任曉越，李敬賢，熊纓

上?？萍即髮W(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201210

引言

流式細(xì)胞分選儀可將具有特定標(biāo)志物或功能的細(xì)胞從混合細(xì)胞群中分離出來，再進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白檢測(cè)、基因編輯、基因組測(cè)序等應(yīng)用[1-4]。隨著細(xì)胞治療和精準(zhǔn)醫(yī)療的快速發(fā)展，流式細(xì)胞分選技術(shù)將在臨床研究與治療中得到更廣泛的應(yīng)用[5]。

市場上主流的分選型流式細(xì)胞儀有BD公司的FACSAria Ⅲ、Beckman公司的MoFlo XDP、Sony公司的SH800，將各個(gè)儀器的特征進(jìn)行分析對(duì)比[6]，詳見表1。其中，BD FACSAria Ⅲ的熒光靈敏度最高，意味著最佳的樣本分辨率。

表1 市場上不同品牌流式細(xì)胞分選儀的分析對(duì)比

作為市場占有率最高的分選儀之一[7]，BD FACSAriaⅢ可用于進(jìn)行干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、生殖細(xì)胞等各類細(xì)胞的分選，細(xì)胞可以收集到收集管和不同孔徑的孔板中進(jìn)行后續(xù)分析或培養(yǎng)[8]。在儀器使用過程中，會(huì)出現(xiàn)側(cè)液流分散、無法分選、噴嘴堵塞等各類故障情況，導(dǎo)致分選無法進(jìn)行。目前，比較熱門的是對(duì)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法的開發(fā)和優(yōu)化，而對(duì)于儀器在使用中出現(xiàn)的故障情況研究案例較少，且并未探討故障背后的原因。所以，在多年BD FACSAria III使用經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本文通過BD FACSAria Ⅲ原理簡介及一些維修案例的分享，總結(jié)探討維修經(jīng)驗(yàn)和方法，以期為同行提供參考。

1 設(shè)備原理

流式細(xì)胞儀是集現(xiàn)代物理電子技術(shù)、激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體的先進(jìn)科學(xué)技術(shù)設(shè)備，能夠?qū)μ幱诳焖僦本€流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析[9]。流式細(xì)胞分選儀在流式細(xì)胞分析儀的基礎(chǔ)上增加了分選系統(tǒng)，細(xì)胞分選儀BD FACSAria Ⅲ由三個(gè)主要部分構(gòu)成，分別是液流車、流式細(xì)胞儀主機(jī)和工作站（BD FACSDiva軟件）。液流車能夠向主機(jī)供應(yīng)鞘液、清洗液，并從主機(jī)里回收廢液；流式細(xì)胞儀主機(jī)包括液流組件、光學(xué)組件、電子組件[10]；工作站可以控制進(jìn)樣和流速，并通過攝像頭實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞分選情況。

在一定壓力下，樣本被進(jìn)樣針吸取進(jìn)入石英杯樣品池，鞘液經(jīng)由另一管線進(jìn)入，在壓力驅(qū)動(dòng)下包裹著排成單列的細(xì)胞經(jīng)過噴嘴后加速到達(dá)檢測(cè)點(diǎn)，激光照射到細(xì)胞上發(fā)生散射和折射，發(fā)出散射光，同時(shí)，細(xì)胞攜帶的熒光素被激光照射發(fā)出熒光。檢測(cè)器把散射光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，熒光則被聚光器收集，經(jīng)各個(gè)光纖傳導(dǎo)進(jìn)入八角轉(zhuǎn)盤或三角轉(zhuǎn)盤檢測(cè)器，被不同濾光片組件拆分后，由對(duì)應(yīng)的光電倍增管檢測(cè)器接收并將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。最后經(jīng)過數(shù)據(jù)化的處理，輸入電腦儲(chǔ)存分析[11]。被鞘液包裹的樣本流經(jīng)過噴嘴后，被振蕩器振蕩成為均勻的液滴，包含有目標(biāo)細(xì)胞的液滴會(huì)被充以電荷，在電場的作用下偏轉(zhuǎn)進(jìn)入收集器中，其余液滴則會(huì)進(jìn)入廢液槽中。流式細(xì)胞分選原理如圖1所示。

圖1 流式細(xì)胞分選原理圖

2 常見故障的解決方法

2.1 故障一

2.1.1 故障現(xiàn)象

BD FACSAria Ⅲ不能正常進(jìn)樣，進(jìn)樣速度一直顯示為0，或流速固定為1.0時(shí)，進(jìn)樣速度不能穩(wěn)定，變化較大。正常狀態(tài)是：以100 μm噴嘴為例，流速為1.0時(shí)，1.5 mL無菌水加1滴時(shí)間延遲校準(zhǔn)微球的正常進(jìn)樣速度為1000 evt/s。

2.1.2 故障分析

如果儀器無法正常進(jìn)樣，通常是由于進(jìn)樣針被堵塞。需要分為兩種情況進(jìn)行分析：① 樣品未混勻或未過篩網(wǎng)，有聚集的細(xì)胞團(tuán)塊堵塞了進(jìn)樣針；② 樣品分選過程中逐漸發(fā)生堵塞。另外，還有一種可能即上樣倉沒有卡緊，導(dǎo)致上樣壓力不正常，從而無法正常進(jìn)樣。

2.1.3 故障解決

根據(jù)以上的3種情況，采用不同的方法進(jìn)行判斷，從而排除故障：① 上樣時(shí)間延遲校準(zhǔn)微球，觀察上樣顆粒數(shù)的情況。如果進(jìn)樣速度正常，就將樣品卸載下來，用細(xì)胞篩網(wǎng)過濾樣品后再上樣；② 仔細(xì)觀察進(jìn)樣速度的變化，當(dāng)數(shù)值快速降低時(shí)，就是進(jìn)樣針快被堵塞，此時(shí)應(yīng)該將樣品卸載下來，多次反沖進(jìn)樣針；如果堵塞嚴(yán)重，把管夾閥里嵌著的白色軟管取出，快速反沖進(jìn)樣針。如果還是無效，就必須更換主要進(jìn)樣管線和相連白色軟管（圖2）；③ 通過上樣后能否聽到咔噠聲這一方法判斷上樣倉是否卡緊，解決方法是在樣品架上邊沿位置涂抹潤滑油，以起到密封的效果。

圖2 BD FACSAria III的進(jìn)樣管線

2.2 故障二

2.2.1 故障現(xiàn)象

液流不穩(wěn)定，斷點(diǎn)位置不穩(wěn)定，會(huì)上下跳動(dòng)，且Gap值變化很大。正常狀態(tài)：正常開機(jī)以后，不同規(guī)格噴嘴的液流狀態(tài)如圖3所示。

圖3 BD FACSAria III的三種噴嘴所對(duì)應(yīng)最佳液流斷點(diǎn)圖

2.2.2 故障分析

由于鞘液包裹的樣本經(jīng)過激光器被檢測(cè)之后，才會(huì)被振蕩成為單個(gè)液滴，液流的穩(wěn)定性決定了從檢測(cè)點(diǎn)到加電分選位置的時(shí)間差變化[12]。那么對(duì)于判斷是否能夠分選到正確的目的細(xì)胞，液流穩(wěn)定性在整個(gè)細(xì)胞分選的過程就至關(guān)重要。

如果液流中有開機(jī)清洗后殘余的乙醇或者氣體，那么在液流經(jīng)過噴嘴被高頻振蕩形成單個(gè)液滴過程中，液滴表面張力會(huì)發(fā)生變化，從而影響液滴形成過程，破壞斷點(diǎn)位置的穩(wěn)定性。另外一種可能是當(dāng)噴嘴被堵塞或是樣品池中有碎片時(shí)，會(huì)阻礙鞘液的液體流動(dòng)，導(dǎo)致液體的流動(dòng)性受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致液流不穩(wěn)定。

2.2.3 故障解決

通常情況下，延長無菌水的清洗管路時(shí)間，或者選擇菜單欄cytometer下面的液流啟動(dòng)用鞘液充滿管路來排除氣體和乙醇，是非常有效方法。如果發(fā)現(xiàn)鞘液過濾器中有氣泡，可以擰松鞘液過濾器上的閥門，手動(dòng)排除過濾器中的氣體。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程中的樣品情況分析，如果分選樣本未及時(shí)過濾或是死細(xì)胞較多時(shí)，那么就會(huì)使噴嘴被堵塞或樣品池中有碎片。此時(shí)，應(yīng)立刻關(guān)閉液流，拿走噴嘴，超聲噴嘴1 min，如果仍然無效，可以點(diǎn)開stream，用鞘液沖洗樣品池約10 s。

2.3 故障三

2.3.1 故障現(xiàn)象

分選過程中，側(cè)液流不集中，較分散（圖4）。

圖4 不同分選狀態(tài)的側(cè)液流圖

2.3.2 故障分析

在判斷儀器故障狀態(tài)之前，首先要確認(rèn)樣本情況，當(dāng)樣品細(xì)胞太大的時(shí)候，細(xì)胞在液滴中的比重偏大，說明所用噴嘴對(duì)于樣品細(xì)胞的規(guī)格是不合適的，此時(shí)應(yīng)該更換一個(gè)更大規(guī)格的噴嘴。

排除樣本因素之后，通常情況，需要考慮的是電場中的加電情況，這需要分為兩種情況進(jìn)行分析：① 分選倉的電極板上濺了鞘液，影響電場的導(dǎo)電；② 液流圖像窗口的2nd、3rd、4th Drop values不是最優(yōu)值，影響了中心液流的聚電效應(yīng)。

除此之外，在觀察液流圖像時(shí)進(jìn)行分析，如果噴嘴有輕微堵塞或者Ampl值不是最優(yōu)值，也可能造成側(cè)液流分散。

2.3.3 解決方案

根據(jù)上述分析，首先應(yīng)打開分選倉檢查電極板上是否有液體，若有，則應(yīng)關(guān)閉液流，用無塵紙擦干凈分選倉內(nèi)電極板上的液體；其次調(diào)節(jié)液流圖像窗口的2nd、3rd、4th Drop values這三個(gè)值，加強(qiáng)聚電效應(yīng)，集中側(cè)液流。在排除上述兩種情況后，可以通過超聲噴嘴，或者重新調(diào)整優(yōu)化Ampl值來解決這一故障問題。

3 討論

目前，大多數(shù)研究均聚焦于細(xì)胞分選儀實(shí)驗(yàn)方法的開發(fā)和優(yōu)化，忽略了對(duì)儀器故障和維修情況的整理和研究?；诙嗄陙碓趦x器操作過程中的常見故障現(xiàn)象，本文結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分選原理，詳細(xì)列舉了各種情況下故障案例的成因，并結(jié)合分析各種解決方案的有效性，以便其他使用者在碰到相同故障時(shí)可以對(duì)可能的原因進(jìn)行優(yōu)先排除，能更快更準(zhǔn)的解決問題。

本文中分析的三個(gè)故障案例都是常見情況，甚至液流不穩(wěn)定這種現(xiàn)象，儀器使用的新手可能都不會(huì)注意到。但是液流的穩(wěn)定性和側(cè)液流狀態(tài)對(duì)分選結(jié)果的好壞至關(guān)重要，即能否分選到正確的細(xì)胞。分選儀在臨床上雖不用做診斷設(shè)備，但是可能會(huì)用于細(xì)胞治療中的靶細(xì)胞分離純化、或者分離臨床樣本用于后續(xù)機(jī)理研究，如果得不到足夠純的目的細(xì)胞，細(xì)胞治療的效果可想而知，后續(xù)機(jī)理研究的準(zhǔn)確性也值得商榷。所以，在實(shí)際儀器操作中，一旦出現(xiàn)故障，要及時(shí)排除，確保珍貴的臨床樣本不被浪費(fèi)，并避免后續(xù)更大的損失與浪費(fèi)。

另外，需要注意的是在儀器操作中個(gè)人防護(hù)也應(yīng)引起重視，特別是用于臨床樣本分選的儀器。作為電荷式分選儀，BD FACSAria Ⅲ能夠?qū)⑶室喊臉颖疽毫髡袷幊蔀閱蝹€(gè)的液滴，任何一個(gè)氣溶膠液滴均可能包含導(dǎo)致感染的某種細(xì)胞。因此，儀器操作者應(yīng)該做好個(gè)人防護(hù)，穿戴好實(shí)驗(yàn)服、口罩和手套，來防止可能會(huì)有的生物安全風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。

在保障儀器正常穩(wěn)定運(yùn)行的基礎(chǔ)上，后續(xù)本團(tuán)隊(duì)將對(duì)影響分離細(xì)胞活性的相關(guān)因素包括樣品前處理、儀器參數(shù)設(shè)置、收集狀態(tài)等，以及個(gè)人防護(hù)方面進(jìn)行深入探索。

4 結(jié)論

往往一個(gè)很小的問題，會(huì)導(dǎo)致大的故障，因此，做好儀器的日常維護(hù)與保養(yǎng)非常重要。本文就3例故障案例進(jìn)行了討論分析，其中故障二即液流不穩(wěn)定，是所有流式細(xì)胞分選儀常見故障類型[15]，所以解決方案可供其他品牌儀器參考借鑒。由于分選樣本的制備過程復(fù)雜，所用的抗體試劑也較為昂貴，所以在細(xì)胞分選過程中，使用者如果發(fā)現(xiàn)上述故障現(xiàn)象，應(yīng)立刻停止分選，并按照本文提供的解決方案進(jìn)行排查。

BD FACSAria Ⅲ這款儀器能夠滿足快速分選要求，使用率高，但是售價(jià)高昂，零配件價(jià)格也高，所以儀器的日常維護(hù)和管理非常重要。只有保障儀器的運(yùn)行穩(wěn)定，才能更加有效和準(zhǔn)確地進(jìn)行分選實(shí)驗(yàn)，也能提高儀器的使用壽命[16]。本文通過對(duì)BD FACSAria Ⅲ的工作原理的介紹，以及對(duì)儀器使用過程中的常見故障原因及解決方法的詳細(xì)分析，希望為儀器的正確使用及故障的快速排除提供參考，使儀器能高效穩(wěn)定地運(yùn)行。