奶油栓孔菌的鑒定及其生物學(xué)特性

郝金斌，孟國良，吳龍?jiān)?，葉麗云，吳小平

(福建農(nóng)林大學(xué) 菌物研究中心，福建 福州 350002)

奶油栓孔菌(Trameteslactinea)是一種白色腐生菌，隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)蘑菇綱(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)栓孔菌屬(Trametes)，主要分布在中國、馬來西亞、印度尼西亞、菲律賓、巴基斯坦、印度、澳大利亞等國家[1-2]。奶油栓孔菌喜生長于闊葉樹木材上，利用其菌絲分泌的胞外酶降解木材中的木質(zhì)素、纖維素及半纖維素等形成養(yǎng)分，參與生態(tài)系統(tǒng)的再循環(huán)過程，對維持生態(tài)系統(tǒng)平衡起著關(guān)鍵作用[3]。同時(shí)，奶油栓孔菌能增強(qiáng)天麻等蘭科植物種子的萌發(fā)能力，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]。研究表明，奶油栓孔菌含有肽、甾體、萜類、黃酮、酚類和糖類化合物[5-6]等，具有豐富的營養(yǎng)成分。在生物活性方面，奶油栓孔菌具有提高免疫力[7]、降血糖[8-9]和抗癌[10]能力，且其子實(shí)體多糖對酒精性肝損傷具有一定的預(yù)防效果[11]。大型真菌主要依靠外觀形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法來進(jìn)行分類鑒定，但真菌表觀形態(tài)易受環(huán)境影響，同一物種的形態(tài)可能呈現(xiàn)較大差異。分子生物學(xué)技術(shù)受環(huán)境影響較小，準(zhǔn)確性高，目前用于真菌分類鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)主要有ITS[12-13]、AFLP[14]、RFLT[15]、RAPD[16]等，其中ITS序列分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于微生物菌種的分類鑒定及親緣關(guān)系分析等方面[17-19]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于奶油栓孔菌遺傳多樣性以及其菌絲體提取物的抗氧化能力、抑菌活性等方面的研究尚未見報(bào)道，并且奶油栓孔菌野生資源較少，對其培養(yǎng)條件方面的探究也鮮見報(bào)道，人工培養(yǎng)技術(shù)的不成熟，導(dǎo)致出菇困難，故其資源利用程度很低。為此，本研究對采自福建省南平市浦城縣的一株奶油栓孔菌進(jìn)行分類鑒定和遺傳多樣性分析，并在此基礎(chǔ)上開展生物學(xué)特性試驗(yàn)，進(jìn)一步探究其生長的最適條件，并對不同時(shí)期奶油栓孔菌提取物的抗氧化活性和抑菌活性進(jìn)行探究，以期為奶油栓孔菌資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 奶油栓孔菌菌株DKJ子實(shí)體，采自福建省南平市浦城縣(118°54′E，28°02′N)，將其分離純化培養(yǎng)的菌絲保存于福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心。

1.1.2 主要儀器、試劑與培養(yǎng)基 PCR擴(kuò)增儀(Mycycler型)，美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī)(ST16R型)，美國Thermo公司；電熱恒溫水浴鍋 (HWS12型)，上海一恒科技儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z型)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；真空冷凍干燥機(jī)(松源LGJ-12)、超凈工作臺(SW-CJ-2F型)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；顯微鏡(BX51型)，日本Olympus Opto-Technology有限公司。

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸(VC)，購自Solarbio公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，購自Sigma公司；果糖、葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨等作為碳源、氮源的試劑，均為國產(chǎn)分析純。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)：新鮮土豆(削皮)200 g，加水煮沸30 min，4層紗布過濾，濾液加入葡萄糖20 g充分溶解，加水定容至1 000 mL，pH自然。馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)：新鮮土豆(削皮)200 g，加水煮沸30 min，4層紗布過濾，濾液加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，充分溶解后加水定容至1 000 mL，pH自然。碳源試驗(yàn)培養(yǎng)基、氮源試驗(yàn)培養(yǎng)基、pH試驗(yàn)培養(yǎng)基、溫度試驗(yàn)培養(yǎng)基和正交試驗(yàn)培養(yǎng)基，均參照張峰等[20]和魯鐵等[21]的方法配制。

1.2 奶油栓孔菌的鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 參照李海蛟[1]的方法對供試菌株DKJ及其子實(shí)體進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。挑取試管保藏菌株的菌塊置于PDA平板上活化，待菌絲長滿平板后，用直徑0.5 cm的打孔器打孔，將菌塊接種到PDA平板正中央，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察菌落特征。用插片法[22]觀察菌絲的顯微結(jié)構(gòu)，將滅菌蓋玻片傾斜45°插入距離菌塊2 cm的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8 d后取出蓋玻片，于顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)特征。用Melzer試劑、棉蘭試劑和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的KOH試劑處理菌絲體，觀察菌絲體有無變化。待產(chǎn)孢后收集孢子，在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)，并拍照記錄。觀察子實(shí)體的形狀、大小、顏色、菌蓋表面特征(即是否有絨毛、環(huán)紋環(huán)溝、疣和凸起等)，以及是否有特殊氣味和味道等。

1.2.2 ITS序列分析 (1)ITS序列擴(kuò)增與測序。采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，使用真菌ITS引物對待測菌株DNA進(jìn)行PCR序列擴(kuò)增, 真菌ITS引物ITS1的序列為：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4的序列為：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)體系為：ITS1和ITS2引物各1 μL，2×TaqMaster Mix(含有10×TaqBuffer、dNTP和TaqDNA聚合酶)12.5 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至福州擎科生物有限公司測序。

(2)ITS序列分析。在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上對測序菌株的rDNA ITS序列進(jìn)行同源比較，篩選同源性較高的rDNA ITS序列和其他種屬真菌的rDNA ITS序列[23]，采用MEGA 6.0軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，運(yùn)行1 000次以bootstrap檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性[24-25]，并根據(jù) Kimura 2-parameter模型[26]計(jì)算各菌種rDNA ITS序列之間的進(jìn)化距離，判斷供試菌株的分類地位。最后對供試菌株和NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的來自全球不同地區(qū)的21個(gè)奶油栓孔菌的rDNA ITS序列進(jìn)行界定，除去5′端18S rDNA序列和3′端28S rDNA序列后保留ITS1-5.8S-ITS2序列，對所有ITS1-5.8S-ITS2序列進(jìn)行多重比對，并對比對結(jié)果進(jìn)行人工修正處理。

1.3 奶油栓孔菌的生物學(xué)特性研究

1.3.1 碳源試驗(yàn) 分別以葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精粉和麥芽糖為碳源制作碳源培養(yǎng)基，將活化的DKJ菌株接種于各種碳源培養(yǎng)基中，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理4個(gè)重復(fù)。接種后，每隔24 h觀察1次菌落特征和菌絲長勢(菌絲長勢根據(jù)菌落特征和菌絲生長速率綜合判斷)，利用十字交叉法測量并記錄菌落直徑。

1.3.2 氮源試驗(yàn) 分別以蛋白胨、酵母浸粉、磷酸氫二銨、硝酸銨、尿素和牛肉膏為氮源制作氮源培養(yǎng)基，將活化的DKJ菌株接種在各種氮源培養(yǎng)基中，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理4個(gè)重復(fù)。觀察和測量方法同1.3.1節(jié)。

1.3.3 pH試驗(yàn) 配制pH值分別為4.0，5.0，6.0，7.0和8.0的pH試驗(yàn)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基滅菌后用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值)，將活化的DKJ菌株接種于不同pH值的培養(yǎng)基中，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理4個(gè)重復(fù)。觀察和測量方法同1.3.1節(jié)。

1.3.4 溫度試驗(yàn) 將活化的DKJ菌株接種于溫度培養(yǎng)基中，分別置20，25，30，35和40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理4個(gè)重復(fù)。觀察和測量方法同1.3.1節(jié)。

1.3.5 正交試驗(yàn) 依據(jù)碳源、氮源、溫度和pH的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇各因素最優(yōu)的3個(gè)水平設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表1所示，試驗(yàn)觀察和測量方法同1.3.1節(jié)。

表1 奶油栓孔菌菌絲生長影響因素的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Orthogonal experimental design of factors affecting mycelium growth of Trametes lactinea

1.4 奶油栓孔菌的生物活性研究

1.4.1 菌絲體和子實(shí)體獲取 將活化的奶油栓孔菌DKJ菌株接種于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)8 d，收集菌絲體冷凍干燥后得菌絲體干品，子實(shí)體由本實(shí)驗(yàn)室馴化栽培，經(jīng)烘箱干燥后，所有樣品粉碎過孔徑為0.9 mm的篩備用。

1.4.2 抗氧化活性測定 (1)水提物制備。分別稱取奶油栓孔菌菌絲體和子實(shí)體粉末，按照料液比1∶15(g∶mL)加去離子水，90 ℃提取4 h，8 000 r/min離心5 min，收集提取液，冷凍干燥得菌絲體水提物(TLMWE)和子實(shí)體水提物(TLFWE)干品，用于抗氧化活性測定。

(2)抗氧化活性測定。分別配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL的奶油栓孔菌菌絲體和子實(shí)體水提物溶液，用于抗氧化活性測定試驗(yàn)，同時(shí)以抗壞血酸為陽性對照。其中羥基自由基清除活性參照金珊珊等[22]的方法測定，DPPH自由基、ABTS自由基清除活性以及鐵離子還原能力參照郝金斌等[11]的方法測定。

1.4.3 抑菌活性測定 (1)乙酸乙酯提取物的制備。分別稱取奶油栓孔菌菌絲體和子實(shí)體粉末，按照料液比1∶15(g∶mL)加乙酸乙酯，在超聲功率150 W和室溫條件下提取30 min，8 000 r/min離心5 min,收集提取液，提取2次后濃縮得乙酸乙酯提取物，用于抑菌活性測定。

(2)抑菌活性測定。采用濾紙片法[22]，將圓形滅菌濾紙片(直徑6 mm)放入質(zhì)量濃度15 mg/mL的乙酸乙酯提取物溶液(加二甲基亞砜助溶于水)中，浸泡0.5 h備用。分別取100 μL 1×106CFU/mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌菌懸液，撒在固體瓊脂平板上，用涂布棒涂勻，將浸泡在提取物溶液中的濾紙片平鋪于涂菌平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，以2 mg/mL卡那霉素水溶液為陽性對照，二甲基亞砜水溶液為陰性對照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 20.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P<0.05和P<0.01分別表示不同處理間的顯著差異和極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶油栓孔菌的形態(tài)學(xué)特征

奶油栓孔菌的形態(tài)學(xué)特征如圖1所示。

A.野生子實(shí)體；B、C.菌落形態(tài)；D.菌絲體特征；E、F.產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；G.孢子形態(tài) A.Wild fruiting body;B，C.Colonial morphology;D.Feature of mycelia;E，F(xiàn).Conidiogenous structures;G.Conidiophores

由圖1-A可知，DKJ子實(shí)體比較厚大，菌蓋圓形或貝殼形，表面顏色為奶油色至灰色、黃褐色，表面光滑或有瘤狀物，無致密絨毛，菌蓋直徑為4.0～6.5 cm，厚0.4～0.8 cm；菌柄較短且粗壯，光滑有白色微絨毛，有或無不規(guī)則突起。所有子實(shí)體新鮮時(shí)表皮濕潤，呈水浸狀，有折光；干燥后質(zhì)量明顯減輕，并且無臭無味。DKJ菌株菌落為圓形，菌絲生長前期為白色，呈現(xiàn)絨毛狀，以接種塊為中心向外呈輻射狀延伸生長(圖1-B)；生長后期菌落為乳白色，無明顯環(huán)紋(圖1-C)，有大量分生孢子產(chǎn)生。在整個(gè)生長過程中，菌絲在Melzer、棉藍(lán)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% KOH試劑中均無變色反應(yīng)。顯微鏡下觀察菌絲無色壁薄，無明顯隔膜，分枝較多，且多見鎖狀聯(lián)合(圖1-D)，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)基部擬橢圓形(圖1-E)或彎月形(圖1-F),單個(gè)分生孢子呈橢球形、臘腸形或圓柱形，大小為(1.7～3.5) μm×(5～12) μm，孢子多呈長鏈狀(圖1-G)。經(jīng)查閱，DKJ菌株的以上特征與李海蛟[1]和《中國真菌志》[2]所描述的奶油栓孔菌的形態(tài)特征基本吻合，初步判定DKJ菌株為奶油栓孔菌。

2.2 奶油栓孔菌的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

對菌株DKJ的rDNA ITS區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，獲得618 bp的DNA片段，將獲得的ITS序列(NCBI登錄號：MT982697)在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST在線比對，發(fā)現(xiàn)其與奶油栓孔菌MH910526的rDNA ITS序列最為接近，相似度超過99%。以茯苓(KT693239)為外群，引入其他8株同源性較高的栓孔菌屬真菌的rDNA ITS序列，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株DKJ和奶油栓孔菌(Trameteslactinea)的親緣關(guān)系極其相近，以99%的bootstrap值聚為一族，遺傳距離僅為0.006，而與其他栓孔菌屬真菌的遺傳距離較遠(yuǎn)。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定DKJ菌株為奶油栓孔菌(Trameteslactinea)。

圖2 9株栓孔菌rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 9 Trametes strains based on rDNA ITS sequence

2.3 奶油栓孔菌的遺傳多樣性

為了探究奶油栓孔菌在自然界中的進(jìn)化水平，本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載不同地域的奶油栓孔菌ITS序列(不同地域奶油栓孔菌的ITS序列總長度為521～589 bp)，基于ITS1-5.8S-ITS2序列進(jìn)一步對包括DKJ菌株在內(nèi)的22株奶油栓孔菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果見表2。由表2可知，各菌株ITS1序列長度變化較大，ITS1序列長度為165～233 bp；所有菌株5.8S序列長度均為158 bp；ITS2序列長度為187～198 bp，且僅有菌株9V7/2和DPS-9的ITS2序列長度分別為197和187 bp，其他菌株均為198 bp。對ITS1-5.8S-ITS2序列堿基組成的分析發(fā)現(xiàn)，ITS1、5.8S 和ITS2的GC含量分別為46.77%～52.00%，46.20%～47.47%，50.76%～53.48%，其中ITS1和ITS2序列GC含量的變化稍大，5.8S序列GC含量的變化較小，表現(xiàn)相對穩(wěn)定。本研究還發(fā)現(xiàn)，22株奶油栓孔菌ITS1-5.8S-ITS2序列共測得590個(gè)堿基位點(diǎn)，其中保守位點(diǎn)549個(gè)、變異位點(diǎn)38個(gè)、自裔位點(diǎn)27個(gè)、簡約信息位點(diǎn)8個(gè)，序列變異率達(dá)到6.44%。綜上可知，不同地域的奶油栓孔菌存在較明顯的遺傳分化，說明奶油栓孔菌在自然界具有一定的遺傳多樣性。

2.4 奶油栓孔菌的生物學(xué)特性

2.4.1 碳 源 由表3可知，奶油栓孔菌菌絲體在6種碳源培養(yǎng)基中均能較好生長，其中在以果糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲體生長速度最快，長勢最好；其次是以蔗糖、葡萄糖和麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基。與其他碳源培養(yǎng)基相比，在以葡萄糖和蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中,奶油栓孔菌菌絲生長最為濃密厚實(shí);而在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中，菌絲生長較密集，但長勢一般；在以糊精粉、可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中，奶油栓孔菌菌絲長勢較弱且生長稀疏，生長速度較為緩慢。因此最終選擇以果糖、葡萄糖和蔗糖為碳源進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表3 不同碳源對奶油栓孔菌菌絲生長的影響 Table 3 Effects of different incubation carbon sources on mycelial growth of Trametes lactinea

2.4.2 氮 源 氮源主要用于機(jī)體內(nèi)含氮化合物的合成。由表4可知，不同氮源培養(yǎng)基對奶油栓孔菌菌絲體生長的影響不同，其中在以酵母浸粉作為氮源時(shí)，奶油栓孔菌菌絲濃密，生長速度最快，長勢最好；在以蛋白胨和牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲長勢一般，生長速度無顯著差異；以硝酸銨和磷酸氫二銨為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲生長緩慢，長勢較差；在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中，菌絲幾乎不能生長，這可能是尿素在菌絲體生長過程中產(chǎn)生了一定的毒害作用，導(dǎo)致機(jī)體生命活動不能正常進(jìn)行。因此，最終選擇以酵母浸粉、牛肉膏和蛋白胨為氮源進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表4 不同氮源對奶油栓孔菌菌絲生長的影響 Table 4 Effects of different incubation nitrogen sources on mycelial growth of Trametes lactinea

2.4.3 pH 由表5可以看出，奶油栓孔菌菌絲體生長速率在pH為4.0～8.0時(shí)具有極顯著差異，隨著pH值逐漸升高，菌絲生長速率呈先升高后下降趨勢；當(dāng)pH為8.0時(shí)，奶油栓孔菌菌絲生長速率最小(4.07 mm/d)，菌絲長勢最弱； pH值為7.0時(shí)，菌絲較密但菌絲長勢一般； pH值為4.0和5.0時(shí)，菌絲長勢強(qiáng)，菌絲濃密，且以pH為5.0時(shí)的菌絲生長速率最快，達(dá)到10.42 mm/d。由此可見，奶油栓孔菌菌絲生長偏好于酸性環(huán)境，因此選擇以pH值為4.0，5.0和6.0進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表5 不同pH對奶油栓孔菌菌絲生長的影響Table 5 Effects of incubation pH on mycelial growth of Trametes lactinea

2.4.4 溫 度 由表6可知，奶油栓孔菌菌絲體對溫度的適應(yīng)范圍較廣，在20～40 ℃的溫度條件下均能生長。隨著培養(yǎng)溫度升高，菌絲生長速度呈先增加后降低的趨勢； 20 ℃時(shí)菌絲生長速度最慢，為2.79 mm/d，菌絲稀疏，長勢弱；在30 ℃培養(yǎng)時(shí)，菌絲濃密，長勢強(qiáng)，生長速度較快；在35 ℃培養(yǎng)時(shí)，菌絲生長速率達(dá)到峰值(10.79 mm/d)，菌絲密，長勢強(qiáng)；在40 ℃培養(yǎng)時(shí)，菌絲生長速率可能受到過高溫度的影響而開始下降，菌絲較密，但長勢變?nèi)酢Ｓ纱丝梢?，培養(yǎng)溫度對奶油栓孔菌菌絲生長有很大影響，最終選擇以培養(yǎng)溫度為30，35和40 ℃進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表6 不同溫度對奶油栓孔菌菌絲生長的影響 Table 6 Effects of different incubation temperatures on mycelial growth of Trametes lactinea

2.4.5 奶油栓孔菌培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn) 基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，從4個(gè)因素中各選取效果較好的3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，通過正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，從各試驗(yàn)方案及其結(jié)果(表7)可以看出，極差(R)最大的是溫度，為2.58；極差從大到小依次表現(xiàn)為溫度、氮源、pH、碳源，說明4因素對奶油栓孔菌菌絲生長的影響大小依次為溫度>氮源>pH>碳源。從均值(k)來看，碳源k3、氮源k1、溫度k2和pHk2均大于各自其他水平，所以奶油栓孔菌菌絲生長的最適培養(yǎng)條件組合為以蔗糖為碳源、酵母浸粉為氮源，pH為5，培養(yǎng)溫度為35 ℃。

表7 奶油栓孔菌菌絲生長影響因素的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Orthogonal experimental results of factors affecting mycelium growth of Trametes lactinea

對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果(表8)表明，各因素對奶油栓孔菌菌絲生長速率均有顯著影響，其差異顯著性大小依次表現(xiàn)為溫度>氮源>pH>碳源，與直觀分析結(jié)果一致。

表8 奶油栓孔菌菌絲生長影響因素正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal test of factors affecting mycelium growth of Trametes lactinea

2.5 奶油栓孔菌的抗氧化活性

奶油栓孔菌子實(shí)體和菌絲體水提物的抗氧化活性如圖3所示。由圖3可知，奶油栓孔菌子實(shí)體和菌絲體水提物對羥基自由基、DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除能力，對鐵離子也具有一定的還原能力；菌絲體水提物的抗氧化活性顯著強(qiáng)于子實(shí)體時(shí)期(P<0.05)，特別是其菌絲體水提物對ABTS自由基的清除率高達(dá)99.05%，與陽性對照無顯著差異(P>0.05)。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences among treatments(P<0.05)

2.6 奶油栓孔菌的抑菌活性

由表9可知，奶油栓孔菌子實(shí)體和菌絲體乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌均具有一定的抑制作用，并且對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)的抑制效果略優(yōu)于革蘭氏陰性菌(銅綠假單胞菌)。與菌絲體提取物相比，奶油栓孔菌子實(shí)體提取物的抑菌活性顯著升高(P<0.05)，其對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為14.71，11.48和11.49 mm，但該提取物抑菌活性物質(zhì)的組成還有待進(jìn)一步研究。

表9 奶油栓孔菌乙酸乙酯提取物的抑菌活性Table 9 Antibacterial activity of ethyl acetate extracts from Trametes lactinea

3 討 論

真菌的形態(tài)分類易受外界環(huán)境影響，單純利用形態(tài)鑒定真菌類別還存在一定的局限性[27]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從分子水平對物種進(jìn)行鑒定被越來越多的研究所應(yīng)用[26-30]，其中ITS(internally transcribed spacer)序列對大型真菌的鑒定有更高的準(zhǔn)確度和靈敏度，因此在物種鑒定方面得到了廣泛應(yīng)用[31]。本研究通過形態(tài)學(xué)觀察并結(jié)合ITS序列分析，鑒定該株采自福建省南平市浦城縣的白色多孔菌DKJ菌株為奶油栓孔菌。李海蛟[1]在對中國栓孔菌屬進(jìn)行分類和系統(tǒng)發(fā)育研究時(shí)，將奶油栓孔菌歸入栓孔菌屬，而栓孔菌屬內(nèi)所有種可以形成11個(gè)分枝，奶油栓孔菌位于第8分枝，其中包括奶油栓孔菌(Trameteslactinea)、馬尼拉栓孔菌(Trametesmanilaensis)、東方栓孔菌(Trametesorientalis)、古巴栓孔菌(Trametescubescens)、粉灰栓孔菌(Trametesmenziesii)。

遺傳多樣性是指種內(nèi)基因的變化，包括種內(nèi)顯著不同于種群間和同一種群內(nèi)的遺傳變異[32]。遺傳多樣性可反映物種的遺傳背景和潛在利用價(jià)值。遺傳多樣性越高，其遺傳變異就越豐富，說明物種適應(yīng)環(huán)境的能力也就越強(qiáng)。因此，針對遺傳多樣性的研究對物種保護(hù)以及確定優(yōu)先保護(hù)種、篩選優(yōu)良種質(zhì)具有重要的理論意義和實(shí)際價(jià)值[33-34]。本研究基于ITS1-5.8S-ITS2序列，對菌株DKJ與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的來自不同地域的21株奶油栓孔菌進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示不同地域的奶油栓孔菌ITS1-5.8S-ITS2序列長度為521～589 bp，GC含量為48.76%～50.60%，有變異位點(diǎn)38個(gè)，自裔位點(diǎn)27個(gè)，簡約信息位點(diǎn)8個(gè)，序列總變異率為6.44%，表明不同地域的奶油栓孔菌ITS1-5.8S-ITS2序列長度、堿基構(gòu)成和變異程度均具有一定差異。說明奶油栓孔菌在自然界中存在一定的遺傳分化，具有較高的遺傳多樣性，表明奶油栓孔菌對環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)。

碳源試驗(yàn)表明，奶油栓孔菌DKJ在碳源為單糖或雙糖時(shí)更適合菌絲體生長，其對多糖的適應(yīng)性較差，這一特性與黃毛黃側(cè)耳的生物學(xué)特性[35]相一致。在氮源為酵母浸粉、蛋白胨和牛肉膏等有機(jī)氮源時(shí)，奶油栓孔菌菌絲體生長更快，而在磷酸氫二銨、硝酸銨和尿素等無機(jī)氮源條件下其生長緩慢甚至不能生長，這可能與有機(jī)氮源中含有維生素、微量元素等可以促進(jìn)菌絲生長的物質(zhì)有關(guān)[36]。隨著pH值增大，奶油栓孔菌菌絲體生長速率先增大后減小，在pH值為5.0時(shí)生長最快，說明奶油栓孔菌偏好在弱酸性環(huán)境中生長，這與迷宮栓孔菌 ZT-055菌絲體的生物學(xué)特性[20]一致。培養(yǎng)溫度試驗(yàn)表明，35 ℃時(shí)奶油栓孔菌菌絲長勢最好，生長最快，正交試驗(yàn)結(jié)果也表明，溫度對奶油栓孔菌菌絲生長的影響最大。由于該菌株于夏季在福建南平采集，根據(jù)對采集時(shí)間和氣候的分析，證明其是一個(gè)中高溫性菌。單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究表明,奶油栓孔菌DKJ菌絲體的最適生長條件組合為：以蔗糖為碳源,酵母浸粉為氮源，pH為5，培養(yǎng)溫度為35 ℃。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)期的奶油栓孔菌水提物和乙酸乙酯提取物均具有一定的抗氧化活性和抑菌活性，但其子實(shí)體和菌絲體時(shí)期的抗氧化活性和抑菌活性均存在顯著差異。該研究結(jié)果對奶油栓孔菌人工培養(yǎng)以及該菌種資源的開發(fā)利用和保護(hù)提供了一定的數(shù)據(jù)支撐。