Rab18通過PPARγ下調(diào)PLIN2以減少巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積*

張 榮， 李曉歌▲， 陳雁斌， 蔣思怦， 楊 麗， 袁中華△

（1南華大學(xué)心血管疾病研究所，動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省動(dòng)脈硬化性疾病國際科技創(chuàng)新合作基地，湖南衡陽421001；2湘南學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南郴州423000）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是以脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥為主要病理基礎(chǔ)的疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明［1］。動(dòng)脈粥樣硬化的主要細(xì)胞學(xué)改變是泡沫細(xì)胞的形成，泡沫細(xì)胞是由巨噬細(xì)胞或血管壁平滑肌細(xì)胞攝入大量脂質(zhì)轉(zhuǎn)化而來。大量攝入的脂質(zhì)以脂滴（lipid droplets，LDs）的形式貯存在細(xì)胞內(nèi)［2］。減少脂滴數(shù)量，抑制脂質(zhì)蓄積有助于防治動(dòng)脈粥樣硬化。小GTP結(jié)合蛋白Rab18是位于脂滴表面的脂滴包被蛋白［3］，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和脂滴形成［4］。此外，有研究表明過表達(dá)Rab18時(shí)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積減少，能減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，但尚未闡明其具體機(jī)制［5-6］。

脂肪分化相關(guān)蛋白——脂滴包被蛋白2（perilip?in 2，PLIN2）是PAT家族中的一員，包裹在脂滴周圍［7］。參與脂滴形成和脂質(zhì)蓄積［8-9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)沉默表達(dá)PLIN2后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積減少，過表達(dá)PLIN2時(shí)脂質(zhì)蓄積增加［10］。過表達(dá)高活型Rab18明顯降低PLIN2表達(dá)，減少脂質(zhì)蓄積［11］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptorγ，PPARγ）是核受體超家族PPARs中的重要成員，主要分布在脂肪組織及巨噬細(xì)胞中，是脂質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)因子［12］。在PPARγ?/?小鼠中，脂質(zhì)蓄積明顯減少。PPARγ過表達(dá)可上調(diào)PLIN2表達(dá)，且促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積［13-14］。

Li等［15］發(fā)現(xiàn)，Rab21可通過PPARγ影響脂質(zhì)蓄積。Rab18與Rab21均為Rab家族成員，推測Rab18或許也可通過PPARγ來影響脂質(zhì)蓄積。此外，本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)PLIN2升高可促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積［16］。因此，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討Rab18是否通過影響PPARγ表達(dá)而調(diào)控PLIN2水平，進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

材料和方法

1 主要試劑

THP-1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。RPMI-1640培養(yǎng)液（HyClone）；胎牛血清（杭州四季青公司）；氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）購自奕源生物科技公司；Lipo-6000TM轉(zhuǎn)染試劑（上海碧云天生物科技公司）；表達(dá)高活型（high-ac?tivity，HA）Rab18［Rab18（Q67L）］、野生型（wildtype，WT）Rab18［Rab18（WT）］和低活型（low-activi?ty，LA）Rab18［Rab18（S22N）］的慢病毒載體質(zhì)粒及DH5α甘油菌購自佳和生物科技有限公司；PPARγ激動(dòng)劑GW1929和抑制劑T0070907購自MCE；抗PLIN2、PPARγ、Rab18和GAPDH抗體及山羊抗兔/抗鼠IgGⅡ抗均購自Proteintech；其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)THP-1巨噬細(xì)胞，視細(xì)胞生長狀態(tài)換液，細(xì)胞貼壁率約75%時(shí)傳代。

2.2 質(zhì)粒擴(kuò)增與檢測 根據(jù)Ozeki等［17］的報(bào)道，我們在巨噬細(xì)胞中，分別用Rab18（WT）、Rab18（Q67L）和Rab18（S22N）質(zhì)粒制備表達(dá)WT、HA和LA Rab18的細(xì)胞。將含Rab18（WT）、Rab18（Q67L）和Rab18（S22N）質(zhì)粒的菌液解凍混勻，用接種環(huán)蘸取菌液劃板，倒置放于37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~16 h。將不同活性的Rab18大腸桿菌視菌落生長情況，分別加入含有3 mL氨芐西林液體的培養(yǎng)液中，37℃搖床上擴(kuò)增12 h（220 r/min）。分別取1 mL擴(kuò)增后的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至100 mL液體培養(yǎng)液中，37℃搖床上（220 r/min）繼續(xù)擴(kuò)增大腸桿菌，12 h后收菌。將各菌液分別用無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒盒提取Rab18（WT）和Rab18（Q67L）、Rab18（S22N）質(zhì)粒，用紫外分光光度法測量A260/A280比值，檢測提取各質(zhì)粒的濃度及純度。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將THP-1巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天接種到不含抗生素的6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到75%左右后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別用250μL DMEM培養(yǎng)液稀釋5μg Rab18（WT）、Rab18（Q67L）和Rab18（S22N）質(zhì)粒靜置5 min，取10μL Lipo-6000TM轉(zhuǎn)染試劑用移液槍加入250μL DMEM培養(yǎng)液中靜置5 min。然后將上述試劑分別混勻靜置20 min后分別加入6孔板中，并置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~6 h。然后將6孔板中的培養(yǎng)基更換為只含血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1~2 d后用Western blot或熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效果。

2.4 油紅O染色 將THP-1細(xì)胞種于6孔板中，用50 mg/L ox-LDL孵育0、6、12和24 h，然后使用50 mg/L ox-LDL孵育24 h；PBS沖洗細(xì)胞（3次，每次10 min），在室溫下用4%甲醛溶液固定30 min，再次用PBS沖洗細(xì)胞（3次，每次10 min）后與新鮮的過濾油紅色O溶液一起孵育30 min；最后用蘇木素復(fù)染，在光學(xué)顯微鏡下記錄細(xì)胞的圖像并根據(jù)油紅O染色后的細(xì)胞內(nèi)脂滴的面積進(jìn)行半定量分析。

2.5 細(xì)胞免疫熒光染色 室溫下，用?20℃保存的100%乙醇固定細(xì)胞，10 min后用PBS清洗。室溫下，將固定好的細(xì)胞加入0.2%Triton X-100，5 min后用PBS清洗3 min×3次。然后，加入用PBS稀釋的5%的血清，室溫下封閉1 h。吸出封閉液，并加入稀釋好的Ⅰ抗，室溫下孵育1.5 h后用PBS清洗3 min×3次。加入棕色EP管中稀釋好的熒光Ⅱ抗，室溫、避光、潮濕條件下孵育1 h后，用PBS清洗3 min×3次。然后用DAPI染細(xì)胞核，10 min后避光拍照，存檔。

2.6 Western blot分析 將待提取的未處理THP-1細(xì)胞或經(jīng)轉(zhuǎn)染后的THP-1細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液置冰上裂解，提取總蛋白。使用BCA法對蛋白定量。制備10%SDS-PAGE分離蛋白，蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后經(jīng)脫脂牛奶4℃搖床封閉4 h，后分別加入相應(yīng)Ⅰ抗，4℃搖床上搖動(dòng)孵育過夜；用TBST以10 min每次清洗3次；接著加入對應(yīng)的Ⅱ抗，4℃搖床震蕩孵育2 h，TBST洗膜，使用ECL法進(jìn)行顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0、SPSS和Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，并作圖。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ox-LDL處理THP-1巨噬細(xì)胞不同時(shí)間后對Rab18、PPARγ和PLIN2表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的影響

用50 mg/L ox-LDL孵育THP-1巨噬細(xì)胞0、6、12和24 h。Western blot檢測結(jié)果顯示，在巨噬細(xì)胞中Rab18、PPARγ及PLIN2的蛋白表達(dá)水平在24 h內(nèi)隨ox-LDL處理時(shí)間的延長而增加（P<0.05），見圖1。

油紅O染色后脂質(zhì)半定量分析結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積隨著ox-LDL孵育時(shí)間的延長而不斷增多（P<0.05），見圖2。

2 不同活性Rab18對荷脂巨噬細(xì)胞內(nèi)PPARγ和PLIN2表達(dá)及脂質(zhì)蓄積的影響

不同活性Rab18質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫熒光染色圖見圖3。

Western blot檢測結(jié)果顯示，50 mg/L ox-LDL孵育各組細(xì)胞24 h后，WT組、HA組和LA組中Rab18表達(dá)較control組明顯升高，但各轉(zhuǎn)染組間Rab18表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4A；與control組相比，WT組和HA組細(xì)胞中PPARγ和PLIN2的表達(dá)量均顯著下降（P<0.05），LA組細(xì)胞中PPARγ和PLIN2表達(dá)無明顯變化，見圖4B。

油紅O染色結(jié)果顯示，與control相比，WT組與HA組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積均明顯減少（P<0.05），而LA組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積無明顯變化，見圖5。

3 Rab18對荷脂巨噬細(xì)胞內(nèi)PPARγ核轉(zhuǎn)位的影響

首先我們用免疫熒光法觀察荷脂巨噬細(xì)胞中Rab18與PPARγ的共定位情況，發(fā)現(xiàn)Rab18（紅色熒光）與PPARγ（綠色熒光）在荷脂巨噬細(xì)胞中確實(shí)存在免疫熒光共定位（圖6A）。然后，我們將細(xì)胞分為control組和HA組，用50 mg/L ox-LDL孵育24 h后，免疫熒光觀察PPARγ核轉(zhuǎn)位情況，結(jié)果顯示，與control組相比，HA組細(xì)胞核內(nèi)綠色熒光明顯減弱（圖6B）。

4 PPARγ激動(dòng)劑GW1929和抑制劑T0070907對表達(dá)HA Rab18的荷脂巨噬細(xì)胞中PLIN2表達(dá)及脂質(zhì)蓄積的影響

將細(xì)胞分為4組：control組、HA組、HA+GW1929（600 nmol/L孵育24 h）組和HA+T0070907（100 nmol/L孵育24 h）組，各組分別加入ox-LDL共孵育24 h。

Western blot檢測結(jié)果顯示，在荷脂巨噬細(xì)胞中，與control組相比，HA組PLIN2表達(dá)顯著降低（P<0.05）；HA組加入PPARγ激動(dòng)劑GW1929后，PLIN2表達(dá)明顯增多（P<0.05）；與HA組比，HA+T0070907組PLIN2表達(dá)進(jìn)一步降低（P<0.05），見圖7。

Figure 2.Lipid accumulation was increased in THP-1 macrophages with the extension of ox-LDL incubation time（oil red O staining，sclae bar=20μm）.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs0 h group.圖2 隨著ox-LDL孵育時(shí)間的延長巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積增加

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與control組相比，HA組中PLIN2熒光強(qiáng)度明顯減弱；與HA組相比，HA+GW1929組細(xì)胞中PLIN2熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；另外，HA+T0070907組細(xì)胞中PLIN2熒光強(qiáng)度較HA組進(jìn)一步減弱（P<0.05），見圖8。

油紅O染色結(jié)果顯示，與對照組相比，HA細(xì)胞組脂質(zhì)蓄積減少，加入PPARγ抑制劑后脂質(zhì)蓄積進(jìn)一步減少；與HA組相比，加入PPARγ激動(dòng)劑組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積明顯增加（P<0.05），見圖9。

討 論

AS性心腦血管疾病嚴(yán)重?fù)p害人體健康，是當(dāng)前病死率較高的一類疾病［18］，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，脂質(zhì)代謝異常是公認(rèn)的主要發(fā)病因素之一［19-20］。Rab18與以AS為病理基礎(chǔ)的心血管疾病密切相關(guān)［21］。Rab18存在于真核細(xì)胞幾乎全部的細(xì)胞器膜上，有活化和失活兩種形式［22］。Rab18中的G結(jié)構(gòu)域與GTP結(jié)合時(shí)Rab18活化并可以被募集在細(xì)胞器膜如脂滴膜上，進(jìn)而與其效應(yīng)蛋白相互作用，發(fā)揮膜運(yùn)輸、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用［17］；當(dāng)GTP轉(zhuǎn)換為GDP時(shí)，Rab18失活并失去生物學(xué)功能［23］。脂滴分解時(shí)高活型Rab18分布在脂滴的表面加速基礎(chǔ)脂肪的分解進(jìn)而減少脂質(zhì)蓄積［24］，這提示Rab18可通過減少泡沫細(xì)胞形成進(jìn)而抑制AS發(fā)生發(fā)展，但Rab18減少脂質(zhì)蓄積的具體機(jī)制尚不明了。本研究則表明，Rab18是通過PPARγ調(diào)控PLIN2的表達(dá)從而抑制了巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

Figure 3.Immunofluorescence experiments showed wild-type（WT），high-activity（HA）and low-activity（LA）Rab18 plasmid trans?fection situation.Rab18 visualized by FITC-conjugated AffiniPure（green）.The scale bar=20μm.圖3 野生型、高活型和低活型Rab18質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染情況

Figure 4.The changes of the expression of Rab18（A），PLIN2 and PPARγ（B）in the cells expressing wild-type（WT），high-activity（HA）and low-activity（LA）Rab18.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.圖4 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Rab18、PPARγ和PLIN2表達(dá)的變化

既往研究表明，PLIN2是脂滴膜上的重要圍脂滴蛋白［25］。PLIN2 N端的PAT結(jié)構(gòu)域維持脂滴的穩(wěn)定；其親脂性C端，促進(jìn)脂質(zhì)合成［9，25］。此外PLIN2能通過調(diào)節(jié)脂滴周圍脂肪合成與分解相關(guān)的酶，促進(jìn)脂滴中脂質(zhì)核心膽固醇酯和甘油三酯的合成，進(jìn)而增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積［8，26］。細(xì)胞受脂肪分解刺激時(shí)，泛素-蛋白酶體溶解PLIN2的N端，脂滴的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，細(xì)胞脂質(zhì)蓄積減少［25，27］。Makino等［28］研究顯示，Rab18與PLIN2均參與調(diào)節(jié)以AS為病理基礎(chǔ)的心血管疾病，且過表達(dá)高活型Rab18時(shí)PLIN2下調(diào)，但兩者之間的具體機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ是巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子［29］，其C端有配體結(jié)合區(qū)域，與配體結(jié)合后被激活，然后其N端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與視黃醇類X受體（reti?noicacid retinoid X receptor，RXR）結(jié)合形成異二聚體，進(jìn)而與下游基因啟動(dòng)區(qū)域中的DNA序列即過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（peroxisome proliferator re?sponse element，PPRE）序列相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄。PLIN2是PPARγ的靶基因之一，PPARγ可與PLIN2啟動(dòng)子上的PPRE序列相結(jié)合，促進(jìn)PLIN2的表達(dá)及LDs形成［30］。Rab21可通過PPARγ/肝X受體（liver X receptors，LXR）信號通路，促進(jìn)脂質(zhì)蓄積。Rab18與Rab21均為Rab家族中成員。由此我們猜想Rab18是否也可通過PPARγ調(diào)節(jié)脂質(zhì)蓄積。PPARγ 過表達(dá)時(shí)PLIN2的表達(dá)升高［29］，提示Rab18與PPARγ和PLIN2之間可能存在相互作用，但其具體機(jī)制尚不明確。

Figure 5.Changes in intracellular lipid accumulation in each transfection group（oil red O staining，sclae bar=20μm）.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group.圖5 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積變化情況

Figure 6.Co-localization of Rab18（red）and PPARγ（green）in lipid-laden macrophages（A），and the effect of Rab18 on PPARγ（green）protein and its nuclear（blue）translocation in lipid-laden macrophages（B）.The scale bar=20μm.圖6 荷脂巨噬細(xì)胞中Rab18與PPARγ共定位情況及Rab18對PPARγ蛋白及其核轉(zhuǎn)位的影響

Figure 7.Effects of GW1929 and T0070907 on the expression of PLIN2 in the lipid-laden macrophages expressing high-activity（HA）Rab18 were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs HA group.圖7 Western blot檢測GW1929和T0070907對表達(dá)高活型Rab18的荷脂巨噬細(xì)胞中PLIN2表達(dá)的影響

Figure 8.Effects of GW1929 and T0070907 on the expression of PLIN2 in the lipid-laden macrophages expressing high-activity（HA）Rab18 were detected by immunofluorescence staining（scale bar=20μm）.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs HA group.圖8 免疫熒光染色檢測GW1929和T0070907對表達(dá)高活型Rab18的荷脂巨噬細(xì)胞中PLIN2表達(dá)的影響

我們的研究結(jié)果顯示Rab18各活性轉(zhuǎn)染組間Rab18表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但表達(dá)野生型Rab18和高活型Rab18的細(xì)胞中PPARγ和PLIN2表達(dá)量均顯著下降，脂質(zhì)蓄積減少；表達(dá)低活型Rab18的細(xì)胞中PPARγ和PLIN2表達(dá)及脂質(zhì)蓄積均無明顯變化。不同活性Rab18在巨噬細(xì)胞中表達(dá)無差異但對PPARγ和PLIN2表達(dá)及脂質(zhì)蓄積影響不同，是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中不同活性Rab18發(fā)揮生物學(xué)作用的差異與其蛋白表達(dá)量無關(guān)，而與其自身生物學(xué)功能有關(guān)［31］。這進(jìn)一步說明Rab18與PPARγ可能存在相互作用。同時(shí)，我們觀察到Rab18與PPARγ存在共定位，表達(dá)高活型Rab18的細(xì)胞中轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)的PPARγ明顯減少，且細(xì)胞內(nèi)PPARγ含量明顯降低。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，Rab18能下調(diào)PPARγ表達(dá)，且抑制PPARγ轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)。轉(zhuǎn)入細(xì)胞核的PPARγ減少，是否會(huì)影響其下游基因PLIN2表達(dá)尚待進(jìn)一步研究。Kim等［13］發(fā)現(xiàn)PPARγ激動(dòng)時(shí)PLIN2表達(dá)明顯上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)高活型Rab18的細(xì)胞中PPARγ激動(dòng)時(shí)，PLIN2表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。這說明活化的Rab18能抑制PPARγ激動(dòng)時(shí)對PLIN2表達(dá)的促進(jìn)作用。另外，我們的檢測結(jié)果顯示表達(dá)高活型Rab18的細(xì)胞中PPARγ被抑制時(shí)，Rab18抑制PLIN2的作用進(jìn)一步增強(qiáng)，說明Rab18可通過PPARγ影響PLIN2的表達(dá)，從而調(diào)控巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。

Figure 9.Effects of GW1929 and T0070907 on lipid accumulation in the lipid-laden macrophages expressing high-activity（HA）Rab18（oil red Ostaining，sclae bar=20μm）.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs HA group.圖9 GW1929和T0070907對過表達(dá)Rab18的荷脂巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)表明，Rab18可減少巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，其發(fā)生機(jī)制是通過PPARγ下調(diào)PLIN2的表達(dá)，從而減少細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。這一機(jī)制的發(fā)現(xiàn)可能為AS的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。