卡絡(luò)磺鈉通過抑制parkin介導(dǎo)的線粒體自噬減輕膿毒癥大鼠的肺損傷*

王佳興， 付鶴鵬， 王蓓蕾， 于井剛， 劉向迪， 劉瑩瑩， 徐 成， 張玉想△

（1解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心重癥醫(yī)學(xué)科，北京100091；2滄州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北滄州061001）

膿毒癥的病理生理特征是感染引起宿主體內(nèi)失控性的炎癥反應(yīng)，這導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)組織和器官功能損傷，嚴(yán)重可進(jìn)展為多臟器功能衰竭［1］。急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是膿毒癥的并發(fā)癥之一［2］。但目前對(duì)膿毒癥肺損傷的機(jī)制和治療方法仍不十分明確。

線粒體自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)受損線粒體，是線粒體動(dòng)態(tài)平衡的重要保護(hù)機(jī)制［3-4］。然而，線粒體自噬的過度激活則會(huì)加重線粒體損傷，加速細(xì)胞衰亡［5］。Pink1（PTEN-induced putative kinase 1）/parkin通路是線粒體自噬的經(jīng)典通路之一。已有研究證實(shí)，parkin參與了膿毒癥肺損傷的形成，抑制parkin的過度表達(dá)則可減輕膿毒癥引起的肺損傷［6-7］。

卡絡(luò)磺鈉（carbazochrome sodium sulfonate，Car）是一種腎上腺色素縮氨脲與磺酸鈉的復(fù)合物，其主要是通過提高毛細(xì)血管壁的彈性而降低血管通透性，增強(qiáng)血管損傷部位的回縮能力而減少出血或止血［8］。既往研究顯示，卡絡(luò)磺鈉可以降低大鼠肺血管通透性，減輕大鼠放射性肺損傷［9］。本研究通過建立盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）膿毒癥大鼠模型，觀察卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥大鼠生存率、肺影像學(xué)、肺組織病理學(xué)、肺血管通透性及肺組織凋亡和線粒體自噬水平的影響，探討其可能機(jī)制，為膿毒癥肺損傷的救治提供參考資料。

材料和方法

1 材料

清潔級(jí)8周齡雄性Wistar大鼠115只，體重220~240 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)為SYXK（軍）2012-0016。注射用卡絡(luò)磺鈉（武漢華龍生物制藥有限公司，每支20 mg）；伊文思藍(lán)（Evans blue，EB；Sigma）；TUNEL試劑盒（Roche）；兔抗大鼠parkin多克隆抗體和小鼠抗大鼠Tom20單克隆抗體（Abcam）；兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和GADPH多克隆抗體（CST）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體（北京中衫生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Micro-CT系統(tǒng)（Sie?mens）；DM4000 B光學(xué)顯微鏡（Leica）；Spot On圖像采集處理系統(tǒng)（Nikon）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 膿毒癥大鼠模型制備 按照Hubbard等［10］報(bào)道的方法行大鼠CLP，復(fù)制嚴(yán)重腹腔感染致膿毒癥模型。動(dòng)物術(shù)前稱重、編號(hào)，并禁食12 h，自由飲水。3%戊巴比妥（40 mg/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后固定，沿腹中線做一長(zhǎng)約15 cm的切口，逐層切開，暴露直腸并小心游離其盲端，在距盲端1 cm處結(jié)扎，用18號(hào)針頭貫穿2次，擠出少量腸內(nèi)容物，并留置一條2 mm寬的橡皮條貫通盲腸，防止針孔閉合。然后將盲腸小心移入腹腔，逐層縫合腹壁切口。術(shù)后動(dòng)物可自由活動(dòng)和飲水。假手術(shù)組只開腹翻動(dòng)腸管后關(guān)腹，不結(jié)扎和穿孔盲腸。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、膿毒癥組、卡絡(luò)磺鈉低劑量（8 mg/kg）組、卡絡(luò)磺鈉中劑量（40 mg/kg）組和卡絡(luò)磺鈉高劑量（80 mg/kg）組，每組23只大鼠，其中每組15只大鼠用于生存率研究，其余8只大鼠用于術(shù)后24 h研究。實(shí)驗(yàn)過程均經(jīng)解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。假手術(shù)組除不結(jié)扎盲腸及盲腸穿孔外，余同膿毒癥組?？ńj(luò)磺鈉低、中、高劑量組大鼠分別于術(shù)后即刻、8 h和16 h用不同劑量的注射用卡絡(luò)磺鈉（8、40和80 mg/kg，腹腔內(nèi)注射）干預(yù)。膿毒癥組大鼠于同時(shí)點(diǎn)腹腔注射等體積生理鹽水。

2.3 大鼠72 h生存率的觀察 每組隨機(jī)取15只大鼠，術(shù)后分別于6、12、24、36、48和72 h觀察其生存情況并記錄，計(jì)算各組生存率。

2.4 大鼠肺部Micro-CT檢測(cè) 術(shù)后24 h，采用異氟烷吸入將大鼠麻醉，利用Micro-CT儀記錄大鼠肺部的影像學(xué)，測(cè)量參數(shù)：攝片時(shí)間120 s，電壓90 kV，電流160μA，照片像素為40μm。

2.5 大鼠肺組織病理學(xué)觀察 剪取右肺下葉組織小塊，浸入4%多聚甲醛內(nèi)固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片（5μm），蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。在DM4000 B光學(xué)顯微鏡（×200）下隨機(jī)選取10個(gè)視野，參照Hong等［11］標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺組織病理損傷評(píng)分。評(píng)分項(xiàng)目包括肺泡腔充血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維蛋白滲出和肺泡間隔增寬，每項(xiàng)的評(píng)分按損傷程度分為0、1、2和3分，分別為無損傷、輕度損傷、中度和重度損傷，取其平均值。

2.6 大鼠肺血管通透性測(cè)定 采用EB染料滲出技術(shù)［12］。溶于生理鹽水的EB，以2 mL/kg從大鼠尾靜脈注射。然后用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）10 mL沖洗肺循環(huán)。取右下肺葉約0.2 g，浸泡在2 mL甲酰胺溶液中（10 mL/kg），然后與甲酰胺在60℃的條件下共孵育16 h，待肺組織中色素全部萃取出，取出組織，7 000×g離心10 min后取上清液，測(cè)量吸光度（A），并計(jì)算組織中的EB含量。

2.7 TUNEL法測(cè)定凋亡 大鼠肺組織石蠟切片經(jīng)過梯度乙醇脫蠟，脫水后，吹干，PBS清洗3次，封閉液室溫封閉1 h。以3%的H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min后，PBS清洗2次。按照TUNEL試劑盒說明要求，進(jìn)行TUNEL染色和DAPI染色，應(yīng)用熒光顯微鏡（Nikon）觀察肺組織中細(xì)胞凋亡情況。綠色熒光為凋亡細(xì)胞，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。每張切片顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算各組肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)。

2.8 Western blot測(cè)定大鼠肺組織中parkin和LC3的蛋白含量 100μg大鼠左肺組織裂解液進(jìn)行SDSPAGE，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉。Ⅰ抗為兔抗大鼠parkin（1∶1 000）和LC3（1∶800）多克隆抗體。Ⅱ抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。以GADPH作內(nèi)參照。以特異性蛋白條帶光密度值與對(duì)應(yīng)GADPH蛋白條帶光密度值間的比值對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。

2.9 免疫熒光檢測(cè) 大鼠肺組織石蠟切片經(jīng)過梯度乙醇脫蠟，脫水后，吹干，PBS清洗3次，1‰Triton-X-100與2%羊血清混合室溫封閉1 h。PBS清洗后，加入Ⅰ抗［兔抗大鼠多克隆抗體：Tom20（1∶100）、parkin（1∶50）或LC3（1∶50）］，4℃孵育過夜。清洗Ⅰ抗后，加入山羊抗兔熒光Ⅱ抗（DyLight 594，1∶500）或山羊抗小鼠熒光Ⅱ抗（DyLight 488，1∶500）后，室溫孵育30 min。PBS清洗后，DAPI染細(xì)胞核。應(yīng)用熒光顯微鏡（Nikon）觀察Tom20、parkin和LC3在肺組織中的表達(dá)情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（meann±SD）表示。多組之間比較采用單因素方差分析，多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥大鼠生存率的影響

與膿毒癥大鼠相比，所有卡絡(luò)磺鈉組大鼠的生存率均顯著升高（P<0.05）；與低劑量組相比，中劑量和高劑量卡絡(luò)磺鈉組大鼠的生存率也顯著升高（P<0.05）；而中劑量和高劑量之間的大鼠生存率無顯著差異（P>0.05），見圖1。

Figure 1.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）increased the survival rate of the septic rats.Mean±SD.n=15.**P<0.01 vs sham group；#P<0.05，##P<0.01 vs sepsis group；△P<0.05 vs Car（8 mg/kg）group.圖1 卡絡(luò)磺鈉提高膿毒癥大鼠生存率

2 卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥大鼠肺影像學(xué)的影響

大鼠肺Micro-CT結(jié)果顯示，膿毒癥大鼠雙肺可見斑片狀滲出，嚴(yán)重可發(fā)生肺不張和肺實(shí)變（圖2B紅色箭頭所示）。給予卡絡(luò)磺鈉干預(yù)后，大鼠雙肺的斑片滲出顯著減少，未見明顯的肺不張和肺實(shí)變；且隨著藥物劑量的增加，大鼠肺部炎癥表現(xiàn)逐步減輕，見圖2C~E。

3 卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥大鼠肺血管通透性的影響

如圖3所示，與假手術(shù)組相比，膿毒癥大鼠肺血管通透性顯著增加（P<0.05）；低劑量、中劑量和高劑量卡絡(luò)磺鈉組大鼠的肺血管通透性均低于膿毒癥組（P<0.05）；中、高劑量組大鼠的肺血管通透性較低劑量組均進(jìn)一步降低（P<0.05）。

4 卡絡(luò)磺鈉減輕膿毒癥引起的大鼠肺組織學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠肺組織肺泡壁光滑，肺泡腔無滲出且結(jié)構(gòu)清晰完整，見圖4A；膿毒癥組大鼠肺組織肺泡腔出現(xiàn)大量紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和血漿樣物質(zhì)滲出，肺泡間隔和肺泡壁明顯增厚不均，部分肺泡腔塌陷（圖4B），肺病理評(píng)分明顯增加；低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠肺部均呈一定程度的組織水腫和炎癥浸潤(rùn)，但嚴(yán)重程度均不及膿毒癥組，各組肺病理評(píng)分均低于膿毒癥組，中劑量組及高劑量組大鼠肺組織炎癥改變程度和肺病理評(píng)分較低劑量組進(jìn)一步降低，見圖4C~E。

Figure 2.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）alleviated the effusion and consolidation in the lung of septic rats.A：sham group；B：sepsis group，the lung of septic rats had presented the effusion and consolidation（red arrow），as evidenced by CT scanning；C：Car（8 mg/kg）group；D：Car（40 mg/kg）group）；E：Car（80 mg/kg）group.圖2 卡絡(luò)磺鈉減輕膿毒癥大鼠肺滲出和肺不張

Figure 3.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）decreased the pulmonary vascular permeability in septic rats.Mean±SD.n=8.#P<0.05 sham grouup；**P<0.01 vs sepsis group.圖3 卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥大鼠肺血管通透性的影響

5 卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥大鼠肺組織凋亡的影響

如圖5所示，與假手術(shù)組相比，膿毒癥大鼠肺組織的凋亡指數(shù)顯著升高（P<0.01）；卡絡(luò)磺鈉低劑量、中劑量和高劑量組大鼠肺組織的凋亡指數(shù)均低于膿毒癥組，且中、高劑量組大鼠肺組織的凋亡指數(shù)較低劑量組進(jìn)一步降低（P<0.01）。

6 卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥大鼠的肺組織中parkin和LC3表達(dá)的影響

如圖6所示，與假手術(shù)組相比，膿毒癥大鼠肺組織中parkin的表達(dá)顯著增多（P<0.05），自噬水平標(biāo)志物L(fēng)C3-II/LC3-I比值顯著升高（P<0.05）；卡絡(luò)磺鈉組大鼠肺組織中parkin表達(dá)及LC3-II/LC3-I比值與膿毒癥組相比均顯著降低（P<0.05），且上述改變具有藥物濃度依賴趨勢(shì)。

7 卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥大鼠肺組織中線粒體自噬水平的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠肺組織parkin熒光強(qiáng)度較弱（紅色熒光），parkin與Tom20（線粒體外膜標(biāo)志物）共染熒光（黃色熒光）也較弱；膿毒癥大鼠肺組織parkin熒光及parkin與Tom20共染熒光較假手術(shù)組均顯著增強(qiáng)；而與膿毒癥大鼠相比，卡絡(luò)磺鈉干預(yù)組大鼠肺組織的parkin熒光強(qiáng)度及parkin與Tom20共染熒光強(qiáng)度均減弱，這種變化呈一定的劑量依賴性，見圖7A。此外，假手術(shù)組大鼠肺組織LC3熒光強(qiáng)度較弱（紅色熒光），LC3與Tom20共染熒光（黃色熒光）也較弱；膿毒癥大鼠肺組織LC3熒光及LC3與Tom20共染熒光較假手術(shù)組均顯著增強(qiáng)；而與膿毒癥大鼠相比，卡絡(luò)磺鈉干預(yù)組大鼠肺組織的LC3熒光強(qiáng)度及LC3與Tom20共染熒光強(qiáng)度均明顯減弱，這種變化呈一定的劑量依賴性，見圖7B。

Figure 4.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）alleviated the pathological injury in lung tissues of the septic rats（HE staining，scale bar=50μm）.A：sham group；B：sepsis group；C：Car（8 mg/kg）group；D：Car（40 mg/kg）group；E：Car（80 mg/kg）group.Mean±SD.n=8.#P<0.05 vs shamgroup；**P<0.01 vs sepsisgroup.圖4 卡絡(luò)磺鈉減輕膿毒癥大鼠肺組織的病理損傷

Figure 5.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）reduced sepsis-induced apoptosis in the lung tissue of rats（TUNEL staining，scale bar=100μm）.Mean±SD.n=8.##P<0.01 vs sham group；**P<0.01 vs sepsis group.圖5 卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥大鼠肺組織凋亡的影響

Figure 6.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）increased the autophagic level in lung tissue of the septic rats.The expression of parkin and LC3 in the lung tissue of rats in each group was detected by Western blot.Mean±SD.n=8.##P<0.01 vs sham group；**P<0.01 vs sepsisgroup.圖6 卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥大鼠肺組織中線粒體自噬相關(guān)分子的影響

討 論

本研究表明，卡絡(luò)磺鈉可以提高膿毒癥大鼠的生存率，證實(shí)了卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥具有保護(hù)作用，且具有劑量依賴性。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，卡絡(luò)磺鈉可以減輕膿毒癥大鼠肺損傷時(shí)出現(xiàn)的肺毛細(xì)血管滲漏，改善膿毒癥大鼠急性肺損傷的病理特征性改變、減少細(xì)胞凋亡。由此可見在CLP致膿毒癥模型，卡絡(luò)磺鈉可以對(duì)急性肺損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，且該保護(hù)作用具有一定的劑量依賴性。

卡絡(luò)磺鈉是一種毛細(xì)血管穩(wěn)定劑，已被廣泛用于毛細(xì)血管脆弱性引發(fā)的出血的治療。在一個(gè)成人呼吸窘迫綜合征的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校ńj(luò)磺鈉已經(jīng)被報(bào)道可以降低肺血管通透性的增加以及減少由于碘克沙酸誘導(dǎo)而導(dǎo)致的動(dòng)脈氧分壓的降低［9］。我們的研究結(jié)果與上述研究相一致，卡絡(luò)磺鈉降低了膿毒癥引起的肺血管高通透性，改善了肺的氧合功能。除肺組織外，卡絡(luò)磺鈉被證實(shí)同樣可以減輕膀胱、前列腺、盆腔、關(guān)節(jié)腔等器官或組織發(fā)生病變時(shí)的血管高通透性，從而達(dá)到保護(hù)器官功能的作用［13-16］。創(chuàng)傷、感染和應(yīng)激等因素打擊機(jī)體時(shí)，機(jī)體內(nèi)可產(chǎn)生大量血管活性物質(zhì)，比如凝血酶，緩激肽和組胺等，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞中的磷脂酰肌醇水解和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）活化，進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)的三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）受體而造成細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高和鈣黏蛋白的降解，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間隙形成、血管通透性增加。而卡絡(luò)磺鈉可以抑制磷酸肌醇的水解，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高和PKC激活，從而降低血管內(nèi)皮通透性，減輕肺水腫的形成［17］。

線粒體自噬在維持線粒體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用［18］。研究證實(shí)，通過線粒體自噬清除損傷線粒體，可以減少活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，減輕肺損傷的發(fā)生［19］。然而，線粒體自噬程度過強(qiáng)反而對(duì)機(jī)體有害，降低線粒體自噬可以減輕肺損傷［20］。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)，CLP膿毒癥大鼠肺組織中LC3-II/LC3-I比值升高，LC3與線粒體共定位增強(qiáng)，提示膿毒癥引起肺組織線粒體自噬水平增強(qiáng)。該發(fā)現(xiàn)預(yù)示線粒體自噬過度增強(qiáng)可能并沒有維持正常的線粒體功能和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，反而促使了膿毒癥肺損傷的發(fā)生。這與既往研究相一致［7，20］。而卡絡(luò)磺鈉干預(yù)后，膿毒癥大鼠肺組織中自噬水平，尤其線粒體自噬強(qiáng)度，均明顯下降，且呈一定的濃度依賴性。因此我們的研究證實(shí)卡絡(luò)磺鈉可以降低膿毒癥大鼠肺組織中的線粒體自噬水平，抑制線粒體自噬過度激活，從而維持肺上皮中線粒體的功能，減輕膿毒癥肺損傷。

Figure 7.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）inhibited parkin-mediated mitophagy pathway in lung tissues of the septic rats（n=8，scale bar=50μm）.A：immunofluorescence showing the co-localization of parkin（red）and Tom20（green）；B：immu?nofluorescence showing the co-localization of LC3（red）and Tom20（green）.圖7 卡絡(luò)磺鈉對(duì)膿毒癥大鼠肺組織中parkin介導(dǎo)的線粒體自噬通路的影響

由parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是線粒體自噬經(jīng)典通路之一。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷，線粒體膜電位發(fā)生去極化，進(jìn)而招募胞漿中的parkin分子與受損線粒體膜表面相結(jié)合，從而介導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生［21］。膿毒癥引起肺組織中parkin表達(dá)增多，線粒體自噬水平增強(qiáng)；敲除或沉默parkin基因后，肺組織的線粒體自噬水平明顯降低，從而使膿毒癥導(dǎo)致的肺損傷明顯減輕，因此parkin介導(dǎo)的線粒體自噬過度增強(qiáng)是膿毒癥肺損傷的機(jī)制之一［7］。抑制或降低該通路的活性，可以減輕膿毒癥引起的肺損傷。我們的研究同樣顯示，膿毒癥大鼠肺組織中parkin蛋白表達(dá)顯著增多。進(jìn)一步的免疫熒光顯示，parkin與線粒體標(biāo)志物Tom20的共定位熒光在膿毒癥大鼠肺組織中明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，膿毒癥肺損傷發(fā)生時(shí)，par?kin介導(dǎo)的線粒體自噬水平明顯增強(qiáng)。而卡絡(luò)磺鈉干預(yù)后，膿毒癥大鼠肺組織中parkin的表達(dá)減少，parkin與Tom20的共定位明顯減弱。該結(jié)果證實(shí)，卡絡(luò)磺鈉可以抑制膿毒癥大鼠肺組織中parkin介導(dǎo)的線粒體自噬過度激活。這可能是卡絡(luò)磺鈉減輕膿毒癥肺損傷的機(jī)制之一。

綜上所述，卡絡(luò)磺鈉通過減少肺毛細(xì)血管滲漏，減輕肺組織細(xì)胞凋亡和病理損傷，從而減弱肺損傷程度，提高膿毒癥大鼠生存率?？ńj(luò)磺鈉減輕膿毒癥肺損傷的機(jī)制可能與其抑制parkin介導(dǎo)的線粒體自噬過度激活有關(guān)。