Npas4在小鼠原代神經(jīng)元體外氧糖剝奪/復(fù)氧損傷中的保護(hù)作用及其可能機(jī)制*

石子璇， 饒 維， 姬廣輝， 腰向穎△

（解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心1中醫(yī)內(nèi)科，2神經(jīng)外科，北京100048）

腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)急重癥，其流行率、發(fā)病率和死亡率均較高，已成為我國(guó)居民的首要死因及成人首要致殘?jiān)颍?-2］，而缺血性腦卒中在其中占比高達(dá)67.3%~80.5%［3］。盡管目前多種再灌注治療手段（如溶栓、取栓及閉塞再通等）在臨床廣泛應(yīng)用，但目前仍缺乏有效的臨床干預(yù)靶點(diǎn)及神經(jīng)保護(hù)藥物［4-5］。神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4（neuronal Per-Arnt-Sim domain protein 4，Npas4）是堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，幾乎僅表達(dá)于腦組織，參與調(diào)節(jié)抑制性突觸發(fā)育及突觸可塑性，在學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮重要作用；同時(shí)，Npas4也是一種神經(jīng)元興奮相關(guān)的即早基因，與多種神經(jīng)退行性疾病關(guān)系密切［5］。部分研究也揭示Npas4可減輕缺血性腦損傷，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用［6］。然而，神經(jīng)元氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）損傷后，Npas4的表達(dá)規(guī)律及其具體作用目前尚不清楚。本項(xiàng)工作擬構(gòu)建小鼠原代皮層神經(jīng)元OGD/R模型，觀察損傷后Npas4的時(shí)間變化規(guī)律，并通過(guò)基因干預(yù)下調(diào)Npas4的表達(dá)，探討其在神經(jīng)元OGD/R損傷中的作用及其可能機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

C57BL/6孕鼠，孕14~15 d，22~25 g，SPF級(jí)，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK（陜）-2019-001。神經(jīng)元培養(yǎng)液（Neuro?basal?、B27和GlutaMAX?）及Dulbecco改良Eagle培養(yǎng) 液（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）（Thermo Fisher Scientific）；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（TaKaRa）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8；上海生工生物工程公司）；Western blot試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；抗Npas4抗體（NeuroMab）；抗Homer1a抗體（Santa Cruz）；抗caspase-3和cleaved caspase-3抗體（Cell Signaling Technology）；無(wú)關(guān)序列（scramble）及Npas4短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒顆粒（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）。

2 主要方法

2.1 小鼠原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng) 孕14~15 d C57BL/6小鼠予以頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下分離胎鼠皮層，置于含有預(yù)冷的DMEM中，剪碎后加入0.15%胰蛋白酶37℃孵箱酶解10 min，于DMEM（含10%胎牛血清）中終止酶解，54×g離心5 min，棄上清，重復(fù)終止酶解步驟1次，加入DMEM（含10%胎牛血清），輕柔吹打制備單細(xì)胞懸液，70μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，接種于100 mg/L多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)6 h后，更換為Neurobasal完全培養(yǎng)液，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，后每3 d半量換液，培養(yǎng)至第9天待用。

2.2 OGD/R模型制備 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成熟原代神經(jīng)元，更換培養(yǎng)液為無(wú)糖Neurobasal培養(yǎng)液，置于缺氧培養(yǎng)箱（氧濃度監(jiān)測(cè)<1%，N∶2CO2=95%∶5%）中培養(yǎng)3 h后更換為Neurobasal完全培養(yǎng)液，正常培養(yǎng)箱（空氣∶CO2=95%∶5%）中培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)所需時(shí)點(diǎn)后，予以下一步處理。

2.3 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè) 采用Cytotoxicity Detection Kitplus進(jìn)行LDH檢測(cè)，收集培養(yǎng)液上清離心，后取上清液100μL加入96孔板中，加入100μL工作液，震蕩后避光孵育30 min，加入50μL終止液，酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)490 nm）測(cè)定吸光度（A）值，絕對(duì)測(cè)量值=測(cè)量值?空白對(duì)照值（正常完全培養(yǎng)液）。神經(jīng)毒性（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值?低對(duì)照A值）（/高對(duì)照A值?低對(duì)照A值）×100%。（低對(duì)照：未處理組培養(yǎng)液上清液；高對(duì)照：未處理組加入酶解溶液后的培養(yǎng)液上清液；實(shí)驗(yàn)組：處理組培養(yǎng)液上清液）。

2.4 Npas4-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及感染Npas4-shRNA（5′-GGTTGACCCTGATAATTTA-3′）及其無(wú)關(guān)序列（5′-GGTTCAGCGTCATAATTTA-3′）載體構(gòu)建及慢病毒包裹均委托于上海吉?jiǎng)P基因公司。待神經(jīng)元培養(yǎng)至第5天，按梯度濃度加入慢病毒顆粒，6~8 h后予以換液，培養(yǎng)至第8天后造模并提取mRNA及蛋白，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，選取合適的感染指數(shù)，后按此感染指數(shù)進(jìn)行神經(jīng)元基因干預(yù)造模。

2.5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 按照TaKaRa MiniBEST Uni?versal RNA Extraction Kit說(shuō)明書(shū)提取RNA，濃度定量后，據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行20μL體系反轉(zhuǎn)錄及25μL體系qPCR，待反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行mRNA相對(duì)表達(dá)水平的分析。所使用引物均由TaKaRa合成：Npas4的上游引 物 序 列 為5′-CAGGATGACTCACACTGACAG?TATTTTTAG-3′，下游引物序列為5′-GTGGGAGA?AGAGCTATTTATATCACCAG-3′；Homer1a的上游引物序列為5′-GGCAAACACTGTTTATGGACTGG-3′，下游引物序列為5′-GTAATTCAGTCAACTTGAG?CAACC-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-GGGT?CAGAAGGATTCCTATG-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3′。

2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液（含1%蛋白酶及磷酸酶抑制劑）提取全細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取20μL總蛋白行10%~12%SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)于醋酸纖維膜，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入I抗孵育過(guò)夜［Npas4（1∶500），Homer1a（1∶200），caspase-3和cleaved caspase-3（1∶1 000）及 β-actin（1∶4 000）］，PBST潤(rùn)洗3次，加入Ⅱ抗，室溫孵育1.5 h，PBST洗膜3次，增強(qiáng)型HRP化學(xué)發(fā)光液顯影壓片，采用Gel-pro軟件進(jìn)行各個(gè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及圖表制作，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 OGD/R損傷后，小鼠原代皮層神經(jīng)元中Npas4和Homer1a表達(dá)水平上調(diào)

與對(duì)照組相比，OGD/R損傷后原代皮層神經(jīng)元胞體皺縮、空泡化，并出現(xiàn)部分突起連接斷裂，見(jiàn)圖1；OGD/R損傷早期，Npas4（OGD 3 h和OGD/R 1 h）及Homer1a（OGD/R 1 h、OGD/R 3 h和OGD/R 6 h）的mRNA水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），后逐漸恢復(fù)至正常水平，見(jiàn)圖2。我們進(jìn)一步檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平，Western blot結(jié)果顯示Npas4和Homer1a的蛋白表達(dá)與mRNA變化趨勢(shì)基本一致（P<0.05），見(jiàn)圖3。

Figure 1.Morphological changes of primarily cultured cortical neurons.The scale bar=50μm.Compared with con?trol group（left），significant morphological changes were observed in OGD 3 h group（right），including neuronal debris，vacuolation and breakdown of neuro?nal networks.圖1 原代皮層神經(jīng)元的形態(tài)改變

2 Npas4-shRNA顯著降低OGD/R引起的Npas4表達(dá)上調(diào)

為明確Npas4在OGD/R中的作用，采用Npas4-shRNA下調(diào)Npas4的表達(dá)水平。OGD/R損傷后1 h，其mRNA及蛋白水平均達(dá)高峰，故此時(shí)點(diǎn)用于Npas4-shRNA下調(diào)效率驗(yàn)證。與無(wú)關(guān)序列組相比，Npas4-shRNA可顯著降低OGD/R所引起的Npas4蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05），見(jiàn)圖4，以此條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 2.The mRNA levels of Npas4 and Homer1a in neurons were up-regulated in the early stage of OGD/R injury.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.圖2 OGD/R損傷早期神經(jīng)元中Npas4和Homer1a的mRNA水平上調(diào)

Figure 3.The protein levels of Npas4 and Homer1a in neurons were up-regulated in the early stage of OGD/R injury.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.圖3 OGD/R損傷早期神經(jīng)元中Npas4和Homer1a的蛋白表達(dá)水平上調(diào)

3 下調(diào)Npas4加重OGD/R引起的神經(jīng)元損傷

下調(diào)Npas4的表達(dá)后予以O(shè)GD/R造模，24 h后采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，OGD/R組神經(jīng)元細(xì)胞活力顯著降低（P<0.05）；與OGD/R組及無(wú)關(guān)序列組相比，Npas4-shRNA組神經(jīng)元細(xì)胞活力進(jìn)一步降低（P<0.05），而OGD/R組與無(wú)關(guān)序列組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖5A。進(jìn)一步采用LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)驗(yàn)證神經(jīng)元損傷情況，與對(duì)照組相比，OGD/R組LDH釋放顯著增加（P<0.05）；與OGD/R組及無(wú)關(guān)序列組相比，Npas4-shR?NA組LDH釋放進(jìn)一步升高（P<0.05），OGD/R組與無(wú)關(guān)序列組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖5B。

Figure 4.The expression of Npas4 was knocked down by trans?fection with Npas4-shRNA.The protein level of Npas4 at 1 h after OGD/R injury were detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/Rgroup.圖4 Npas4-shRNA敲減神經(jīng)元中Npas4的表達(dá)

4 下調(diào)Npas4加重OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡

進(jìn)一步采用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以明確神經(jīng)元凋亡的改變，結(jié)果顯示，與OGD/R及無(wú)關(guān)序列組相比，Npas4 shRNA組中Bax/Bcl-2及cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖6。

5 下調(diào)Npas4降低OGD/R引起的Homer1a表達(dá)上調(diào)

與對(duì)照組相比，OGD/R組Homer1a蛋白水平顯著上調(diào)（P<0.05）；與OGD/R組及無(wú)關(guān)序列組相比，Npas4-shRNA組Homer1a蛋白水平顯著降低（P<0.05），OGD/R組與無(wú)關(guān)序列組間蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖7。

Figure 5.Down-regulation of Npas4 aggravated neuronal injury after OGD/R.A：the cell viability was detected by CCK-8 assay；B：the LDH release was detected by Cytotoxicity Detection KitPLUS.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/R group.圖5 下調(diào)Npas4加重OGD/R引起的神經(jīng)元損傷

討 論

Npas4是新近發(fā)現(xiàn)的鈣依賴性轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)突觸興奮-抑制的動(dòng)態(tài)平衡，在神經(jīng)環(huán)路的形成及調(diào)控突觸可塑性中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)的小鼠原代皮層神經(jīng)元建立OGD/R模型，模擬腦缺血再灌注損傷，揭示Npas4在OGD/R損傷中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

既往研究表明，Npas4可被多種應(yīng)激條件快速誘導(dǎo)表達(dá)，如神經(jīng)元興奮、癲癇及缺血等［7-8］。本研究顯示，OGD/R損傷可引起Npas4的表達(dá)動(dòng)態(tài)升高——損傷早期顯著升高，后逐步恢復(fù)至生理水平。而神經(jīng)元興奮-抑制失衡，即興奮性毒性，是腦缺血性損傷的關(guān)鍵致傷機(jī)制；同時(shí)，已有研究表明Npas4可增強(qiáng)抑制性突觸傳遞，是神經(jīng)元興奮-抑制平衡重要調(diào)節(jié)分子［4，9］。據(jù)此，我們推測(cè)OGD/R損傷后，誘導(dǎo)高表達(dá)的Npas4可能通過(guò)減輕神經(jīng)元興奮-抑制失衡，從而減輕興奮性毒性而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步的Npas4基因干預(yù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)上述推論。慢病毒介導(dǎo)的Npas4表達(dá)下調(diào)，加重OGD/R所引起的神經(jīng)元損傷，包括神經(jīng)元活性降低、LDH釋放量增加及細(xì)胞凋亡增加。因此，我們推測(cè)Npas4可減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。

Figure 6.Down-regulation of Npas4 aggravated neuronal apopto?sis after OGD/R.The protein levels of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleaved caspase-3 at 1 h after OGD/R injury were detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/Rgroup.圖6 下調(diào)Npas4加重OGD/R引起的神經(jīng)元凋亡

Figure 7.Down-regulation of Npas4 inhibited the up-regulation of Homer1a induced by OGD/R.The protein expres?sion of Homer1a at 1 h after OGD/R injury were de?tected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/Rgroup.圖7 下調(diào)Npas4抑制OGD/R引起的Homer1a表達(dá)上調(diào)

作為一重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，Npas4的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制及其下游效應(yīng)分子仍需進(jìn)一步探討。既往研究提示，Homer1a是突觸興奮-抑制平衡的重要直接調(diào)控分子，也是神經(jīng)元興奮性損傷的重要保護(hù)分子，然而其具體表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍尚不清楚［10-13］。部分研究提示，Npas4與Homer1a基因啟動(dòng)子存在相互作用［14-15］；此外，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）不僅是Homer1a的表達(dá)上調(diào)分子，同時(shí)也是Npas4重要的靶基因之一［7］。據(jù)此，我們推測(cè)Npas4可能通過(guò)上調(diào)Homer1a的表達(dá)，從而減輕OGD/R介導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性損傷。我們的研究結(jié)果表明，OGD/R損傷后，Npas4的mRNA與蛋白表達(dá)高峰均早于Homer1a，提示Npas4可能誘導(dǎo)Homer1a表達(dá)；同時(shí)，下調(diào)Npas4的表達(dá)后，Homer1a的表達(dá)水平也顯著降低?？偨Y(jié)上述結(jié)果，OGD/R損傷后，Npas4的表達(dá)上調(diào)，并可能通過(guò)上調(diào)Homer1a的表達(dá)，從而調(diào)控神經(jīng)元興奮-抑制平衡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，OGD/R損傷后，Npas4表達(dá)呈動(dòng)態(tài)上調(diào)，且可能通過(guò)上調(diào)Homer1a發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。然而，本研究?jī)H通過(guò)基因下調(diào)反向證明Npas4的神經(jīng)保護(hù)作用，Npas4過(guò)表達(dá)及其在體腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn)仍需進(jìn)一步完成，以闡明Npas4在腦缺血再灌注損傷中的確切作用及機(jī)制，為腦缺血治療提供一定的參考資料。