梅月菊，蒲雅潔，2，陳彤垚，許曉雙，3，張曉瑞，4，張福生*，秦雪梅，馬存根

（1. 山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；2. 山西健碩食品藥品研究院有限公司，山西 太原 030001；3. 江蘇理工學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 213000；4. 中央民族大學(xué)，北京 100081；5. 山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030024）

0 引言

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是由于胰島素缺乏或胰島素抵抗，或兩者兼而有之的慢性代謝性疾病，以2 型糖尿病為主，占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的95%，且80%的2 型糖尿病患者同時伴有肥胖癥［1］。世界衛(wèi)生組織（WHO）的報告顯示，2017 年全球有4.25 億新的糖尿病病例，預(yù)計到2045 年全球患病率將繼續(xù)上升至6.29 億［2］。胰島素抵抗引起的脂質(zhì)代謝紊亂是2 型糖尿病發(fā)病的重要原因，而脂類代謝紊亂又是肥胖的誘因［3］。2 型糖尿病是一種無法根治的終身性疾病，目前臨床治療糖尿病的藥物存在著較嚴(yán)重的副作用，如長期服用降糖藥二甲雙胍、α 葡萄糖苷抑制劑易會使糖尿病患者產(chǎn)生腹脹、惡心、嘔吐等嚴(yán)重的胃腸道副反應(yīng)，甚至?xí)颊叩哪I臟和肝臟造成嚴(yán)重?fù)p傷［4］。因此，依據(jù)DM 發(fā)病的作用機(jī)制，從中藥中尋找安全高效的抑制劑已成為當(dāng)前研究的熱點。

蛋白酪氨酸磷酸酶1B（Protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）是一種典型的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶，與肥胖癥、糖尿病、癌癥和心血管疾病等在內(nèi)的多種疾病有關(guān)［5］。PTP1B 因其對胰島素信號級聯(lián)反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)活性而被證實是治療2 型糖尿病的生物學(xué)靶標(biāo)［6］。研究表明，敲除2 型糖尿病大鼠中的PTP1B 基因后，大鼠體內(nèi)的胰島素敏感性明顯增高，糖尿病癥狀也有所改善；敲除健康小鼠的PTP1B 基因后，小鼠體內(nèi)的胰島素敏感性明顯增高，且在高糖脂飲食誘導(dǎo)下也不發(fā)展為2 型糖尿病和肥胖癥［7-9］。因此，開發(fā)PTP1B 的抑制劑對于治療2 型糖尿病及肥胖癥具有良好的應(yīng)用前景。

目前對于PTP1B 抑制劑的研究主要集中于化學(xué)合成抑制劑，包括氧化苯砷、釩酸鹽、過釩酸鹽等［10］，而這些化學(xué)合成抑制劑會對患者身體造成不同程度的傷害。中藥用于治療糖尿病歷史悠久，具有療效穩(wěn)定，不良反應(yīng)少等優(yōu)點［11］，因此從天然植物中篩選PTP1B 抑制劑是目前研究的熱點［12］。目前有很多新的來源于藥用植物的PTP1B 抑制劑不斷被發(fā)現(xiàn)，馮守愛等［13］運用硅膠和凝膠色譜等從紅背山麻桿根（Alchornea trewioidesvar.trewioides）中分離得到4 個對PTP1B 活性具有較強(qiáng)抑制作用的化合物；趙海清等［14］利用阿勒泰黃芪（Astragalus altaicus）提取物對PTP1B 活性的抑制作用進(jìn)行研究，推測其提取物中的皂苷類成分是抑制PTP1B 活性的主要物質(zhì)。

遠(yuǎn)志（Polygala tenuifolia）主要化學(xué)成分為皂苷類、口山酮類和糖酯類成分等［15］。研究表明，遠(yuǎn)志具有一定的神經(jīng)保護(hù)、改善學(xué)習(xí)記憶等藥理作用；馬洪偉等［16］發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠的骨神經(jīng)具有保護(hù)作用；黃小波等［17］發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志能顯著縮短大鼠到達(dá)站臺的時間，能夠改善糖尿病大鼠的認(rèn)知障礙。本實驗利用系統(tǒng)溶劑萃取法得到了7種遠(yuǎn)志提取物，通過復(fù)制人源PTP1B 抑制劑體外活性篩選模型，對各種遠(yuǎn)志提取物進(jìn)行PTP1B 活性抑制篩選研究，期望從遠(yuǎn)志中找到潛在的PTP1B 抑制劑，用于今后2 型糖尿病及肥胖癥的創(chuàng)新藥物研發(fā)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Thermo fisher U3000 超高液相色譜系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，美國）；Thermo ScientificTMQ Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q，Millipore 公司，德國）；低溫?fù)u床（艾卡儀器設(shè)備有限公司，德國）；磁力攪拌（艾卡儀器設(shè)備有限公司，德國）；超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（SCIENTZ JY92-IIN，寧波新芝生物科技股份有限公司，中國）；超凈工作臺（LED-3，蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國）；強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂柱（Q-Sepharose Fast Flow，通用電氣醫(yī)療公司，美國）；強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱（S-Sepharose Fast Flow，通用電氣醫(yī)療公司，美國）；多功能酶標(biāo)儀（infinite M200，Tecan公司，瑞士）；96 微孔板（武漢博士德生物工程有限公司，中國）；高速臺式冷凍離心機(jī)（TGL-16，湘儀離心機(jī)儀器有限公司，中國）。

1.2 試劑

表達(dá)人源PTP1B 的大腸桿菌菌株，由吉林大學(xué)付學(xué)奇教授惠贈；BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；對硝基苯磷酸二鈉鹽（pNPP）；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；釩酸鈉（Na3VO4）；氨芐西林（Amp）；氯霉素（Cam）；3-嗎啉丙磺酸（MOPS）；2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（Mes）；酵母、瓊脂、蛋白胨（北京索萊寶科技有限公司）；氯化鈉（天津市化學(xué)試劑三廠）；超純水（Milli-Q 制備）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；甲酸（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 藥材

本實驗所用遠(yuǎn)志來自山西省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物所實驗大田的栽培遠(yuǎn)志，經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志，留樣保存于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心。

2 方法

2.1 遠(yuǎn)志提取物的制備

根據(jù)文獻(xiàn)［18］稱取一定量的遠(yuǎn)志藥材，剪短至1 cm～2 cm，加入10 倍的95%乙醇浸泡10 h ～12 h，加熱回流2 h，重復(fù)浸泡2 h～3 h、回流提取3 次后合并提取液，過濾，濃縮，即得到醇提物；將過濾后的藥渣，加10 倍水浸泡10 h～12 h，加熱回流2 h，重復(fù)浸泡2 h～3 h、回流提取3 次后合并提取液，過濾，濃縮，得到水提物；將醇提物與水提物等體積混合，依次用1.5 倍體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，萃取3 次，合并萃取液，濃縮至浸膏，60 ℃真空干燥，粉碎，分別得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、萃取水提取物。

2.2 PTP1B 的制備、純化

Mes 緩 沖 液 的 配 制：稱 取Mes（20 mmol/L）3.904 g，溶于900 mL 蒸餾水中，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 至6.5 左右，加入蒸餾水，定容至1 000 mL棕色容量瓶中，4 ℃保存。

將表達(dá)人源PTP1B 的大腸桿菌在500 mL LB（Luria Bertani）培養(yǎng)基（含500 μL 24 mg/mL Cam和500 μL 100 mg/mL Amp）中培養(yǎng)，經(jīng)0.25 mL 1 mol/L IPTG 誘導(dǎo)4 h ～5 h，8 000 r/min ，4 ℃，離心10 min，棄上清，收集菌體，分裝后8 000 r/min，4 ℃，每次10 min，離心4 次，棄去上清，沉淀保存于－20 ℃。

取1 L 菌體，用50 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，136.8 mmol/L NaCl，2.68 mmol/L KCl，10.1 mmol/L Na2HPO4·12H2O，1.8 mmol/L KH2PO4）重懸菌體，冰浴下磁力攪拌30 min，超聲破碎，超聲功率50%，超聲3 s，停止8 s，直至上清液澄清。取少量菌液加入0.1 mol/L 的pNPP，顯黃色則視為蛋白活力較好。將上述破碎后菌液與強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂柱充分結(jié)合，用25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）配制不同濃度的NaCl 洗脫液（0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L），進(jìn)行梯度洗脫，用pNPP 跟蹤活性，將收集流分放入冰盒，4 ℃保存。將強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂柱所得組分用Tris-HCl 分別稀釋至0.05 mol/L，加入至強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱，掛柱1 h，用Mes 緩沖液配制不同濃度的NaCl（0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L）進(jìn)行梯度洗脫，采用超濾膜進(jìn)行濃縮，對PTP1B 濃縮蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白的表達(dá)量和純度，PTP1B 濃縮液于－80 ℃保存。使用時先配制成工作液置冰上待加樣用。

2.3 遠(yuǎn)志不同提取物對PTP1B抑制活性的篩選

采用對硝基苯磷酸鹽法，特異性檢測純化后的PTP1B 活性［16］。原理是pNPP 在PTP1B 的催化作用下被分解為pNP 和磷酸鹽，其中pNP 顯黃色，在405 nm 處 有 強(qiáng) 紫 外 吸 收，由pNP［（ε＝1.78×104（mol－1·L·cm）－1）］的摩爾濃度來確定在PTP1B 催化下被分解的pNPP 的量，進(jìn)而判斷酶活性的變化以及化合物對酶活性的抑制情況。

陽性藥（Na3VO4，釩酸鈉）的配制：稱取0.1 g Na3VO4溶于蒸餾水，轉(zhuǎn)移至10 mL 的容量瓶，用蒸餾水定容，制成1×104μg/mL 陽性藥溶液。

供試藥物的配制：稱取0.02 g 的遠(yuǎn)志提取物（干粉）溶于蒸餾水中，轉(zhuǎn)移至10 mL 的容量瓶，用蒸餾水定容，制成2 mg/mL 的供試品溶液。

PTP1B 溶液的配制：稱取4.18 g MOPS，2.92 g NaCl 溶于800 mL 的3 次蒸餾水中，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH 至7.2，轉(zhuǎn)移至1 000 mL 的容量瓶中，用三次蒸餾水定容，現(xiàn)用現(xiàn)配。

設(shè)置了陽性藥物釩酸鈉為供試藥物：遠(yuǎn)志醇提取物、水提取物、石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、萃取水提取物，共8 個組。在96 孔 板 中 加 入83 μL PTP1B 溶 液，加 入10 μL 供試品溶液，37 ℃孵育30 min，然后加入2 μL 的pNPP，于37 ℃孵育15 min。最后加入5 μL 2 mol/L NaOH 終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀測量405 nm 處的吸收強(qiáng)度，以陽性藥礬酸鈉作為陽性對照，以不加PTP1B 作為空白對照，計算抑制率。通過Graph-Pad PRISM 5.0 軟 件 計 算 得 到IC50值 及IC50值曲線。

圖1 PTP1B 純化產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（M：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker，1：純化后的PTP1B）Fig.1 Purified PTP1B separated by SDS-PAGE（M：Standard molecular weight protein Marker，1：Purified PTP1B）

2.4 UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

2.4.1 色譜條件

將上述得到的7 個遠(yuǎn)志提取物的供試藥物溶液分別過0.22 μm 的微孔濾膜后制成供試品溶液，進(jìn)行UPLC-UV 分析，其色譜條件為：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.10 mm，2.6 μm），乙腈（A/%，體積分?jǐn)?shù)）-0.1%甲酸溶液（B/%，體積分?jǐn)?shù)）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采集時間：40 min，洗脫梯度見表1；檢測波長：302 nm；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。

表1 洗脫梯度Table 1 Elution gradient

2.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）：掃描方式為正負(fù)離子同時掃描；噴霧電壓3.5 kV；鞘氣體積流量241.5 mL/s；輔助氣體積流量69.0 mL/s；毛細(xì)管溫度320 ℃探頭加溫器溫度300 ℃；最大噴霧電流100 A；S-Lens分辨率55；掃描范圍100 m/z～2000 m/z；質(zhì)量分辨率70 kHz。

3 實驗結(jié)果

3.1 PTP1B的分離純化

將表達(dá)人源PTP1B 的大腸桿菌涂布在LB 平板上，待有單菌落長出后，挑取單菌落至LB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)IPTG 對其誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體進(jìn)行超聲破碎，采用離子交換層析的方法對破碎菌液進(jìn)行純化、分離得到PTP1B，經(jīng)超濾膜對PTP1B 進(jìn)行濃縮，對PTP1B 濃縮液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，電泳結(jié)果顯示純化蛋白呈單一條帶，條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符（約為26 KDa），并無明顯雜帶產(chǎn)生，表明人源PTP1B 在大腸桿菌中得到表達(dá)且效果較好。

3.2 遠(yuǎn)志不同提取物對PTP1B活性的抑制作用

將Na3VO4的濃度設(shè)置為0.01 μg/mL，0.1 μg/mL，1 μg/mL，5 μg/mL，25 μg/mL，100 μg/mL。采用BCA 法測得PTP1B 濃度為290 μg/mL 對建立的PTP1B 抑制劑篩選模型進(jìn)行驗證，結(jié)果如圖2 所示。Na3VO4的IC50為（0.1845 ± 0.01）μg/mL，對PTP1B 具有較強(qiáng)的抑制作用，證明該模型可用于PTP1B 抑制劑的篩選。

圖2 Na3VO4、氯仿提取物與萃取水提取物對PTP1B 的抑制曲線圖Fig. 2 Na3VO4，chloroform extract and water extract against PTP1B inhibition curve

圖2 表明，遠(yuǎn)志氯仿提取物的IC50值為（1.213±0.3） μg/mL，低 于（55.96±1.14） μg/mL［17］，認(rèn)為其對于PTP1B 具有強(qiáng)抑制作用，而遠(yuǎn)志醇提物的IC50值為184.9 μg/mL，遠(yuǎn)志水提取的IC50值為535.7 μg/mL，遠(yuǎn)志正丁醇的IC50值為66.77 μg/mL，遠(yuǎn)志萃取 水 提取物的IC50值為184.6 μg/mL，其 余 提 取 物 的IC50值 均 高 于（55.96±1.14）μg/mL［19］，說 明 這 些 提 取 物 對PTP1B 活 性 沒 有 抑制作用。

3.3 7 種遠(yuǎn)志提取物的UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

通過比對遠(yuǎn)志各提取物的UPLC-UV 色譜圖的峰型及保留時間（tR），發(fā)現(xiàn)氯仿提取物在保留時間22 min～28 min 內(nèi)的化學(xué)成分種類及含量明顯不同于其他提取物（圖3），推測此保留時間區(qū)域內(nèi)的化合物是抑制PTP1B 活性的物質(zhì)。遠(yuǎn)志氯仿提取物總離子流圖（圖4A－B）。由于氯仿提取物內(nèi)脂肪酸類物質(zhì)含量較高，掩蓋了小分子化合物的信號，且口山酮類小分子化合物濃度較低，導(dǎo)致無法產(chǎn)生二級質(zhì)譜圖。

圖3 遠(yuǎn)志提取物UPLC-UV 色譜圖（A：石油醚提取物，B：氯仿提取物，C：乙酸乙酯提取物，D：正丁醇提取物，E：萃取水提取物，F(xiàn)：乙醇提取物，G：水提取物；圖中紅色方框表示氯仿提取物在保留時間為22 min～28 min 的區(qū)域）Fig.3 UPLC-UV chromatogram of P. tenuifolia（A：Petroleum ether extract，B：Chloroform extract，C：Ethyl acetate extract，D：n-butanol extract，E：Extraction water site ，F(xiàn)：Ethanol extract，G：Water extract；The red box in the figure shows the area of chloroform extract with retention time of 22 min－28 min）

圖4 遠(yuǎn)志氯仿提取物的總離子流色譜圖。A：正離子模式；B：負(fù)離子模式Fig. 4 Total ion flow chromatogram of chloroform extract of P. tenuifolia.A：Positive ion mode；B：Negative ion mode

4 討論

PTP1B 抑制劑不僅可以用于治療2 型糖尿病及其并發(fā)癥，對于肥胖癥也有較好的治療作用。已有大量化學(xué)合成PTP1B 抑制劑的相關(guān)文獻(xiàn)，但由于PTP1B 抑制劑的活性低或選擇性差等特點，導(dǎo)致目前尚未有PTP1B 抑制劑進(jìn)入臨床研究［20］。因此，從天然植物尤其是中草藥中尋找天然PTP1B 抑制劑將有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高活性、低毒的抗糖尿病與減肥的有效成分［21］。本文以遠(yuǎn)志為對象，采用系統(tǒng)溶劑萃取法得到7 種遠(yuǎn)志提取物。通過人源PTP1B 抑制劑的體外活性篩選模型，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志氯仿提取物對PTP1B 具有較強(qiáng)的抑制作用（IC50：（1.213±0.3）μg/mL。經(jīng)對氯仿提取物進(jìn)行了UPLC-Q-Orbitrap HRMS 分析，未得到二級質(zhì)譜圖，故基于已有文獻(xiàn)［22］對遠(yuǎn)志氯仿提取物中的活性成分進(jìn)行了推測。

姜勇等［23］將遠(yuǎn)志醇提物減壓濃縮成浸膏后，依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取，得到遠(yuǎn)志氯仿提取物，采用硅膠柱層析和Sephadex LH-20 對遠(yuǎn)志氯仿提取物進(jìn)行分離純化，得到低極性甾醇類、脂肪酸、口山酮類等6 種化合物，其中只有1，3，7-trihydroxyxanthone、1，6，7-trihydroxy-2，3-dimethoxyxanthon 等2 個化合物具有二級質(zhì)譜信息；此外，1，3，7-trihydroxyxanthone 和1，6，7-trihydroxy-2，3-dimethoxyxanthon 的含量均較低，生藥量分別為0.35 mg/kg、0.48 mg/kg。為了充分獲得遠(yuǎn)志中的大極性類化學(xué)成分，將遠(yuǎn)志醇提物及藥渣水提物進(jìn)行等體積混合，并依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次進(jìn)行了液液萃取。相對于文獻(xiàn)中氯仿提取物［23］，本文所制備的遠(yuǎn)志氯仿提取物中的大極性化學(xué)成分更多一些，因而導(dǎo)致了遠(yuǎn)志氯仿提取物中脂肪酸類成分較多，最終對后續(xù)活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)指認(rèn)造成了困難。通過生藥量折算，本文所制備的遠(yuǎn)志氯仿提取物中1，3，7-trihydroxyxanthone 化合物的含量約為1.52 ng，1，6，7-trihydroxy-2，3-dimethoxyxanthon 化合物的含量約為2.12 ng，均低于質(zhì)譜的最低檢測限度，這也是無法得到遠(yuǎn)志氯仿提取物二級質(zhì)譜圖并對化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定的主要原因之一。綜上，依據(jù)文獻(xiàn)［23］推測遠(yuǎn)志氯仿提取物的活性成分應(yīng)為甾醇類、脂肪酸及口山酮類化合物，并以口山酮類化合物為主。今后應(yīng)繼續(xù)對本文中的氯仿提取物進(jìn)行單體化合物的分離、純化與結(jié)構(gòu)表征，并對其抗PTP1B 的作用機(jī)理進(jìn)行深入研究。

5 結(jié)論

本文對遠(yuǎn)志提取物進(jìn)行PTP1B 抑制活性篩選，結(jié)果表明遠(yuǎn)志氯仿提取物具有較強(qiáng)的PTP1B 抑制活性，推測遠(yuǎn)志氯仿提取物中的口山酮類化合物以及少量的甾醇類、脂肪酸化合物是主要的活性物質(zhì)。