張艷艷，張少陽(yáng)，張國(guó)梅，董川，雙少敏

（山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006）

0 引言

癌癥是惡性腫瘤的統(tǒng)稱［1］，是造成人口死亡的主要因素之一。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全球已出現(xiàn)約1 820萬(wàn)癌癥病例，專家預(yù)言未來(lái)將持續(xù)上漲。因此癌癥的治療非常重要。阿霉素［2-3］，亦稱多柔比星，是一種抗生素類藥物，用于抗腫瘤，緩解惡性腫瘤擴(kuò)散。但服用過(guò)量，可使人體產(chǎn)生脫發(fā)、惡心、嘔吐等現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)有致突變和致癌的可能，也易產(chǎn)生心臟毒性和骨髓抑制作用［4］。發(fā)展一種簡(jiǎn)單、線性范圍較寬且快速的方法檢測(cè)阿霉素是非常關(guān)鍵的。目前使用的方法有：電化學(xué)阻抗法［5］、循環(huán)伏安法［6］、拉曼光譜學(xué)及液相色譜法［7］等，其中熒光分析法有高靈敏度、易操作、低成本及檢測(cè)速度快等特性而被研究者廣泛關(guān)注。近年來(lái)，用于檢測(cè)阿霉素的熒光 材料有碳點(diǎn)（CDs）［8］、量子點(diǎn)（QDs）［9］、復(fù)合材料［10］和上轉(zhuǎn)化納米粒子［11］等，但碳點(diǎn)合成所需溫度高，量子點(diǎn)毒性高，金屬納米簇作為新型熒光探針具有合成條件溫和簡(jiǎn)單、水溶性好和生物相容性好而被廣泛應(yīng)用于藥物的檢測(cè)，近期已有金屬納米簇被用于檢測(cè)阿霉素的報(bào)道［12］。本文用青霉素鉀（PGP）作為穩(wěn)定劑和還原劑，“一步法”合成了藍(lán)綠色熒光銅納米簇（PGP＠CuNCs），其中青霉素鉀［13］是一種抗菌類藥物，內(nèi)含有β-內(nèi)酰胺環(huán)和噻唑環(huán)，不僅對(duì)銅有很強(qiáng)的親核力，而且還具有一定的還原作用，在合成中起到穩(wěn)定和還原的雙重作用。基于一定濃度的阿霉素（Doxorubicin，Dox）能明顯降低CuNCs 的熒光強(qiáng)度而建立了定量檢測(cè)阿霉素的新方法。合成和檢測(cè)過(guò)程示意圖如圖1 所示。

圖1 PGP＠CuNCs 的合成和應(yīng)用示意圖Fig. 1 Schematic illustration of the synthesis and application of PGP＠CuNCs

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

（1）實(shí)驗(yàn)藥品：青霉素鉀、硝酸銅、鹽酸阿霉素、氫氧化鈉和卡托普利等均為分析純。

（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)備：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2910，島津公司），熒光光譜儀（F-4500，日立公司），紅外光譜（Bruker，布魯克科技有限公司），X 射線電子能譜儀XPS（Kratos Axis Ulradld，島津公司），透射電子顯微鏡TEM（JEM-2100，JEOL 有限公司）。

1.2 PGP＠CuNCs的合成

青霉素鉀（PGP）包裹的銅納米簇的合成過(guò)程如下：先將3 mL，10 mmol/L 的青霉素鉀溶液超聲5 min，加入1 mL，10 mmol/L 硝酸銅溶液，攪拌10 min，再加入NaOH（1 mol/L）調(diào)整pH 值大約為11。然后將混合溶液置于45 ℃的水浴中持續(xù)攪拌4 h，將獲得的溶液靜置冷卻，離心，得到淺藍(lán)色的PGP＠CuNCs 溶 液。最 后 將 其 存 于4 oC 冰 箱 中備用。

1.3 PGP＠CuNCs線性及選擇性測(cè)定

將100 μL CuNCs 溶 液、600 μL PBS 緩 沖 溶 液（pH=7.4）和300 μL 二次水的混合液加入比色皿中，設(shè)激發(fā)波長(zhǎng)為385 nm，掃描，并記錄數(shù)據(jù)。隨后向探針中滴加不同濃度的阿霉素溶液，室溫下充分反應(yīng)3 min，再掃描并記錄。

此外，同上述條件下，此探針體系中分別加入10 μmol/L 的阿霉素（doxorubicin）和其他物質(zhì)，包括有：慶大霉素（Gentamicin）、葡萄糖（Glucose）、林可霉素（Lincomycin）、青霉素（Penicillin G）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）、紅 霉 素（Erythromycin）、氯 霉 素（Chloramphenicol）、土霉素（Oxytetracycline）、半胱氨酸（Cysteine）、谷胱甘肽（Glutathione）、卡托普利（Captopril）、高半胱氨酸（Homocysteine）、鹽酸硫胺（Thiamine）和尿素（Urea），掃描且記錄其熒光變化。選擇這些物質(zhì)，是因?yàn)閼c大霉素、紅霉素、氯霉素、土霉素等干擾物的結(jié)構(gòu)與阿霉素相近，也含有酰胺基和羥基，但相對(duì)位置有差異，導(dǎo)致選擇性不同，這些實(shí)驗(yàn)藥品都由阿拉丁網(wǎng)購(gòu)買(mǎi)所得。

1.4 細(xì)胞毒性和成像實(shí)驗(yàn)

毒性監(jiān)測(cè)步驟如下：將人體肝癌細(xì)胞SMMC7721 放到96 微孔板培養(yǎng)皿中37 ℃下培養(yǎng)一段時(shí)間后，向其中加不同濃度的CuNCs 繼續(xù)孵育24 h。然后吸出培養(yǎng)基，再向每個(gè)孔中加入100 μL MTT 溶液（0.5 mg/mL，DMEM 作溶劑），再孵育4 h，吸出MTT 液，向每個(gè)孔中加入150 μL DMSO，振蕩10 min。激發(fā)360 nm 處，酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度，并計(jì)算其存活率。

將肝癌細(xì)胞SMMC7721 放于含牛胎兒血清和盤(pán)尼西林-鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。向培養(yǎng)基中分別加入CuNCs 和CuNCs-Dox，孵育1 h，吸出培 養(yǎng) 液，pH=7.4 的PBS 緩 沖 溶 液 洗3 次，再 加 入1 mL PBS 緩沖溶液。最后，在激發(fā)405 nm 下觀察顯微鏡內(nèi)成像情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 PGP＠CuNCs的合成及表征

本文采取熒光、紫外及XPS 和TEM 對(duì)制備的PGP＠CuNCs 性 能 進(jìn) 行 了 分 析。 圖2 所 示 為CuNCs 的TEM 圖 像，從 圖2（A）中 可 觀 察 到：CuNCs 外觀似球形，分散性好；插圖表示其粒徑大約在2.5 nm 左右，圖2（B）為CuNCs 的高倍電鏡圖，可看出明顯的干涉條紋，測(cè)得晶面間距為0.210 nm，接近銅（111）的晶面間距0.202 nm，可歸為銅納米的（111）晶面［14］。

圖2 （A）PGP＠CuNCs 的TEM 圖像；（B）PGP＠CuNCs 的高倍電鏡圖Fig. 2 （A）TEM images of the PGP＠CuNCs；（B）The HRTEM image of PGP＠CuNCs

圖3（A）為不同激發(fā)下PGP＠CuNCs 的熒光圖，隨著激發(fā)波長(zhǎng)增大，CuNCs 熒光強(qiáng)度先增加后降低，發(fā)射峰位置不變。圖3（B）為CuNCs 的熒光光譜和紫外光譜。激發(fā)波長(zhǎng)為385 nm 時(shí)，CuNCs在474 nm 處有熒光發(fā)射峰，插圖（a）（b）分別為可見(jiàn)光 下 和 紫 外 燈 下 的 照 片。 圖3（C）為PGP 和PGP＠CuNCs 的紫外吸收光譜，PGP 在241 nm 和321 nm 處有吸收峰，而CuNCs 只在270 nm 處有弱吸收峰，證實(shí)了CuNCs 的合成且NCs 無(wú)大顆粒。圖3（D）為CuNCs 的CIE 色度圖，圖中黑色點(diǎn)所示顏色與NCs 紫外下一樣，為青色光。以硫酸奎寧（λem=370 nm，量子產(chǎn)率為0.542 6）作為參比，算得CuNCs 的量子產(chǎn)率為1.36%。

圖3 （A）PGP＠CuNCs 在不同激發(fā)下的熒光光譜；（B）CuNCs 的紫外和熒光譜圖，內(nèi)插圖：在日光下和紫外燈的照片；（C）純PGP 與CuNCs 的紫外光譜；（D）CuNCs 的CIE 色度圖Fig. 3 （A）The fluorescence spectra of the PGP＠CuNCs at different excitation wavelengths；（B）The UV-vis absorption and fluorescence spectra of CuNCs；（C）The absorption spectrum of PGP and CuNCs；（D）The CIE chromaticity photo of CuNCs

圖4（A）所示為純的PGP與PGP＠CuNCs 的紅外光譜圖，用于對(duì)CuNCs 表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。圖中CuNCs 和PGP 在3 300 cm-1～3 500 cm-1、1 630 cm-1～1 690 cm-1及1 050 cm-1～1 000 cm-1附近都有吸收峰，分別為羥基（O－H）/氨基（N－H）的伸縮振動(dòng)、酰胺I 帶（羰基（C=O）伸縮振動(dòng)）及Ar－O中C－OC 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明CuNCs 表面仍含有酰胺基團(tuán)。此外，PGP 在1 776 cm-1處強(qiáng)吸收峰為C=O伸縮振動(dòng)，在1 600 cm-1～1 450 cm-1處的吸收峰為苯環(huán)骨架中C=C 的伸縮振動(dòng)，1 396c m-1處的吸收峰是酰胺Ⅱ帶，而CuNCs 只在1 446 cm-1處有的吸收峰，表明PGP 的官能團(tuán)可能與銅原子發(fā)生了作用。其次在CuNCs 的譜圖中還觀察到，在2 100 cm-1～2 550 cm-1處有新的振動(dòng)峰出現(xiàn)，而PGP譜圖中在此范圍沒(méi)有峰，可能是因?yàn)镻GP 表面結(jié)構(gòu)發(fā)生降解使其β-內(nèi)酰胺環(huán)開(kāi)環(huán)形成青霉胺，與Cu（Ⅰ）作用形成PGP-Cu（Ⅰ）螯合物，而硫元素與銅離子鍵合形成Cu－S 鍵，從而產(chǎn)生新的振動(dòng)峰，進(jìn)一步證實(shí)了PGP＠CuNCs 的合成。

圖4（B）所示為PGP＠CuNCs 的XPS 全譜圖，圖中含有Cu、S、N、O 和C 等元素。圖4（C）為銅（2p）譜。圖中顯示在932.1 eV 和952.5 eV 處各呈現(xiàn)出一個(gè)峰，分別代表為Cu（2p）譜中Cu 2p3/2和Cu 2p1/2的結(jié)合能，表明NCs 中含有Cu（I）和Cu（0），Cu（I）可與其形成復(fù)合物起穩(wěn)定作用，而在942.2 eV處只有微弱的特征峰不明顯，說(shuō)明有極少量未作用的二價(jià)銅，這個(gè)結(jié)果與以前的報(bào)道一致［15］。圖4（D）所示為硫（2p）譜，圖中顯示分別在S 2p1/2163.9 eV和S 2p3/2161.9 eV 出現(xiàn)吸收峰［16］，推斷出銅與硫進(jìn)行鍵合，這個(gè)結(jié)果與紅外光譜圖相符。

圖4 （A）PGP 和PGP＠CuNCs 的紅外光譜圖；（B）CuNCs 的XPS 全譜圖；（C）Cu2p 的譜圖；（D）S2p 的譜圖Fig. 4 （A）The infrared（IR）spectra of PGP and PGP＠CuNCs；（B）Survey XPS spectrum of CuNCs；（C）The Cu 2p XPS spectrum of CuNCs；（D）The S 2p XPS spectrum of CuNCs

2.2 PGP＠CuNCs對(duì)Dox的線性和選擇性實(shí)驗(yàn)

圖5（A）所展示的是滴加不同濃度的阿霉素后，CuNCs 探針強(qiáng)度猝滅的程度。由圖看出，當(dāng)阿霉素的濃度從0 滴加到100 μmol/L 后，CuNCs 的熒光峰幾乎消失，在601 nm 處出現(xiàn)等發(fā)射點(diǎn)，在650 nm 處的有微弱的熒光峰，新的熒光峰表明新物質(zhì)的生成。圖5（B）和（C）為熒光強(qiáng)度的相對(duì)比值（F0/F）與阿霉素（Dox）濃度的線性關(guān)系圖，濃度在1 μmol/L～35 μmol/L 范圍內(nèi)，線性方程為F0/F=1.019 19C（μmol/L）+0.162 4，C為Dox的濃度，R2=0.997 8；在45 μmol/L～100 μmol/L 范 圍 內(nèi)，方 程 為F0/F=-1.301 94+0.057 57C（μmol/L），R2=0.991 3。經(jīng)LOD=3σ/k公式計(jì)算，檢出限為18 nmol/L。下表1 所示是此項(xiàng)工作中PGP＠CuNCs 與其他測(cè)定阿霉素的熒光納米材料的對(duì)比結(jié)果。從表中看出，PGP＠CuNCs 探針對(duì)阿霉素的檢測(cè)線性范圍寬，靈敏度較高。為了探索CuNCs對(duì)阿霉素（Dox）的專一性識(shí)別，考察了一些干擾物對(duì)CuNCs 熒光強(qiáng)度的響應(yīng)程度。如圖5（D）所示，除了阿霉素可以明顯地猝滅PGP＠CuNCs 的熒光外，其他干擾物沒(méi)有影響。因此，CuNCs 對(duì)Dox有高的選擇性。

圖5 （A）不同濃度的阿霉素對(duì)PGP＠CuNCs 的熒光強(qiáng)度影響；（B）-（C）阿霉素與CuNCs 熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系；（D）PGP＠CuNCs 對(duì)其他物質(zhì)的選擇性Fig. 5 （A）Fluorescence spectra of CuNCs in different concentrations of doxorubicin；（B）-（C）The relationship between the fluorescence intensity CuNCs and the concentrations of doxorubicin.（D）The fluorescence response of CuNCs in the presence of different substances

表1 不同熒光探針或其他熒光納米材料對(duì)阿霉素檢出限靈敏度的對(duì)比Table 1 Comparison between the PGP＠CuNCs and different fluorescent probe or other fluorescent nanomaterials for the determination of doxorubicin

2.3 Dox誘導(dǎo)PGP＠CuNCs猝滅機(jī)理

為進(jìn)一步探索熒光猝滅機(jī)理，分別研究了阿霉素存在下探針的TEM 和熒光壽命。圖6（A）和（B）表明，加入Dox 后，CuNCs 形狀未變，但粒徑變小，由原來(lái)的2.5 nm 變?yōu)?.8 nm 左右。據(jù)此推測(cè)，加入阿霉素使得CuNCs 刻蝕，這可能是PGP 配體表面的酰胺基發(fā)生了質(zhì)子化和去質(zhì)子化的結(jié)果，導(dǎo)致了PGP＠CuNCs 的刻蝕，因此刻蝕的CuNCs 光學(xué)特性消失。圖6（C）為CuNCs 和CuNCs-Dox 體系的熒光壽命分析，CuNCs 的平均壽命為4.01 ns，加入一定濃度的Dox，平均壽命降低到3.70 ns，幾乎沒(méi)有改變，說(shuō)明屬于靜態(tài)猝滅［12，19］。

圖6 （A）-（B）阿霉素存在下CuNCs 的TEM 圖和粒徑圖；（C）CuNCs 和CuNCs-Dox 體系的熒光壽命圖Fig.6 （A）-（B）TEM images and particle size of the PGP＠CuNCs in the presence of doxorubicin；（C）Fluorescence decay lifetime of PGP＠CuNCs and PGP＠CuNCs in the presence of doxorubicin

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

研究PGP＠CuNCs 探針檢測(cè)實(shí)際樣中的阿霉素來(lái)驗(yàn)證方法的可行性。收集樣品來(lái)自山西省人民醫(yī)院的比柔多星注射液。結(jié)果如表2 所示，計(jì)算得出相對(duì)誤差在－0.21～3.90 之間，相對(duì)較小，表明CuNCs 可用于實(shí)際樣品阿霉素的含量測(cè)定。

表2 檢測(cè)實(shí)際樣品中的阿霉素的含量Table 2 Determination of doxorubicin in samples

2.5 PGP＠CuNCs的細(xì)胞成像

圖7 所示為PGP＠CuNCs 的細(xì)胞毒性研究，從圖中可看出：不同濃度的CuNCs 處理過(guò)的SMMC7721 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，隨著NCs 濃度的增大，存活率呈現(xiàn)微弱下降，當(dāng)CuNCs 濃度為0.6 mg/mL 時(shí)，存活率依保持在85%以上，說(shuō)明CuNCs毒性很低。

圖7 PGP＠CuNCs 對(duì)SMMC772 細(xì)胞的毒性Fig. 7 Cell viability of PGP＠CuNCs at different concentrations（mg/mL）

圖8 所示為激光共聚焦掃描顯微熒光成像圖。圖8（A－C）為含0.6 mg/mL CuNCs 溶液的人體肝癌SMMC7721 細(xì)胞的共聚焦圖像：（A）明場(chǎng)；（B）暗場(chǎng)；（C）明 場(chǎng) 與 暗 場(chǎng) 疊 加 圖。 圖8（D-F）為PGP＠CuNCs 溶液加入阿霉素后的共聚焦圖像：（D）明場(chǎng)；（E）暗場(chǎng)；（F）明場(chǎng)與暗場(chǎng)疊加圖。圖中看出SMMC7721 細(xì)胞狀態(tài)良好，呈藍(lán)色熒光，說(shuō)明CuNCs 可進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)比得出：加入Dox 后標(biāo)記的SMMC7721 細(xì)胞的熒光強(qiáng)度減弱，說(shuō)明CuNCs 有好的生物相容性，可以將PGP＠CuNCs 傳感體系應(yīng)用于生物熒光成像。

圖8 （A）-（C）PGP＠CuNCs 在人肝癌SMMC7721 細(xì)胞中的熒光共聚焦成像；（D）-（F）加入阿霉素后的圖片，注：A 與D 明場(chǎng)；B 與E 暗場(chǎng)；C 與F 明場(chǎng)和暗場(chǎng)的疊加圖Fig. 8 Confocal bright field（A and D），fluorescence（B and E），and overlap images（C and F）of SMMC7721 cells incubated with PGP＠CuNCs（A-C）and presence of doxorubicin（D-F）

3 結(jié)論

以青霉素鉀（PGP）為配體和還原劑一步合成銅納米簇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該探針的熒光能被阿霉素 猝 滅，在1.0～35.0 μmol/L 和45.0～100.0 μmol/L 范圍內(nèi)有兩段好的線性，且檢出限低，從而建立了檢測(cè)阿霉素的方法。這種熒光測(cè)定方法應(yīng)用于實(shí)際樣中對(duì)阿霉素的檢測(cè)。此外，本實(shí)驗(yàn)還在人體肝癌SMMC7721 細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了熒光共聚焦成像。