前列腺癌組織中雄激素受體剪接變異體7的表達(dá)及臨床意義

王艷龍，張洪麟，杜浩，任宇，于廣海，劉志宇

（大連醫(yī)科大學(xué)1.附屬大連市中心醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116033；2.附屬大連婦產(chǎn)醫(yī)院生殖健康中心，遼寧 大連 116033；3.附屬第二醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116023）

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，晚期前列腺癌患者主要治療方法是雄激素剝奪治療（androgen deprivation therapy，ADT）。ADT治療后多數(shù)患者會(huì)產(chǎn)生耐藥并發(fā)展為轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）［1］。mCRPC是臨床治療的難點(diǎn)和患者死亡的主要原因。雄激素受體剪接變異體（androgen receptor splice variants，AR-Vs）在前列腺癌的治療耐藥和進(jìn)展中起著重要作用。其中雄激素受體剪接變異體7（androgen receptor splicing variant 7，AR-V7）通過(guò)激活雄激素受體信號(hào)通路、促進(jìn)下游旁分泌等多種機(jī)制來(lái)促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展［2］。目前，AR-V7是公認(rèn)的指導(dǎo)mCRPC患者選擇化療或者新型內(nèi)分泌治療的標(biāo)志物［3］，此外，AR-V7對(duì)治療結(jié)果的預(yù)測(cè)能力因不同的檢測(cè)方法而不同。本研究檢測(cè)不同分期前列腺癌中AR-V7的表達(dá)，同時(shí)與良性前列腺增生組織進(jìn)行比較，探討AR-V7在前列腺癌臨床進(jìn)展和骨轉(zhuǎn)移中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及分組

收集2017年3月至2019年3月大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市中心醫(yī)院泌尿外科48例患者組織標(biāo)本。其中前列腺增生患者（經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)后病理確診）18例（良性增生組），無(wú)轉(zhuǎn)移局限性前列腺癌患者（CT/MRI/ECT骨掃描未見(jiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，根治術(shù)后病理確診）18例（局限癌組），骨轉(zhuǎn)移前列腺癌患者（CT/MRI/ECT見(jiàn)遠(yuǎn)處骨寡轉(zhuǎn)移或內(nèi)臟少量轉(zhuǎn)移，根治術(shù)后病理確診）12例（骨轉(zhuǎn)移癌組）。收集MRI報(bào)告前列腺癌病灶的最大徑線值。局限癌組前列腺腫瘤大小為（1.42±0.06）cm，腫瘤分期T1期3例、T2期6例、T3期6例、T4期3例。骨轉(zhuǎn)移癌組前列腺腫瘤大小為（2.12±0.14）cm，腫瘤分期T2期2例、T3期5例、T4期5例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者未接受任何抗雄或去勢(shì)等內(nèi)分泌治療；未接受放射治療或化療。標(biāo)本組織離體取出清洗后標(biāo)記，盡快放入液氮轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱保存。本研究經(jīng)大連市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（2017-010-11）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化及陽(yáng)性結(jié)果評(píng)定：組織切片經(jīng)過(guò)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、血清封閉，室溫下孵育一抗AR-V7（英國(guó)Abcam公司，1 ∶200）60 min，用已證實(shí)ARV7表達(dá)陽(yáng)性的前列腺癌組織切片作陽(yáng)性對(duì)照，加入PBS作陰性對(duì)照，然后孵育二抗15 min，經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水封片后顯微鏡下觀察。高倍鏡下對(duì)每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，根據(jù)染色陽(yáng)性細(xì)胞比例和陽(yáng)性程度進(jìn)行評(píng)分。A，按照陽(yáng)性細(xì)胞占總上皮細(xì)胞比例評(píng)分：0%，0分；＞0%～25%，1分；＞25%～50%，2分；＞50%～75%，3分；＞75%，4分。B，按照染色的陽(yáng)性程度評(píng)分：不著色、少許淺黃色，0分；淺黃色，1分；棕黃色或棕色，2分；深棕色、棕褐色，3分。A與B分?jǐn)?shù)之和來(lái)判斷切片染色的陽(yáng)性等級(jí)：0分，陰性（-）；1～3分，弱陽(yáng)性（+）；4～5分，陽(yáng)性（++）；6～7分，強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測(cè)AR-V7mRNA表達(dá)：將組織樣品加入預(yù)冷的 TRIzol（日本TaKaRa公司）中，充分裂解細(xì)胞，提取總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。使用實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀（美國(guó)ABI公司），TransStart?Green qPCR Supermix 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。生工生物工程有限公司合成引物，AR-V7上游引物5’-GGAAATGTTATGAAGCAGGG-3’，下游引物5’-GGTCATTTTGAGATGCTTGC-3’。GAPDH上游引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組免疫組化檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，良性增生組1例弱陽(yáng)性，17例陰性，陽(yáng)性表達(dá)率5.6%；局限癌組2例陽(yáng)性，1例強(qiáng)陽(yáng)性，15例陰性，陽(yáng)性表達(dá)率16.7%，骨轉(zhuǎn)移癌組3例陽(yáng)性，4例強(qiáng)陽(yáng)性，5例陰性，陽(yáng)性表達(dá)率58.3%，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.99，P=0.002），見(jiàn)表1、圖1。

圖1 3組免疫組化結(jié)果比較 ×400Fig.1 Comparison of immunohistochemical results for the three groups ×400

表1 3組免疫組化結(jié)果比較［n（%）］Tab.1 Immunohistochemistry results among the three groups［n（%）］

2.2 3組AR-V7 mRNA檢測(cè)結(jié)果比較

qRT-PCR結(jié)果顯示，良性增生組、局限癌組和骨轉(zhuǎn)移癌組AR-V7mRNA 表達(dá)分別為1.03±0.11、6.36±0.15和14.39±0.13。與良性增生組比較，局限癌組AR-V7mRNA 表達(dá)顯著增高（P＜ 0.05）；與良性增生組、局限癌組比較，骨轉(zhuǎn)移癌組AR-V7mRNA 表達(dá)顯著增高（P＜ 0.05），說(shuō)明AR-V7mRNA表達(dá)隨腫瘤臨床進(jìn)展而升高。

3 討論

前列腺癌是激素依賴性腫瘤，雄激素促進(jìn)前列腺癌的生長(zhǎng)和進(jìn)展，雄激素受體是常用的前列腺癌的治療靶點(diǎn)。然而，靶向藥物最終會(huì)導(dǎo)致雄激素受體畸變，促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展和耐藥，導(dǎo)致mCRPC。研究［4］顯示，10%～30% mCRPC患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）AR-V7陽(yáng)性表達(dá)，這類患者使用新型雄激素受體抑制劑（阿比特龍或恩雜魯胺）效果不佳，但對(duì)化療敏感［5］。目前AR-V7的檢測(cè)方法多樣，qRT-PCR是目前最常用的方法，但技術(shù)路線復(fù)雜［6］。AR-V7mRNA的檢測(cè)結(jié)果因不同檢測(cè)標(biāo)本存在差異［7］，而組織標(biāo)本檢測(cè)具有結(jié)果可靠、靈敏度較高、技術(shù)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是目前常用的檢測(cè)方法。

研究［8］表明AR-V7 也存在于正常細(xì)胞（癌旁組織或良性腺體）中，本研究發(fā)現(xiàn)前列腺良性增生組中1例AR-V7弱陽(yáng)性（5.6%），與以往研究結(jié)果一致。SCHER等［9］分析顯示，CTCs細(xì)胞核中含有AR-V7蛋白的患者，在基于紫杉醇類化療中有更長(zhǎng)的生存時(shí)間。ERB等［10］采用免疫組化檢測(cè)AR-V7對(duì)無(wú)進(jìn)展生存期和治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)價(jià)值，認(rèn)為AR-V7蛋白在CTCs中的表達(dá)不能預(yù)測(cè)mCRPC的治療反應(yīng)，AR-V7在CTCs中作為生物標(biāo)志物的價(jià)值臨床上仍然需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究采用組織標(biāo)本進(jìn)行AR-V7檢測(cè)，結(jié)果顯示AR-V7mRNA 表達(dá)在骨轉(zhuǎn)移癌組最高，局限癌組次之，良性增生組最低。與良性增生組比較，局限癌組AR-V7mRNA 表達(dá)顯著增高（P＜ 0.05）；與良性增生組、局限癌組比較，骨轉(zhuǎn)移癌組AR-V7mRNA 表達(dá)顯著增高（P＜ 0.05），提示 AR-V7 的表達(dá)可能與前列腺癌的臨床進(jìn)展相關(guān)。OUYANG等［11］研究認(rèn)為前列腺癌組織中AR-V7水平與根治性前列腺切除術(shù)后接受輔助激素治療患者的無(wú)進(jìn)展生存期、總生存期和癌癥特殊生存期的不利預(yù)后相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，前列腺癌組織中AR-V7表達(dá)增高，且與前列腺癌的臨床進(jìn)展相關(guān)，提示AR-V7可能參與前列腺癌的臨床進(jìn)展和骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。但是，AR-V7如何促進(jìn)mCRPC形成以及AR-V7如何參與新型雄激素受體抑制劑耐藥機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究論證。