米糠粕不溶性膳食纖維理化性質(zhì)及對(duì)高脂 大鼠腸道菌群的影響

劉 倩，范譽(yù)川，劉素詩(shī)，趙潔羽，魏 濤,*

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2.北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

現(xiàn)代飲食習(xí)慣通常會(huì)造成脂肪和糖的過(guò)量攝入，從而引起肥胖、高脂血癥等疾病。高脂血癥除造成血漿中膽固醇和（或）甘油三酯水平升高外，通常還會(huì)使腸道菌群發(fā)生顯著改變[1-3]。膳食纖維是指天然存在于水果、蔬菜、谷類等食品中的一類不能被人體消化道酶解吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在控制體質(zhì)量、緩解高脂血癥、預(yù)防結(jié)腸癌和心腦血管疾病等方面具有重要應(yīng)用[4-6]。美國(guó)飲食協(xié)會(huì)建議每天膳食纖維攝入量女性約為25 g，男性約為38 g[7]；Reynolds等建議人們應(yīng)將膳食纖維的攝入量增加到每天至少25～29 g，并認(rèn)為更多的攝入量可能會(huì)帶來(lái)額外的益生作用[8]。而目前全球大多數(shù)人每日膳食纖維攝入量不足20 g，2016年中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)膳食纖維分會(huì)發(fā)布的《中國(guó)居民膳食纖維攝入白皮書》顯示，中國(guó)居民膳食纖維攝入普遍不足，每日人均膳食纖維（不可溶）攝入量?jī)H為11 g；因此開發(fā)膳食纖維產(chǎn)品、提高我國(guó)居民膳食纖維攝入水平具有重要意義。米糠和米糠粕是稻米及其相關(guān)產(chǎn)品加工過(guò)程中的副產(chǎn)物，我國(guó)是水稻種植大國(guó)，2019年全國(guó)稻谷產(chǎn)量為20 961萬(wàn) t，按出糠率12%計(jì)算，則可產(chǎn)出約2 515萬(wàn) t米糠。米糠原材料分布廣、產(chǎn)量大、膳食纖維含量豐富，可作為膳食纖維的良好來(lái)源。

根據(jù)水溶性的不同，膳食纖維可分為可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維，不溶性膳食纖維主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等，通常認(rèn)為不溶性膳食纖維可通過(guò)增加糞便體積、刺激腸道蠕動(dòng)、增加排便量等方式發(fā)揮生理活性[9-10]。近年來(lái)的一些研究結(jié)果表明，不溶性膳食纖維還可被腸道微生物發(fā)酵利用，Sun Shanshan等發(fā)現(xiàn)不溶性的茯苓多糖能夠使小鼠腸道中產(chǎn)丁酸菌Lachnospiracea和Clostridium豐度增加，提高腸道中丁酸鹽水平和黏膜完整性，激活腸道過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ通路[11]；Yang Lina等通過(guò)體外發(fā)酵分析發(fā)現(xiàn)大豆殼不溶性膳食纖維能夠增加雙歧桿菌和乳桿菌豐度[12]；Wu Weijie等發(fā)現(xiàn)箭竹不溶性膳食纖維能夠提高雙歧桿菌豐度，并使總短鏈脂肪酸的含量增加0.71 倍[13]。不溶性膳食纖維攝入可影響腸道菌群的組成和代謝，通過(guò)更加復(fù)雜的方式發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而目前關(guān)于米糠粕不溶性膳食纖維（rice bran insoluble dietary fibers，RBIDF）對(duì)腸道菌群的影響缺乏相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)以米糠粕為原料，通過(guò)多種酶結(jié)合處理的方式制備RBIDF，對(duì)其表面結(jié)構(gòu)、常規(guī)成分和理化性質(zhì)進(jìn)行研究，此外建立高脂大鼠模型，分析RBIDF干預(yù)對(duì)高脂大鼠腸道菌群的影響，以期為RBIDF的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠粕 鄭州四維糧油工程技術(shù)有限公司；α-淀粉酶（40 000 U/g）、α-1,4-葡萄糖苷酶（100 000 U/g）、木瓜蛋白酶（100 000 U/g）和纖維素酶（50 000 U/g） 北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、膽固醇 生工生物工程上海股份有限公司；Gene JETTMGel Extraction Kit試劑盒 美國(guó)Thermo Scientific公司；甘油三酯、總膽固醇測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SU-8010掃描電子顯微鏡、L-8800氨基酸分析儀 日本 日立公司；SER148脂肪萃取儀 意大利VELP公司；DR-200BS酶標(biāo)分析儀 無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RBIDF的制備

取一定量米糠粕，按料液比1∶20加水?dāng)嚁r混勻，添加1%（以米糠粕質(zhì)量計(jì)，下同）的淀粉酶和0.4%的糖化酶，混勻并于60 ℃下酶解2 h，后置于沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫后，加1%的木瓜蛋白酶酶解2 h，再置于沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫后加入1%的纖維素酶于60 ℃下酶解1 h，后置于沸水浴中滅酶10 min，離心去掉上清液，沉淀用蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液各洗滌1 次，隨后在60 ℃下干燥，粉碎后過(guò)60 目標(biāo)準(zhǔn)篩備用。

1.3.2 RBIDF表面結(jié)構(gòu)觀察

將樣品干燥至恒質(zhì)量，取樣品若干，置于粘有銅片的觀察臺(tái)上，樣品粘臺(tái)后噴金，通過(guò)掃描電子顯微鏡于10 kV下觀察表面超微結(jié)構(gòu)。

1.3.3 RBIDF常規(guī)成分和理化性質(zhì)分析

水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法測(cè)定；脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》中索氏抽提法測(cè)定；蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照 GB/T 31578—2015《糧油檢驗(yàn) 糧食及制品中粗蛋白測(cè)定 杜馬斯燃燒法》測(cè)定；灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照GB 5009.4—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》測(cè)定；不溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照GB 5009.88—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測(cè)定》中酶重量法測(cè)定；氨基酸含量參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》測(cè)定。碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照GB 28050—2011《預(yù)包裝食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽通則》測(cè)定，按照公式（1）計(jì)算。

持水力采用Sangnark等的方法[14]，將3 g樣品和100 mL去離子水放入燒杯中混勻，靜置2 h后離心去上清液，稱量樣品的濕質(zhì)量。持水力按公式（2）計(jì)算。

持油力參照Sangnark等的方法[14]，取3 g樣品置于離心管中，加入24 g食用花生油，37 ℃靜置1 h，離心去掉上層油，再用吸油紙吸干游離花生油，稱量剩余樣品的質(zhì)量。持油力按公式（3）計(jì)算。

1.3.4 RBIDF吸附能力測(cè)定

分析RBIDF對(duì)葡萄糖和膽固醇的吸附能力。吸附量以每克樣品吸收的底物質(zhì)量表示，單位mg/g。吸附率按式（4）計(jì)算。

葡萄糖吸附能力測(cè)定：稱取1 g樣品與100 mL的葡萄糖溶液（0.1、0.2、0.3 mg/mL）混勻，置于37 ℃、180 r/min 搖床中分別吸附0.5、1、2、4 h，分別離心取上清液，采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)上清液中葡萄糖的質(zhì)量。

膽固醇吸附能力測(cè)定：在pH 2.0和pH 7.0的條件下將1 g樣品與50 mL的膽固醇溶液（40 mg/mL）混勻，于37 ℃、180 r/min下分別吸附0.5、1、1.5、2、3 h，離心取上清液，采用Liu Chun等的方法測(cè)上清液中膽固醇的質(zhì)量[15]。

1.3.5 RBIDF體外抗氧化能力測(cè)定

參考Sarfaraz等的方法[16]，將0.3 g的RBIDF樣品與10 mL、體積分?jǐn)?shù)50%丙酮溶液混勻后在室溫下振蕩16 h，隨后10 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)其體外抗氧化能力。DPPH自由基和羥自由基清除能力測(cè)定參照Liu Qian等的方法[17]進(jìn)行，配制相應(yīng)質(zhì)量濃度（1.875～60 mg/mL）的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

選擇體質(zhì)量在140～160 g的成年雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，飼喂高脂飼料4 周建立高脂血癥模型，采用試劑盒檢測(cè)大鼠血清甘油三酯和總膽固醇水平，然后依據(jù)甘油三酯水平隨機(jī)分為2 組，即高脂模型組（MC組）和RBIDF干預(yù)組（RBIDF組），MC組喂養(yǎng)高脂飼料（飼料配方如表1所示），RBIDF組除喂養(yǎng)高脂飼料外每日按3.5 g/kgmb灌胃RBIDF，每組6 只大鼠。灌胃干預(yù)4 周，另設(shè)正常對(duì)照組（NC組）喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料。灌胃結(jié)束后麻醉處死解剖，迅速收集大鼠盲腸內(nèi)容物至無(wú)菌離心管中，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 動(dòng)物飼料配方Table 1 Nutrient composition of experimental diets

1.3.7 腸道菌群分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法從大鼠盲腸內(nèi)容物中提取細(xì)菌DNA，對(duì)16S rDNA的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，使用的通用引物為F431（5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′）和R806（5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′）。利用Gene JETTMGel Extraction Kit試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收，構(gòu)建文庫(kù)，利用Ion S5TMΧL平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序和分析方法參考文獻(xiàn)[18]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異用單因素方差分析法分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RBIDF表面結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

利用掃描電子顯微鏡對(duì)米糠粕和RBIDF的表面形貌進(jìn)行觀察，如圖1A所示，米糠粕的表面結(jié)構(gòu)較為光滑緊密，沒(méi)有空隙和孔洞，附著有大量的球狀顆粒，應(yīng)為表面包裹的淀粉和蛋白質(zhì)。而經(jīng)過(guò)淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和纖維素酶處理后，淀粉和蛋白質(zhì)發(fā)生水解，獲得的RBIDF表面幾乎不具有球狀淀粉顆粒，呈不規(guī)則鱗片式的層狀疏松結(jié)構(gòu)，并有明顯的裂縫及孔洞（圖1B），說(shuō)明RBIDF與米糠粕相比比表面積有所增大，利于提高其吸附性能。

圖1 米糠粕（A）和RBIDF（B）的掃描電子顯微鏡圖Fig.1 Scanning electron microscopic images of defatted rice bran (A) and RBIDF (B)

2.2 RBIDF常規(guī)成分和理化性質(zhì)分析結(jié)果

對(duì)米糠粕和RBIDF的灰分、蛋白質(zhì)、脂肪、不溶性膳食纖維和氨基酸組成等指標(biāo)進(jìn)行分析。由表2、3可知，RBIDF中蛋白質(zhì)、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)和各氨基酸含量（除甲硫氨酸）與米糠粕相比顯著下降，而不溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高（P＜0.05），達(dá)到64.26%，這可能是RBIDF制備過(guò)程中淀粉酶、糖化酶和木瓜蛋白酶的處理可以使米糠粕中的可溶性淀粉和蛋白質(zhì)發(fā)生水解，煮沸處理可提取出米糠粕中殘余的部分脂肪所致。此外，持水力和持油力分析結(jié)果表明，RBIDF的持水力和持油力與米糠粕相比顯著提高，分別可達(dá)5.86 g/g和2.86 g/g，這可能是由于處理后RBIDF的表面結(jié)構(gòu)與米糠粕相比更為疏松多孔，比表面積增大。

表2 米糠粕和RBIDF常規(guī)成分和理化性質(zhì)Table 2 Chemical compositions and physicochemical properties of defatted rice bran and RBIDF

表3 米糠粕和RBIDF氨基酸組成Table 3 Amino acid compositions of defatted rice bran and RBIDF

2.3 RBIDF吸附能力分析結(jié)果

如圖2A所示，在相同葡萄糖質(zhì)量濃度下，隨著吸附時(shí)間延長(zhǎng)，RBIDF的吸附率變化較小并逐漸趨于穩(wěn)定，說(shuō)明RBIDF對(duì)葡萄糖的吸附較為迅速，吸附量最高為6.4 mg/g，穩(wěn)定后總體在4.0 mg/g以上，良好的葡萄糖吸附能力說(shuō)明RBIDF在減少葡萄糖吸收、調(diào)節(jié)血糖水平方面具有一定的應(yīng)用潛力。許多疾病與體內(nèi)膽固醇的含量直接相關(guān)，人體中的膽固醇主要來(lái)源于外源性攝入和內(nèi)源性合成，因此，防止過(guò)量攝入以及保持正常的膽固醇水平有利于人體健康。如圖2B所示，對(duì)RBIDF的膽固醇吸附能力進(jìn)行分析，設(shè)置反應(yīng)pH值分別為2.0和7.0來(lái)模擬胃腸道 消化環(huán)境，結(jié)果表明，在較短的吸附時(shí)間內(nèi)，pH 7.0條件下RBIDF的膽固醇吸附能力要優(yōu)于pH 2.0，吸附1 h時(shí)膽固醇吸附量最高，為12.8 mg/g，而隨著吸附時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)（1～3 h），中性條件下的吸附量有所下降，而酸性條件下吸附量有所提高，吸附2 h時(shí)兩種條件下膽固醇吸附量都達(dá)到9.0 mg/g左右，綜上，RBIDF在中性和酸性條件下都表現(xiàn)出一定的膽固醇吸附能力。

圖2 RBIDF對(duì)葡萄糖（A）和膽固醇（B）的吸附能力Fig.2 Glucose (A) and cholesterol (B) adsorption capacity of RBIDF

2.4 RBIDF抗氧化能力分析結(jié)果

研究表明米糠中含有豐富的酚類化合物，具有抗氧化、抗炎等多種生物活性，其中以共價(jià)鍵結(jié)合在纖維素分子上的不溶性酚類化合物是其主要的存在形式[19-20]。如圖3所示，RBIDF對(duì)羥自由基的清除率最高可達(dá)70.1%，對(duì)DPPH自由基的清除率隨著檢測(cè)質(zhì)量濃度增大而升高，60 mg/mL時(shí) 約為72.1%。RBIDF表現(xiàn)出良好的抗氧化性，攝入RBIDF對(duì)于維持腸道正常氧化還原狀態(tài)具有一定的有益效果。

圖3 RBIDF對(duì)羥自由基和DPPH自由基的清除率Fig.3 Hydroxyl and DPPH free radical scavenging capacity of RBIDF

2.5 RBIDF對(duì)高脂大鼠腸道菌群的影響

以往的許多研究已經(jīng)表明，不溶性膳食纖維在控制高脂大鼠體質(zhì)量、緩解高脂血癥方面具有一定的作用，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)不溶性膳食對(duì)于腸道菌群也會(huì)產(chǎn)生一定的影響[11-12,21-22]，因此對(duì)RBIDF灌胃前后高脂大鼠腸道菌群變化進(jìn)行了分析。首先建立大鼠高脂模型，如表4所示，喂養(yǎng)高脂飼料4 周后，MC組與NC組相比，血清甘油三酯和總膽固醇濃度顯著提高（P＜0.05），說(shuō)明大鼠高脂模型造模成功。灌胃RBIDF后提取大鼠盲腸內(nèi)容物細(xì)菌DNA，利用IonS5TMΧL測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），共得到872 個(gè)OTUs，然后根據(jù)Silva132數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTUs進(jìn)行物種注釋。如圖4A所示，對(duì)OTUs結(jié)果進(jìn)行Venn圖分析，NC組具有687 個(gè)OTUs，而高脂模型MC組有581 個(gè)OTUs，與NC組相比有所減少，說(shuō)明高脂飲食在一定程度上降低了動(dòng)物腸道菌群多樣性；RBIDF組含有604 個(gè)OTUs，與MC組相比OTUs數(shù)量有所恢復(fù)。在組成上，與MC組相比，RBIDF組產(chǎn)生162 個(gè)特有OTUs，與NC組相比只產(chǎn)生了93 個(gè)特有OTUs，說(shuō)明在菌群組成上RBIDF組與NC組更為接近。

表4 高脂飼料對(duì)大鼠血脂水平的影響Table 4 Effect of high-fat diet on serum lipid levels in rats

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每組在門水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖，如圖4B所示。NC組中厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要物種，厚壁菌門和擬桿菌門是腸道菌群中的兩個(gè)主要群落，可影響代謝平衡，兩者含量和比例可作為判斷潛在肥胖可能性的依據(jù)，許多研究表明，缺乏膳食纖維、高脂高糖的飲食會(huì)引起腸道中厚壁菌門豐度升高，擬桿菌門豐度降低[23-24]。因此，MC組擬桿菌門豐度與NC組相比都有所下降，而RBIDF組與MC組相比擬桿菌門豐度有所恢復(fù)，說(shuō)明在門水平上RBIDF能在一定程度上改善菌群紊亂。如圖4C所示，在屬水平上，與NC組相比，MC組Blautia相對(duì)豐度提高，Lactobacillus、Romboutsia、unidentified_Lachnospiraceae、unidentified_Ruminococcaceae和Roseburia相對(duì)豐度有所下降，上述幾種微生物與人體健康有重要的關(guān)系，有研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪肝患者腸道中Blautia豐度與正常人相比有所提高[25]， 而Lactobacillus、Roseburia和Ruminococcaceae等微生物的豐度與短鏈脂肪酸的產(chǎn)生或者防止心腦血管病變等成正相關(guān)[26-29]。而RBIDF干預(yù)后，與MC組相比，RBIDF組Romboutsia和unidentified_Lachnospiraceae相對(duì)豐度下降，Lactobacillus和Roseburia相對(duì)豐度無(wú)明顯變化，而與短鏈脂肪酸產(chǎn)生相關(guān)的Butyricicoccus、Marvinbryantia和unidentified_Ruminococcaceae的相對(duì)豐度有所上升（圖4C）。根據(jù)所有樣本的物種注釋結(jié)果和OTUs的豐度信息，基于Unweighted Unifrac距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），并選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖分析，樣品距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似。如圖4D所示，NC組與MC組各樣本距離較遠(yuǎn)，而RBIDF組處于兩組之間的位置，表明其與NC組的物種組成結(jié)構(gòu)相似度與MC組相比有所提高，說(shuō)明RBIDF對(duì)高脂膳食造成的腸道微生物群落組成變化具有一定的恢復(fù)作用。

圖4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腸道菌群組成Fig.4 Gut microbiota composition in different groups of rats

3 結(jié) 論

米糠及米糠粕中不溶性膳食纖維含量豐富，本實(shí)驗(yàn)利用酶處理等方式制備RBIDF，對(duì)其理化性質(zhì)及對(duì)高脂大鼠腸道菌群的影響進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，RBIDF不溶性膳食纖維與米糠粕相比結(jié)構(gòu)更為疏松多孔，比表面積增大，具有良好的持油力、持水力以及葡萄糖和膽固醇吸附能力，并且還表現(xiàn)出較好的抗氧化性。此外，灌胃RBIDF能夠在一定程度上改善高脂膳食造成的大鼠腸道微生物數(shù)量和組成變化，提高與短鏈脂肪酸產(chǎn)生相關(guān)的Butyricicoccus、Marvinbryantia和unidentified_Ruminococcaceae豐度。RBIDF表現(xiàn)出較好的體內(nèi)體外活性，可作為膳食纖維的良好來(lái)源。本研究為開發(fā)RBIDF及其作用機(jī)理探索提供了理論參考。