半夏瀉心湯“辛苦組”藥物提取液純化工藝研究

馮玉天嬌，陳 雪，黃慶德

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

半夏瀉心湯出自張仲景的《傷寒論》，為治療脾胃病的經(jīng)典方，主治心下痞證，臨床主要用于治療急慢性胃炎、消化道潰瘍、急性胃腸炎。半夏瀉心湯是充分體現(xiàn)中藥性味配伍理論的代表方，方中“甘補(bǔ)”組藥物由黨參、大棗、甘草組成，作用為補(bǔ)中益氣，養(yǎng)胃，以防辛散耗氣，苦寒傷胃；“辛開(kāi)苦降”組藥物由半夏、干姜、黃芩、黃連組成，作用為辛溫除寒，和胃止嘔，苦降瀉熱，清腸消痞，主要通過(guò)促進(jìn)胃動(dòng)力、促進(jìn)胃黏膜修復(fù)、抗幽門(mén)螺桿菌等達(dá)到消痞散結(jié)的目的［1-4］，其主要作用部位為胃部。為更好發(fā)揮藥效，提高藥物的生物利用度，使方中“辛開(kāi)苦降”組藥物可在胃部滯留較長(zhǎng)時(shí)間且穩(wěn)定地釋放藥物，將“辛開(kāi)苦降”組藥物經(jīng)提取、純化后，應(yīng)用現(xiàn)代制劑技術(shù)制成胃滯留釋藥單元，在胃中緩慢釋藥，起辛開(kāi)苦降，調(diào)暢氣機(jī)的作用，達(dá)到消痞散結(jié)的目的；另將“甘補(bǔ)”組中藥物經(jīng)提取、純化后，制備成胃溶型普通釋藥單元，口服后迅速釋放藥物，起補(bǔ)中益氣、養(yǎng)胃的作用，以防辛散耗氣，苦寒傷胃。將上述胃滯留釋藥單元和胃溶型普通釋藥單元共同組合成為二元釋藥系統(tǒng)，改變這些組分在體內(nèi)的釋藥行為，從而達(dá)到強(qiáng)化組分藥性、優(yōu)化整體協(xié)同的作用，充分發(fā)揮中藥復(fù)方的優(yōu)勢(shì)。這既可體現(xiàn)中藥復(fù)方的整體性，又可以兼顧其復(fù)雜性，同時(shí)體現(xiàn)了傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代制劑理論的融合。由于半夏瀉心湯“辛開(kāi)苦降”組藥物經(jīng)乙醇回流提取的收膏率為20%左右［5］，但胃部滯留制劑載藥量一般較小，為減小單服劑量，便于應(yīng)用現(xiàn)代制劑技術(shù)將其制成胃滯留釋藥單元，本實(shí)驗(yàn)以鹽酸小檗堿、黃芩苷的靜態(tài)轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)與正交設(shè)計(jì)法對(duì)半夏瀉心湯“辛開(kāi)苦降”組藥物的大孔吸附樹(shù)脂純化工藝進(jìn)行考察，為下一步半夏瀉心湯“辛苦組”藥物胃滯留釋藥單元的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20A高效液相色譜儀、SPD-M20A PDA檢測(cè)器（日本島津公司）；XS105電子分析天平（美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司）；FA2004N電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；STARTER 3100 pH酸度儀（美國(guó)奧豪斯公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；DLSB-5／20低溫冷卻循環(huán)泵；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DKZ系列電熱恒溫振蕩槽（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥 法半夏、干姜、黃芩、黃連購(gòu)自安徽省亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓教授鑒定，分別為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit干燥塊莖、姜科植物姜Zingiber officinaleRosc的干燥根莖、唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根、毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch的干燥根莖。黃芩苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-201318，純度：93.3%）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-201212，純度：＞98%）；色譜乙腈、色譜甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；乙醇等其他試劑均為分析級(jí)；AB-8型大孔吸附樹(shù)脂（滄州寶恩吸附樹(shù)脂材料有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 上樣溶液的制備 取法半夏、干姜、黃芩、黃連，加入10倍量的65%乙醇溶液加熱回流3次，每次2 h，濾過(guò)，合并3次提取液，減壓回收至無(wú)醇味，加水稀釋至一定質(zhì)量溶度，即得。

2.2 HPLC法同時(shí)測(cè)定黃芩苷與鹽酸小檗堿含量

2.2.1 混合對(duì)照品貯備溶液的制備 精密稱定鹽酸小檗堿0.98 mg和在60℃減壓干燥4 h的黃芩苷3.20 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下的上樣溶液于大孔吸附樹(shù)脂中上樣，用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Diamonsil?C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈∶0.4%磷酸水＝25∶75；柱溫：35℃；流速：1 mL／min；進(jìn)樣體積：5μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取混合對(duì)照品貯備溶液0.2、0.5、1.0、3.0、5.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為對(duì)照品溶液。分別吸取不同濃度的對(duì)照品溶液5μL于液相中，按照“2.2.3項(xiàng)”下色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷回歸方程：Y＝16 358X－72 288，r＝0.999 9，表明黃芩苷在0.032～0.800μg范圍內(nèi)線性良好；鹽酸小檗堿回歸方程：Y＝19 556X－5 027.7，r＝0.999 9，表明鹽酸小檗堿在0.009 8～0.245 0μg范圍內(nèi)線性良好，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品與70%乙醇洗脫液的HPLC色譜圖

2.3 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理 取適量AB-8型大孔吸附樹(shù)脂，用95%乙醇浸泡24 h，使樹(shù)脂充分溶脹，溶脹后濕法裝柱。用95%乙醇清洗樹(shù)脂，檢查流出液，至流出液與水混合（1∶5）不呈白色渾濁為止，再用大量蒸餾水將樹(shù)脂洗至無(wú)醇味即可，備用。

2.4 AB-8型大孔吸附樹(shù)脂純化工藝研究

2.4.1 泄露曲線的繪制及樹(shù)脂最大吸附量的確定

精密稱取已預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹(shù)脂22 g，裝柱（1.8 cm×40 cm），柱體積約40 mL（下文樹(shù)脂裝柱與此一致）；取濃度為12.0 mg／mL上樣溶液，以2 BV／h流速上樣吸附，按份收集流出液，每份20 mL（0.5 BV）；測(cè)定流出液中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算累計(jì)流出液中黃芩苷和鹽酸小檗堿的泄露百分率，以泄露率為縱坐標(biāo)，累計(jì)流份為橫坐標(biāo)繪制泄漏曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2可知：收集流出液至第90份（45 BV）時(shí)，鹽酸小檗堿的泄露率為3.2%左右，黃芩苷的泄露率為9.2%，接近10%的泄漏點(diǎn)，故確定最大上樣量為40 BV，即最大上樣量（飲片量）為19.2 g。

圖2 黃芩苷和鹽酸小檗堿泄露曲線

最大上樣量（飲品量）＝柱體積×最大上樣量×樣品濃度

2.4.2 吸附與洗脫條件的單因素考察

2.4.2.1 上樣液濃度考察 照“2.1”項(xiàng)下方法，制備濃度分別為10、15、20、25、30 mg／mL上樣液，每份含中藥飲片量為19.2 g；以4 BV／h流速上樣吸附后，先以5 BV蒸餾水洗脫雜質(zhì)，再以70%乙醇4 BV／h流速進(jìn)行洗脫，收集5 BV的洗脫液，測(cè)定其中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明在上樣液濃度為20、25 mg／mL時(shí)，黃芩苷、鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率差別不大；但上樣液濃度大于25 mg／mL時(shí)，出現(xiàn)絮狀沉淀，堵塞樹(shù)脂柱。故確定上樣液濃度為20 mg／mL。見(jiàn)圖3。

圖3 黃芩苷和鹽酸小檗堿上樣液濃度考察

轉(zhuǎn)移率／%＝（洗脫液中樣品濃度×洗脫體積／上樣液中樣品濃度×上樣體積）×100%

2.4.2.2 上樣液pH值考察 取濃度為20 mg／mL上樣液，分別用1.0 mol／L HCL和1.0 mol／L NaOH調(diào)pH值為2、4、6、8、10；以4 BV／h流速上樣吸附后，先以5 BV蒸餾水洗脫雜質(zhì)，再以70%乙醇4 BV／h流速進(jìn)行洗脫，收集5 BV洗脫液，測(cè)定其中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明上樣液pH值分別為4、6時(shí)，黃芩苷和鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率均較高，且上樣原液pH為4.5左右，故確定用原液作上樣液。見(jiàn)圖4。

圖4 上樣液pH值考察

2.4.2.3 上樣流速考察 取濃度為20 mg／mL上樣液，分別以2、3、4、5、6 BV／h流速上樣吸附后，先以5 BV蒸餾水洗脫雜質(zhì)，再以70%乙醇4 BV／h流速進(jìn)行洗脫，收集5 BV洗脫液，測(cè)定其中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明上樣流速對(duì)黃芩苷和鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率影響不大，考慮效率及減輕對(duì)樹(shù)脂的影響，故確定上樣液流速為4.0 BV／h。見(jiàn)圖5。

圖5 黃芩苷和鹽酸小檗堿上樣液流速考察

2.4.2.4 梯度洗脫曲線 取濃度為20 mg／mL上樣液，以4 BV／h流速上樣吸附后，先用5 BV蒸餾水洗脫雜質(zhì)，再依次用10%、30%、50%、70%、90%乙醇各5 BV進(jìn)行洗脫，洗脫流速為4 BV／h，分段收集洗脫液，每1 BV的流出液為一流份；測(cè)定其中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率；以流份為橫坐標(biāo)，黃芩苷和鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率為縱坐標(biāo)，繪制梯度洗脫曲線。結(jié)果顯示：30%乙醇洗脫液（10→15）中出現(xiàn)少量的黃芩苷和鹽酸小檗堿，50%乙醇洗脫液（15→20）已洗脫大部分的黃芩苷和鹽酸小檗堿，70%乙醇洗脫液（20→25）中含少量的黃芩苷和鹽酸小檗堿。表明50%～70%乙醇能將大部分黃芩苷和鹽酸小檗堿洗脫下來(lái)，因此選擇50%、60%、70%乙醇進(jìn)行進(jìn)一步的濃度篩選。見(jiàn)圖6。

圖6 黃芩苷和鹽酸小檗堿的梯度洗脫曲線

2.4.2.5 洗脫劑濃度的選擇 取濃度為20 mg／mL上樣液，以4 BV／h流速上樣吸附后，先以5 BV蒸餾水洗脫雜質(zhì)，再分別用50%、60%、70%乙醇洗脫，各收集洗脫液200 mL，測(cè)定其中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。黃芩苷的洗脫率分別為75.62%、87.82%、89.99%，鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率分別為78.62%、95.52%、96.40%。結(jié)果表明70%乙醇洗脫液對(duì)黃芩苷和鹽酸小檗堿的洗脫能力較強(qiáng)，故選用70%乙醇作為洗脫劑。

2.4.2.6 洗脫劑用量的考察 取濃度為20 mg／mL上樣液，以4 BV／h流速上樣吸附后，先以5 BV蒸餾水洗脫雜質(zhì)，再用70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每份為1 BV，至流出液無(wú)顏色，測(cè)定其中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量。以流份為橫坐標(biāo)，累積洗脫率為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。結(jié)果顯示當(dāng)洗脫液用量達(dá)4 BV后，黃芩苷和鹽酸小檗堿的累積洗脫率不再增加，故確定洗脫劑用量為4 BV。見(jiàn)圖7。

圖7 黃芩苷和鹽酸小檗堿的洗脫曲線

累積洗脫率／%＝累計(jì)洗脫液中樣品含量／上樣液中樣品含量×100%

2.4.2.7 洗脫劑pH值的考察 取濃度為20 mg／mL上樣液，以4 BV／h流速上樣吸附后，先以5 BV蒸餾水洗脫雜質(zhì)，再用pH分別為4、6、8的70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集4 BV的洗脫液，測(cè)定洗脫液中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果顯示黃芩苷的轉(zhuǎn)移率分別為81.81%、85.99%、88.30%，鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率分別為85.09%、91.06%、96.92%，表明pH值為8的70%乙醇洗脫液對(duì)黃芩苷和鹽酸小檗堿的洗脫能力較強(qiáng)，故選用pH值為8的70%乙醇作為洗脫劑。

2.4.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化AB-8型大孔吸附樹(shù)脂的吸附條件

2.4.3.1 因素-水平設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇上樣液濃度（A）、上樣液pH（B）、上樣流速（C）3個(gè)因素作為考察對(duì)象，用正交試驗(yàn)表L9（34）安排9次試驗(yàn)，以綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，即Y＝40%×（X1／X1max）＋40%×（X2／X2max）＋20%×（2－X3／X3min），對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。正交因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交因素水平表

2.4.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 精密稱取已預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹(shù)脂22 g，裝柱（1.8 cm×40 cm），柱體積約40 mL。按表2中的條件進(jìn)行上樣后，先以5 BV蒸餾水洗脫，再用pH＝8的70%乙醇以4 BV／h流速洗脫，收集4 BV洗脫液，測(cè)定其中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.3.3 干膏率測(cè)定 精密吸取正交試驗(yàn)洗脫液50 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，置于105℃的烘箱中，烘干3 h后放入干燥器中冷卻30 min，精密稱量，計(jì)算干膏率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.3.4 結(jié)果分析 由表2可知：各因素對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附結(jié)果的影響為A＞C＞B，即上樣濃度對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附影響最大，其次是上樣流速、上樣pH。由表3方差分析結(jié)果可知：上樣濃度對(duì)大孔吸附樹(shù)脂的吸附有顯著影響（P＜0.01），而上樣pH、上樣流速對(duì)大孔吸附樹(shù)脂的吸附無(wú)顯著影響（P＞0.05）。由表2、表3可得AB-8型大孔吸附樹(shù)脂的吸附的優(yōu)選條件為A2B1C2，即大孔吸附樹(shù)脂的上樣優(yōu)化條件為上樣液濃度為20 mg／mL，上樣液pH值為4，上樣流速為4 BV／h，先以5 BV蒸餾水洗脫，再用pH＝8的70%乙醇以4 BV／h流速洗脫，收集4 BV洗脫液。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

2.4.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)的最佳工藝試驗(yàn)3批，結(jié)果見(jiàn)表4。表4顯示黃芩苷和鹽酸小檗堿的轉(zhuǎn)移率分別為88.74%、94.53%，干膏收率為5.96%，與正交表結(jié)果相吻合，表明該純化工藝穩(wěn)定可靠。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

半夏瀉心湯“辛開(kāi)苦降組”中黃芩的主要有效成分為黃芩苷，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗變態(tài)反應(yīng)等作用［6］，對(duì)胃腸道平滑肌有解痙作用［7］；黃連的主要有效成分鹽酸小檗堿具有抗菌、抗炎、抗?jié)兒兔庖哒{(diào)節(jié)作用［8-9］，具有保護(hù)胃黏膜、促進(jìn)胃潰瘍愈合、抑制幽門(mén)螺桿菌（HP）的作用［10-11］。且半夏瀉心湯治療急慢性胃炎、消化性潰瘍的作用，主要與黃芩苷、鹽酸小檗堿對(duì)H P的抑制作用有關(guān)［12-14］。所以，將黃芩苷與鹽酸小檗堿作為半夏瀉心湯“辛開(kāi)苦降組”組藥物提取液純化工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

相關(guān)文獻(xiàn)研究表明：前期以鹽酸小檗堿、黃芩苷的靜態(tài)吸附率及解吸率為指標(biāo)，對(duì)大孔吸附樹(shù)脂類(lèi)型進(jìn)行篩選，其中AB-8、HPD100對(duì)鹽酸小檗堿、黃芩苷均有較高的吸附率和解吸率［15-16］。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附考察，結(jié)果顯示AB-8的吸附速率常數(shù)要高于HPD100。所以，本文最后確定AB-8用于半夏瀉心湯“辛開(kāi)苦降組”藥物提取液的純化。

由于黃芩苷及鹽酸小檗堿在水中的溶解度較低，提取液回收乙醇后用水稀釋時(shí)，如果濃度過(guò)高，則會(huì)出現(xiàn)沉淀，導(dǎo)致出現(xiàn)堵塞大孔吸附樹(shù)脂的現(xiàn)象，從而影響藥液的純化效果。所以，在考察上樣液濃度時(shí)，上樣液濃度都較低，一般為10～30 mg／mL。