止咳糖漿中甘草的定性鑒別方法及鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷3種成分的定量檢測方法，建立的方法簡便、可靠、準(zhǔn)確，可為麻杏止咳糖漿的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。