QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定3種β-受體激動劑

◎ 潘 璐，羅詩泳

（1.佛山市南海區(qū)里水鎮(zhèn)農(nóng)林服務(wù)中心，廣東 佛山 528000；2.佛山市沃特測試技術(shù)服務(wù)有限公司，廣東 佛山 528000）

β-型受體激動劑，又稱瘦肉精，是我國動物食品中禁止使用的藥品[1]，其中β2-受體激動劑屬于苯乙胺類藥物，苯環(huán)上連接有堿性的β-羥胺側(cè)鏈，能與無機(jī)酸或有機(jī)酸反應(yīng)生成鹽。按照苯環(huán)上的取代基的差異，可將β2-受體激動劑分為苯胺型和苯酚型。苯胺型為中等極性；苯酚型細(xì)分為鄰苯二酚型、間苯二酚型和水楊醇型，有較高極性[2]。本文測定的瘦肉精為克倫特羅（苯胺型）、沙丁胺醇（水楊醇型）和萊克多巴胺（間苯二酚型）。

目前的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測瘦肉精時，動物肌肉組織前處理采用酶水解，正己烷除脂，后用MCX固相萃取柱凈化[3]；或是酶水解與酸水解結(jié)合使用，后用HLB固相萃取柱、MCX固相萃取柱凈化[4-5]。這些方法的處理時間長、步驟煩瑣技術(shù)要求高，耗材成本也高。QuEChERS凈化法簡化了凈化的流程，操作簡便，但目前國家標(biāo)準(zhǔn)只有在測動物血液和尿液中的瘦肉精殘留量時使用[6]。本文采用酸化乙腈QuEChERS凈化與反萃前處理樣品，液相串聯(lián)質(zhì)譜測定，對克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺3種瘦肉精殘留量進(jìn)行了方法驗(yàn)證，探索了在動物肌肉組織中使用酶水解-QuEChERS凈化法測定瘦肉精的可能性。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源（美國ABSciex公司4500型）；氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（Sigma-Aldrich中國）；電子分析天平（分度值0.01）；食物攪拌機(jī)（艾美特電器有限公司）；旋渦混勻器（德國IKA公司）；尼龍針式過濾器（0.22 μm）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試劑

克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度均為100 μg·mL-1于甲醇，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所（農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心）提供。

乙腈（色譜純，德國Merck公司），甲酸（色譜純，上海阿拉丁公司），乙酸銨（分析純，上海阿拉丁公司），Bond Elut EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管（美國安捷倫公司，貨號5982-1010），Bond Elut dSPE EMR-Lipid Polish反萃管（美國安捷倫公司，貨號5982-0101），水（一級水，Milli-Q制備）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

瘦肉精混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。分別準(zhǔn)確量取適量的瘦肉精混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用50%乙腈溶液逐級稀釋，配制成濃度分別1 μg·L-1、2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1和20 μg·L-1，現(xiàn)配現(xiàn)用[7]。

1.3.2 試劑配制

5%酸化乙腈溶液：將5 mL甲酸加入95 mL乙腈中制得，現(xiàn)配現(xiàn)用；1 mol·L-1乙酸銨儲備液：將19.27 g乙酸銨溶解于250 mL水中，保存在4 ℃冰箱；5 mmol·L-1乙酸銨緩沖液：將5 mL的1 mol·L-1乙酸銨儲備液加入1 L水中，現(xiàn)配現(xiàn)用；50%乙腈溶液：準(zhǔn)確移取10 mL乙腈，用水定容至20 mL；流動相A：0.2%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液，將2 mL甲酸和2 mL的1 mol·L-1乙酸銨溶液用水定容至1 L，現(xiàn)配現(xiàn)用；流動相B：0.2%甲酸甲醇，取2 mL甲酸，用甲醇定容至1 L。

1.3.3 樣品前處理

取500 g豬肉樣品，去除筋膜，切小塊，用食物攪拌機(jī)打至勻漿。

稱取2 g（精確到0.1 g）豬肉勻漿后樣品，加入10 mL酸化乙腈和陶瓷均質(zhì)子，渦旋振蕩2 min；以5 000 r·min-1、4 ℃離 心5 min；在Bond Elut EMRLipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管中加入5 mL乙酸銨緩沖液和5.0 mL上清液，迅速渦旋震蕩1 min，以5 000 r·min-1、4 ℃離心5 min；取5 mL乙腈上清液加入到Bond Elut dSPE EMR-Lipid Polish反萃管中，迅速渦旋振蕩1 min，以5 000 r·min-1、4 ℃離心5 min；準(zhǔn)確吸取離心后的上清液0.2 mL用水定容至1 mL，混合后過0.22 μm尼龍針式過濾器后上機(jī)[7-9]。

1.3.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：2 μL，流速為0.4 mL·min-1；流動相A：0.2%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液；流動相B，0.2%甲酸甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%流動相A，5%流動相B；3.0 min，85%流動相A，15%流動相B；10.0 min，60%流動相A，40%流動相B；18.0～22.0 min，100%流動相B；22.1～26.0 min，95%流動相A，5%流動相B。

離子源：電噴霧離子源（ESI）；電離源極性：正模式；掃描模式：MRM；干燥器溫度：250 ℃；干燥器流速：7 L·min-1；霧化器壓力：241.32 kPa；監(jiān)測離子，監(jiān)測離子見表1。

表1 3種瘦肉精監(jiān)測參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果計(jì)算

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)，外標(biāo)法定量。被測瘦肉精殘留量ω以其在試樣中質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為μg·kg-1，按公式（1）計(jì)算。

式（1）中，ρ表示由基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線查得試樣中瘦肉精的質(zhì)量濃度，μg·L-1；V1表示提取溶劑總體積，mL；V2表示用于上機(jī)檢測的提取溶液的體積，mL；V3表示樣品溶液上機(jī)定容體積，mL；m表示試樣的質(zhì)量，g。計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

2.2 線性范圍與檢出限計(jì)算

將克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇混合標(biāo)準(zhǔn)品 配 置 成 濃 度 分 別 為1 μg·L-1、2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1和20 μg·L-1的工作溶液。以瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測組分的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度（μg·L-1）為橫坐標(biāo)（x）繪制校準(zhǔn)曲線。計(jì)算瘦肉精各組分回歸曲線方程與相關(guān)系數(shù)，見表2。

根據(jù)要求，用信噪比法評估檢出限（LOD），以產(chǎn)生3倍信噪比信號的檢測濃度為檢出限[8]。在陰性豬肉樣品中加入一定量的瘦肉精混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.3的步驟處理與測試，根據(jù)公式（2）計(jì)算方法檢出限。

式（2）中，DL表示方法檢出限，μg·kg-1；N表示背景噪聲峰高；C標(biāo)表示試樣中添加的瘦肉精混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度，μg·L-1；V2表示上機(jī)定容體積，mL；V3表示試樣中提取溶劑總體積，mL；V1表示用于上機(jī)檢測的提取溶液的體積，mL；H表示已添加瘦肉精混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的試樣峰高；M表示樣品稱樣量，g。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度是指測得值與真值的符合程度，參照標(biāo)準(zhǔn)要求，本方法準(zhǔn)確度用回收率表示，精密度用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示[4]。

取30個各2.0 g的陰性豬肉樣品，參照國標(biāo)的回收率添加質(zhì)量濃度，分別添加1.00 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1共3個水平濃度添加標(biāo)準(zhǔn)溶液[4]，每個水平做10個平行[10]。樣品按1.3.2前處理步驟后進(jìn)行上機(jī)測試。分別計(jì)算各檢測項(xiàng)目的平均值，平均回收率，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），計(jì)算結(jié)果見表3、表4、表5，加標(biāo)圖譜見圖1。結(jié)果表明，克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的回收率在100.2%～110.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%～3.1%（n=10），滿足標(biāo)準(zhǔn)要求[11]。

表3 克倫特羅回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差測定結(jié)果表

表4 萊克多巴胺回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差測定結(jié)果表

表5 沙丁胺醇回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差測定結(jié)果表

圖1 克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇添加量1.00 μg·kg-1時譜圖

3 結(jié)論

本方法采用酸化乙腈提取QuEChERS凈化與反萃前處理樣品，液相串聯(lián)質(zhì)譜測定，對克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺3種瘦肉精殘留量進(jìn)行測定方法驗(yàn)證。結(jié)果表明，此方法的校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、精密度、準(zhǔn)確度均滿足的要求。