任云，胡俊平，于虹，顧曉甜

（1.邯鄲學(xué)院化學(xué)化工與材料學(xué)院，河北 邯鄲 056005；2.河北省雜環(huán)化合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 邯鄲 056005；3.邯鄲市有機(jī)小分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 邯鄲 056005）

核桃（Juglans regia L.）又稱胡桃，是人們?nèi)粘Ｊ秤梅浅Ｆ毡榈母晒?。核桃殼即核桃去仁后的木質(zhì)外殼，質(zhì)地堅(jiān)硬、多孔且無毒，傳統(tǒng)工業(yè)上主要用來作為拋光材料和過濾材料?，F(xiàn)代化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，核桃殼中含多種化合物，包括酚類、苷類、苯丙酸類、酯類、黃酮類等，具有降脂、抗腫瘤等生物活性[1]。何春梅等[2]用超聲輔助提取核桃殼色素中的多酚，利用超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）分析得出核桃殼多酚主要包括酚酸類和黃酮類兩大部分。酚酸化合物中含有咖啡酸和原兒茶酸，黃酮類化合物中檢測(cè)到3種化合物含量較高，分別為蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷。核桃殼色素作為天然色素，使用安全，具有一定的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，其色素提取與開發(fā)正成為研究熱點(diǎn)，李維莉[3]按料液比1∶6（g/mL）加入核桃殼粉末和乙醇，控溫80℃，利用超聲波輔助提取2次，用AB-8樹脂進(jìn)行吸附，最后用50%乙醇洗脫，到了核桃殼色素。孫海濤等[4]利用超聲波-微波聯(lián)合輔助提取核桃殼色素多酚，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比為1∶20（g/mL）、超聲功率405W、微波功率200W條件下，提取率達(dá)2.361%。郭瑜等[5]對(duì)核桃殼色素提取物的DPPH·、·OH、H2O2和 O2-·的清除率及總抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核桃殼乙醇提取物及其氯仿相均具有清除自由基和體外抗氧化活性?，F(xiàn)在提取方法多采用超聲或微波輔助，發(fā)揮超聲波振動(dòng)空化作用及微波高能作用，但微波輔助設(shè)備要求高，不如超聲輔助工業(yè)化易實(shí)現(xiàn)。本文利用超聲輔助提取核桃殼色素，并表征其性能，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供直接數(shù)據(jù)支撐，拓展核桃殼色素在食品、紡織、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。此外提取后的殘?jiān)钥捎糜谄渌I(yè)生產(chǎn)，如制備工業(yè)吸附劑[6-7]，提高核桃殼綜合利用度。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

核桃殼：采自河北涉縣；95%乙醇（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；三氯化鐵、氯化鈣、氯化鈉、氯化鋁（均為分析純）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；無水硫酸銅、硫酸鎂、硫酸鋅、氯化鉀、抗壞血酸（vitamin C，VC）、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀（均為分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

KO-500DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；800型離心沉淀器：濟(jì)南市醫(yī)療機(jī)械廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

通過前期預(yù)試驗(yàn)，核桃殼經(jīng)干燥、粉碎后過40目篩得核桃殼粉。精確稱取核桃殼粉1.00 g，按料液比為1∶10（g/mL）加入提取劑，提取劑為濃度50%的乙醇水溶液，提取溫度50℃，提取60 min，超聲功率500 W。靜置，取上清液，3 000 r/min離心15 min，進(jìn)一步取上清液，稀釋至核桃殼生藥濃度為0.002 g/mL，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)得提取液最大吸收波長(zhǎng)及其相應(yīng)吸光度。

分別以提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、95%）、提取時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]作為單因素，考察各影響因素對(duì)提取液吸光度的影響。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量為提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。自變量取值如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Response surface test factor level

采用Design expert對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到二次回歸方程和誤差分析及各影響因素之間的交互作用，并確定最優(yōu)工藝條件[8]。

取20 g核桃殼粉末，以最優(yōu)工藝進(jìn)行色素提取，所得提取液經(jīng)50℃濃縮、干燥至恒重，研磨得核桃殼色素粉，稱重并按如下公式計(jì)算色素產(chǎn)率。

色素產(chǎn)率/%=（色素質(zhì)量/核桃殼干粉末質(zhì)量）×100

1.2.3 核桃殼色素性能表征

1.2.3.1 金屬離子對(duì)核桃殼色素的影響

取蒸餾水將核桃殼色素粉配制成濃度為1.0 mg/mL溶液，分別取8份1.00 mL溶液于25 mL容量瓶中，分別用濃度均為 0.05 mol/L 的 CuSO4、MgSO4、CaCl2、NaCl、FeCl3、AlCl3、ZnSO4、KCl溶液定容，室溫 20 ℃放置 24 h測(cè)定溶液最大吸收波長(zhǎng)及吸光度[9]。

1.2.3.2 核桃殼色素對(duì)DPPH自由基的清除率

配制濃度為2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液，核桃殼色素粉和維生素C分別配制濃度為5、10、15、20、25、30 μg/mL的水溶液。按文獻(xiàn)[10]的方法及公式測(cè)定色素及VC的DPPH自由基清除率。

1.2.3.3 核桃殼色素還原力的測(cè)定

取核桃殼色素粉和VC分別用蒸餾水配制濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL 的溶液，取各溶液 2.5 mL于25 mL錐形瓶中，加0.2 mol/L pH6.6磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，搖勻于50℃水浴20 min后快速冷卻，加10%三氯乙酸溶液2.5 mL，搖勻后以3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加1 g/L的三氯化鐵溶液2.5 mL搖勻，室溫20℃靜置10 min，于700 nm處測(cè)定吸光度[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

核桃殼提取物紫外可見掃描光譜結(jié)果如圖1所示。

圖1 核桃殼提取物紫外可見吸收光譜Fig.1 The ultraviolet absorption spectrogram of walnut shell extract

由圖1可知，在250 nm～350 nm波段掃描核桃殼提取液，測(cè)得其最大吸收波長(zhǎng)為279 nm，以此為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定提取液吸光度表征色素濃度。

提取溫度對(duì)核桃殼提取液吸光度的影響如圖2所示。

圖2 提取溫度對(duì)核桃殼提取液吸光度的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on absorbance of walnut shell extract

由圖2可知，提取液吸光度隨著溫度變化先升高后降低，一般而言升高溫度有利于溶出提取，但溫度升高可能會(huì)使部分色素分解或聚合形成沉淀。在溫度為50℃時(shí)，提取液吸光度到達(dá)最大值，由此確定響應(yīng)面試驗(yàn)提取溫度為40、50、60℃。

乙醇濃度對(duì)核桃殼提取液吸光度的影響如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對(duì)核桃殼色素吸光度的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the absorbance of walnut shell extract

由圖3可知，提取液吸光度隨著乙醇濃度的變化先減小，后增大，再減小，根據(jù)相似相容原理，最佳提取所需乙醇濃度在50%附近，因此確定響應(yīng)面法試驗(yàn)中乙醇濃度為45%、50%、55%。

提取時(shí)間對(duì)核桃殼提取液吸光度的影響如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)核桃殼色素吸光度的影響Fig.4 Effect of extraction time on absorbance of walnut shell extract

由圖4可知，前30 min內(nèi)吸光度隨著提取時(shí)間的增加變化不大，甚至在20 min時(shí)出現(xiàn)降低波動(dòng)，可能原因是提取液還未能完全浸透物料。提取開始20 min后吸光度呈線性增加，應(yīng)是物料完全浸透后提取時(shí)間越長(zhǎng)，析出色素含量越高。由于色素含量有限，到達(dá)一定時(shí)間后，曲線應(yīng)趨于平緩，此試驗(yàn)并未出現(xiàn)吸光度極大值，說明應(yīng)延長(zhǎng)提取時(shí)間，但繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間會(huì)降低效率，因此確定最佳提取時(shí)間為60 min，響應(yīng)面法試驗(yàn)提取時(shí)間為 55、60、65 min。

料液比對(duì)核桃殼提取物吸光度的影響如圖5所示。

圖5 料液比對(duì)核桃殼提取液吸光度的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on the absorbance of walnut shell extract

由圖5可知，提取液吸光度隨溶劑增加變化平緩，表明料液比1∶10（g/mL）時(shí)，溶劑已經(jīng)足量，再增加溶劑無助于色素提取且成本增加，減少溶劑則核桃殼粉無法被充分潤(rùn)濕，因此可固定料液比為1∶10（g/mL），并且料液比不作為響應(yīng)面法試驗(yàn)的影響因素。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

對(duì)表2數(shù)據(jù)用ANOVA進(jìn)行回歸分析，得到二次回歸方程：吸光度=0.54-2.875×10-3A-0.037B+0.018C-0.032AB+3.5×10-3AC+0.025BC-0.030A2+0.024B2+2.25×10-3C2。方差分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面誤差分析結(jié)果Table 3 Response surface error analysis results

對(duì)模型的誤差分析可得：模型P=0.029，差異顯著，失擬誤差P=0.0674為不顯著。其中，AB、A2對(duì)核桃殼色素的提取影響顯著；B乙醇濃度對(duì)提取液吸光度影響極顯著。主要影響因素順序?yàn)橐掖紳舛龋咎崛r(shí)間＞提取溫度。該模型的C.V.=4.69%，說明該模型的置信度良好。該模型的R2adj=0.880 4、R2=0.854 3，說明提取液吸光度的影響85.43%來源于乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度。綜上說明回歸方程模型合理，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，所得模型方程可以預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 響應(yīng)面各影響因素間交互作用

2.3.1 提取時(shí)間和提取溫度交互作用

提取時(shí)間和提取溫度響應(yīng)面曲線見圖6。

圖6 提取時(shí)間和提取溫度響應(yīng)面曲線圖Fig.6 Extraction time and temperature response surface graphs

由圖6可知，此響應(yīng)面變化趨勢(shì)平緩，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，吸光度隨著提取溫度增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度一定時(shí)，吸光度隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)稍有增加。提取時(shí)間和提取溫度的交互作用對(duì)核桃殼提取液吸光度值影響不顯著，P=0.788 9＞0.05。

2.3.2 乙醇濃度和提取溫度交互作用

乙醇濃度和提取溫度響應(yīng)面曲線見圖7。

圖7 乙醇濃度和提取溫度響應(yīng)面曲線圖Fig.7 Curve of ethanol concentration and temperature response surface

由圖7可見，乙醇濃度在45%附近時(shí)，吸光度隨提取溫度增加變化顯著，更有利于提取。乙醇濃度和提取溫度的交互作用對(duì)核桃殼色素提取液吸光度影響顯著，P=0.039 6＜0.05。

2.3.3 提取時(shí)間和乙醇濃度交互作用

提取時(shí)間和乙醇濃度響應(yīng)面曲線見圖8。

圖8 提取時(shí)間和乙醇濃度響應(yīng)面曲線圖Fig.8 Curve of response surface of extraction time and ethanol concentration

由圖8可知，提取時(shí)間一定時(shí)，提取液吸光度隨乙醇濃度增加緩慢降低。乙醇濃度在45%附近時(shí)，吸光度隨時(shí)間變化不明顯，且此時(shí)吸光度較高。乙醇濃度在55%附近時(shí)，吸光度隨時(shí)間增加而增加，但總體低于45%附近。以上均表明乙醇濃度為顯著影響因素，且其最優(yōu)值應(yīng)在45%附近。提取時(shí)間和乙醇濃度交互作用不顯著，P=0.0847＞0.05。

2.4 響應(yīng)面最優(yōu)工藝篩選與驗(yàn)證

用Design expert中Solutions分析，擬定最優(yōu)工藝為乙醇濃度47%、提取溫度51.53℃、提取時(shí)間55 min，預(yù)測(cè)最佳條件下提取液吸光度為0.613。

結(jié)合實(shí)際工藝操作，確定乙醇濃度47%、提取溫度51℃、提取時(shí)間55 min為最優(yōu)提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證，得最佳工藝下提取液吸光度為0.614，色素產(chǎn)率為1.65%。

2.5 核桃殼色素性能表征

2.5.1 金屬離子對(duì)核桃殼色素的影響

金屬離子對(duì)核桃殼色素的影響如表4所示。

表4 金屬離子對(duì)核桃殼色素的影響Table 4 Effect of metal ions on the pigment of walnut shell

由表4可知，加入Fe3+、Cu2+溶液都使原液渾濁，說明這兩種離子對(duì)核桃殼色素的結(jié)構(gòu)有所影響；Al3+溶液吸光度較其他離子溶液大，色素溶液顏色加深，但不影響色素應(yīng)用；Mg2+、Na+、Zn2+溶液的加入使得原液的波峰位置偏移，但變化細(xì)微對(duì)吸光度及外觀影響可以忽略；Ca2+、K+的加入對(duì)原液沒有影響。因此該色素在使用時(shí)應(yīng)注意避免接觸Fe3+、Cu2+。

2.5.2 核桃殼色素DPPH自由基清除能力

以VC為對(duì)照，核桃殼色素DPPH自由基清除能力如圖9所示。

圖9 DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH radical scavenging rate

由圖9可知，核桃殼色素對(duì)DPPH自由基具有一定清除能力，且濃度越大，DPPH自由基清除能力越大強(qiáng)，但總體較VC弱。在配制濃度為25 μg/mL時(shí)清除率已達(dá)臨界值73%，此時(shí)實(shí)際溶液體系中核桃殼色素濃度為 12.5 μg/mL，DPPH 濃度為 0.1 mmol/L。

2.5.3 核桃殼色素還原力

以VC為對(duì)照，核桃殼色素還原力如圖10所示。

圖10 核桃殼色素還原力Fig.10 Reducing power of walnut shell pigment

由圖10可知，核桃殼色素具有一定還原能力，且濃度越大吸光度越高，則對(duì)應(yīng)還原力越強(qiáng)，但總體較VC弱。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，考察了影響核桃殼色素提取液吸光度的主要因素為乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比。結(jié)果顯示：前3個(gè)因素對(duì)色素提取影響較大。提取時(shí)間包含了物料浸潤(rùn)時(shí)間，提取時(shí)間應(yīng)大于30 min，料液比對(duì)提取影響較小，其可固定為 1∶10（g/mL）。運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件，得到影響因素順序?yàn)橐掖紳舛?提取時(shí)間>提取溫度，并獲得二次回歸模型，確定最優(yōu)提取條件為乙醇濃度47%、提取溫度51℃、提取時(shí)間55 min，此時(shí)色素的提取產(chǎn)率為1.65%。利用最佳條件下獲得的色素，測(cè)定其對(duì)Fe3+、Cu2+、Mg2+、Na+、Al3+、Zn2+、Ca2+、K+等金屬離子穩(wěn)定性，結(jié)果表明，除Fe3+和Cu2+外，其他離子對(duì)其影響較小或沒有影響。以VC為對(duì)照，測(cè)定色素DPPH自由基清除能力和還原力，結(jié)果表明，該色素具有一定的DPPH自由基清除能力和還原能力，但均較VC弱。綜上，核桃殼作為原料提取色素工藝條件易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化并可達(dá)到一定提取產(chǎn)率，所得色素對(duì)多數(shù)金屬離子穩(wěn)定且有清除自由基及抗氧化能力。