通痹膠囊通過NF-κB信號(hào)通路緩解弗氏完全佐劑所致大鼠炎性痛的作用機(jī)制

張倩，閆國(guó)強(qiáng)，張俊艷，金穎慧，丁洪青，尹忠英，董晶晶，李寶芬，郭煊（.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 06000；.滄縣醫(yī)院，河北 滄州 06000）

炎性痛是臨床疼痛癥狀中最重要的類型[1]，它是指生物源或化學(xué)源性炎癥刺激神經(jīng)系統(tǒng)所致的疼痛，組織損傷、傷害性刺激等均可導(dǎo)致炎性痛的發(fā)生，其在臨床上一般表現(xiàn)為炎性因子的釋放，局部組織紅、腫、熱、痛和功能障礙等，并伴有自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏等[2-3]。而嚴(yán)重的疼痛或是長(zhǎng)期的慢性疼痛，會(huì)極大地影響患者的生活質(zhì)量，造成患者睡眠障礙、情緒低落甚至抑郁等。由于炎性痛發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，行之有效的治療手段仍然十分缺乏。與使用廣泛的非甾體抗炎藥、選擇性COX-2 抑制劑等鎮(zhèn)痛藥物相比，中藥復(fù)方具有不良反應(yīng)少、療效持久、患者依從性好等諸多優(yōu)勢(shì)，在臨床上發(fā)揮了不可替代的治療效果。通痹膠囊由秦艽、香附、羌活等15 味中藥組成，能夠祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛，臨床上用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療[4]，其對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的疼痛癥狀具有明顯的改善作用，為進(jìn)一步闡釋通痹膠囊的抗炎鎮(zhèn)痛作用，本文擬通過對(duì)弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的疼痛模型大鼠機(jī)械縮足反射閾值及熱縮足反射閾值的測(cè)定，觀察通痹膠囊的止痛效果；通過對(duì)炎性因子及相關(guān)蛋白的測(cè)定，初步探討通痹膠囊抗炎鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)Wistar 雌性大鼠48 只（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003，體質(zhì)量（200±20）g，在濕度50%～60%、（24±2）℃的環(huán)境中自由攝食、飲水。

1.2 試藥

通痹膠囊（河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，批號(hào)：180508，規(guī)格：0.3 g/粒）；雷公藤多苷片（遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，批號(hào)：20170102，規(guī)格：10 mg/片）；注射用弗氏完全佐劑（美國(guó)Sigma 公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京方程生物科技有限公司）；兔抗鼠NF-κB/P65、NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）、IκB 激酶β（IKKβ）多克隆抗體（美國(guó)Proteintech Group 公司）；山羊抗兔二抗（美國(guó)Biofine 公司）；兔抗鼠β-actin 抗體（美國(guó) Immunoway 公司）。

1.3 儀器

電動(dòng)組織勻漿器（美國(guó)Fluka 公司）；SZ61TRC-1LST 型解剖鏡（日本fineOlympus 公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Von Frey 測(cè)痛儀（美國(guó)Stoelting 公司）；PE34 冷熱盤測(cè)痛儀（美國(guó)IITC 公司）；MultiSkan3 全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（美國(guó)Thermo 公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的制備[5]

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，在右后肢足底中部皮下注射100 μL 的弗氏完全佐劑制備炎性痛模型。

2.2 分組與給藥

正常組8 只，40 只炎性痛模型大鼠隨機(jī)分為5 組，即模型組，通痹膠囊低、中、高劑量組與雷公藤多苷片組，造模后第8日開始按通痹膠囊低劑量組[375 mg/（kg·d）]、中劑量組[750 mg/（kg·d）]、高劑量組[1500 mg/（kg·d）]（分別相當(dāng)于臨床成人劑量的2、4、8 倍），雷公藤多苷片組[10 mg/（kg·d）]進(jìn)行灌胃治療4 周，每日1 次。正常組、模型組給予相同體積生理鹽水。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

2.3.1 體質(zhì)量及爪水腫 分別于造模前1日和造模后第7日、14日、21日、28日和35日測(cè)量大鼠的體質(zhì)量，采用游標(biāo)卡尺測(cè)大鼠注射足的掌心和爪后跟的厚度，游標(biāo)卡尺讀數(shù)精確到0.02 mm。

2.3.2 機(jī)械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的測(cè)定 造模后第7日、14日、21日、28日和35日，將環(huán)境溫度維持在20 ～25℃、濕度46%～52%，大鼠適應(yīng)環(huán)境15 min 后，將其置于金屬網(wǎng)格籠中（20 cm×20 cm×20 cm），采用Von Frey 纖維毛刺激大鼠右后肢足底中部，記錄出現(xiàn)縮足反應(yīng)時(shí)的讀數(shù)，并參照陳志新等[6]的方法計(jì)算50%MWT。

2.3.3 熱縮足反射閾值（thermal withdrawal latency，TWT）的測(cè)定 造模后第7日、14日、21日、28日和35日，完成MWT 的測(cè)定后，啟動(dòng)足底熱痛儀并將溫度調(diào)至55℃，待穩(wěn)定后，將大鼠放入儀器內(nèi)，記錄大鼠出現(xiàn)縮足、舔足等反應(yīng)的時(shí)間。為防止?fàn)C傷大鼠，測(cè)定時(shí)間上限為30 s，每只大鼠測(cè)定3 次，每次間隔10 min，取平均值。

2.3.4 大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1、IL-6 的表達(dá) 大鼠以水合氯醛400 mg·kg－1腹腔注射麻醉后處死?？焖偃〕黾顾鐻4～L5段，混懸于PBS 中， 于4 ℃1000 r·min－1離心15 min，ELISA 試劑盒檢測(cè)炎癥疼痛大鼠脊髓背角組織中TNF-α、IL-1 和IL-6 等細(xì)胞因子的表達(dá)。

2.3.5 大鼠脊髓組織中NF-κB/P65、IκBα、IKKβ蛋白的表達(dá) 大鼠末次給藥后完成行為學(xué)檢測(cè)后頸椎脫臼處死，快速取出大鼠L4～L6脊髓組織，用RIPA 蛋白抽提試劑進(jìn)行組織蛋白提取，勻漿器勻漿后于4 ℃1000 r·min－1離心15 min，取上清液即為提取的總蛋白，用BCA 法檢測(cè)各樣本總蛋白濃度，并調(diào)整一致。沸水中滅活蛋白5 min，行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，加NF-κB/P65、IκBα、IKKβ一抗，室溫孵育10 min，4 ℃過夜，TBST 洗模3 min×5 次。加HRP 標(biāo)記的二抗（均為1∶10 000），室溫封閉2 h，TBST 洗模3 min×6 次。ECL 發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像儀下拍照，分析蛋白表達(dá)情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)體質(zhì)量及爪水腫的影響

造模前、后及給藥后各組大鼠體質(zhì)量均無明顯差異，見表1。各組大鼠在造模前，足后跟及掌心厚度無明顯差異；造模后，模型組大鼠注射足后跟及掌心厚度明顯增加，與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)給藥治療28 d 后，通痹膠囊組及雷公藤多苷片組均能顯著降低注射足后跟及掌心厚度（P＜0.05 或P＜0.01），見表2、3。

表1 通痹膠囊對(duì)炎性痛大鼠體質(zhì)量的影響(± s，n ＝8)Tab 1 Effect of Tongbi capsule on the body mass of inflammation pain rats (± s，n ＝8)

表1 通痹膠囊對(duì)炎性痛大鼠體質(zhì)量的影響(± s，n ＝8)Tab 1 Effect of Tongbi capsule on the body mass of inflammation pain rats (± s，n ＝8)

組別劑量/[mg/（kg·d）]造模前/g造模后/g給藥后/g 14 d21 d28 d35 d正常組/198.50±9.89217.38±11.64240.63±9.52268.38±9.41291.75±10.31331.88±11.32模型組/199.50±11.19216.88±10.27242.00±15.73261.38±17.20286.13±15.68319.25±23.86通痹膠囊組 375204.50±12.68222.00±12.64246.13±12.28271.00±11.72293.75±11.31330.63±13.31 750203.13±12.21218.25±13.58243.13±12.64264.63±11.61287.75±12.19329.38±12.76 1500208.25±11.32224.75±8.48249.50±12.96272.63±11.89294.63±13.44327.63±16.55雷公藤多苷片組 10199.50±11.64221.13±6.81236.38±13.17264.75±13.71298.38±17.17326.63±17.74

表2 通痹膠囊對(duì)炎性痛大鼠注射足后跟厚度的影響(± s，n ＝8)Tab 2 Effect of Tongbi capsule on injection heel thickness in inflammatory pain rats (± s，n ＝8)

表2 通痹膠囊對(duì)炎性痛大鼠注射足后跟厚度的影響(± s，n ＝8)Tab 2 Effect of Tongbi capsule on injection heel thickness in inflammatory pain rats (± s，n ＝8)

注：與正常組比較，▲▲P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01Note：vs the nomal group，▲▲P ＜0.01；vs the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

[mg/（kg·d）]造模前/mm造模后/mm給藥后/mm 14 d21 d28 d35 d正常組/4.77±0.144.79±0.144.78±0.154.77±0.144.75±0.154.76±0.15模型組/4.73±0.146.23±0.49▲▲6.21±0.496.23±0.456.14±0.366.08±0.34通痹膠囊組 3754.82±0.166.25±0.21▲▲6.05±0.275.72±0.21*5.41±0.23**5.35±0.19**組別劑量/7504.81±0.226.26±0.27▲▲6.02±0.225.70±0.29*5.38±0.30**5.20±0.27**15004.86±0.136.34±0.29▲▲5.72±0.36*5.25±0.17**5.03±0.22**4.97±0.21**雷公藤多苷片組 104.76±0.156.17±0.27▲▲6.01±0.275.47±0.13**5.15±0.09**5.08±0.14**

表3 通痹膠囊對(duì)炎性痛大鼠注射足掌心厚度的影響(± s，n ＝8)Tab 3 Effect of Tongbi capsule on injection palm thickness in inflammatory pain rats (± s，n ＝8)

表3 通痹膠囊對(duì)炎性痛大鼠注射足掌心厚度的影響(± s，n ＝8)Tab 3 Effect of Tongbi capsule on injection palm thickness in inflammatory pain rats (± s，n ＝8)

注：與正常組比較，▲▲P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。Note：vs the nomal group，▲▲P ＜0.01；vs the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

組別劑量/[mg/（kg·d）]造模前/mm造模后/mm給藥后/mm 14 d21 d28 d35 d正常組/3.27±0.133.26±0.133.27±0.123.26±0.113.25±0.113.24±0.10模型組/3.22±0.137.80±0.23▲▲7.97±0.197.91±0.197.88±0.177.83±0.16通痹膠囊組 3753.31±0.167.99±0.32▲▲7.83±0.327.68±0.317.55±0.29*7.59±0.22*7503.34±0.177.86±0.38▲▲7.59±0.41*7.40±0.37**7.18±0.34**6.84±0.38**15003.28±0.087.97±0.22▲▲7.63±0.23**7.07±0.18**6.81±0.16**6.52±0.13**雷公藤多苷片組 103.19±0.058.05±0.29▲▲7.93±0.287.61±0.31*7.31±0.26**7.10±0.29**

3.2 對(duì)MWT 的影響

與正常組相比，造模后第7日，模型組、通痹膠囊各劑量組及雷公藤多苷片組MWT 明顯縮短（P＜0.01）；與模型組相比，造模后第14日，中、高劑量通痹膠囊組MWT 相對(duì)提高（P＜0.05，P＜0.01），造模后第21日、28日及35日，通痹膠囊各劑量組及雷公藤多苷片組MWT 均明顯提高（P＜0.01），見圖1。

圖1 通痹膠囊對(duì)炎性痛大鼠機(jī)械縮足反射閾值的影響Fig 1 Effect of Tongbi capsule on MWT in inflammatory pain rats

3.3 對(duì)TWL 的影響

與正常組相比，造模后第7日，模型組、通痹膠囊各劑量組及雷公藤多苷片組TWL 明顯縮短（P＜0.01）；與模型組相比，造模后第14日、21日、28日及35日，通痹膠囊各劑量組及雷公藤多苷片組TWL 均明顯提高（P＜0.01），見圖2。

圖2 通痹膠囊對(duì)炎性痛大鼠熱縮足反射閾值的影響Fig 2 Effect of Tongbi capsule on TWL in inflammatory pain rats

3.4 ELISA 法檢測(cè)大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1、IL-6 的表達(dá)水平

由表4可知，模型組大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1、IL-6 的含量較正常組明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，通痹膠囊低劑量組能夠降低大鼠脊髓組織中IL-6 的含量（P＜0.05）、中劑量組可降低TNF-α和IL-6 的含量（P＜0.01）、高劑量組及雷公藤多苷片組均可顯著降低大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1 和IL-6 的含量（P＜0.01）。

表4 通痹膠囊對(duì)炎性痛大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1、IL-6 含量的影響(± s，n ＝8)Tab 4 Effect of Tongbi capsule on the levels of TNF-α，IL-1，and IL-6 in the spinal tissue (± s，n ＝8)

表4 通痹膠囊對(duì)炎性痛大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1、IL-6 含量的影響(± s，n ＝8)Tab 4 Effect of Tongbi capsule on the levels of TNF-α，IL-1，and IL-6 in the spinal tissue (± s，n ＝8)

注：與正常組比較，▲▲P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。Note：vs the nomal group，▲▲P ＜0.01；vs the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

－1－1－1組別劑量/[mg/（kg·d）]TNF-α/（pg·mL）IL-1/（pg·mL）IL-6/（pg·mL）正常組/50.96±2/108.13±4 375109.99±6 750 88.74±7 1500 78.88±2.1236.24±5.3843.46±3.57模型組.04▲▲87.80±6.10▲▲97.94±4.47▲▲通痹膠囊組.4386.61±7.1191.61±4.05*.43**86.30±6.8580.67±2.80**.47**67.08±3.39**68.23±3.83**雷公藤多苷片組 10 72.97±4.84**68.51±5.01**82.81±3.43**

3.5 對(duì)大鼠脊髓組織中NF-κB/P65、IκBα、IKKβ蛋白表達(dá)的影響

由圖3可知，模型組大鼠脊髓組織中NFκB/P65、IκBα、IKKβ蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，通痹膠囊各劑量組及雷公藤多苷片組治療后均能明顯抑制NF-κB/P65 及IκBα的蛋白表達(dá)（P＜0.05 或P＜0.01），通痹膠囊中、高劑量組及雷公藤多苷片組均能明顯抑制IKKβ的蛋白表達(dá)（P＜0.01）。

圖3 通痹膠囊對(duì)炎性痛大鼠脊髓組織中NF-κB/P65、IκBα、IKKβ蛋白表達(dá)的影響Fig 3 Effect of Tongbi capsule on the protein expression of NF-κB/P65，IκBα and IKKβ in the spinal cord tissue in inflammatory pain rats A.正常組（the nomal group）；B.模型組（the model group）；C.通痹膠囊低劑量組（the low-dose group of Tongbi capsule）；D.通痹膠囊中劑量組（the medium-dose group of Tongbi capsule）；E.通痹膠囊高劑量組（the high-dose group of Tongbi capsule）；F.雷公藤多苷片組（the tripterygium glycosides table group）

4 討論

目前，可用于建立炎性痛模型的方式有很多種，有用于急性或亞急性炎癥模型建立的福爾馬林模型和角叉菜膠模型，用于慢性炎性痛模型建立的弗氏佐劑模型、蜂蜜毒模型以及松節(jié)油模型等[7]，其中弗氏佐劑炎性痛模型是目前最常用的經(jīng)典炎性痛模型[8]。該模型通過在大鼠或小鼠的足底皮下注射弗氏佐劑，使注射部位發(fā)生炎癥反應(yīng)，并伴隨較長(zhǎng)時(shí)間的痛覺過敏，從而模擬人持續(xù)性或慢性炎性疼痛。本文在大鼠足底皮下注射弗氏完全佐劑后，模型大鼠患足出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，并有膿液產(chǎn)生，注射足后跟和掌心厚度明顯增加，MWT 和TWT 均顯著降低。給藥治療后，通痹膠囊能夠明顯改善注射足腫脹現(xiàn)象，提高炎性痛大鼠MWT、延長(zhǎng)其TWT 潛伏期，提示通痹膠囊對(duì)弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的慢性炎性痛具有較好的緩解作用。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎性痛類疾病往往與組織損傷所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)有關(guān)[9-10]，因此，控制炎癥的發(fā)展是減輕炎性疼痛癥狀的有效措施之一[11-13]。當(dāng)機(jī)體受到損傷發(fā)生炎癥時(shí)，炎癥組織釋放或合成炎性介質(zhì)，激活受體，使痛覺感受器興奮而產(chǎn)生痛覺。NF-κB 作為轉(zhuǎn)錄因子，在真核細(xì)胞中起到調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄的作用，如細(xì)胞因子、免疫受體、黏附因子等基因的表達(dá)均受NF-κB 的調(diào)節(jié)，不僅如此，NF-κB 還在炎癥、細(xì)胞增殖與分化等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路[14]。

激活的NF-κB 通路能夠促進(jìn)炎性痛的形成[14-16]，在正常的生理狀態(tài)下，NF-κB 與其抑制蛋白IκB 結(jié)合在一起，核定位序列被覆蓋，從而無法以活性的形式存在于胞漿中。一旦細(xì)胞受損或在炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6 等刺激下，IκB 的氨基末端高度保守的絲氨酸殘基被IκB 激酶（IKK）激活后，發(fā)生磷酸化，并被快速降解，使得NF-κB 從結(jié)合狀態(tài)變?yōu)橛坞x狀態(tài)，激活后進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA 特定位點(diǎn)結(jié)合調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[17]。NF-κB 通路的激活，可以誘導(dǎo)TNF-α、IL-1、IL-6 等細(xì)胞因子的生成，而這些炎性因子又同時(shí)是NF-κB 的活化劑，可進(jìn)一步激活NF-κB的活性，促使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大，導(dǎo)致疼痛的不斷加重[18-19]。IKKβ/IκBα/NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是調(diào)控炎性痛發(fā)生發(fā)展的重要通路，抑制其活性，可有效緩解炎性痛癥狀。

本研究結(jié)果顯示，通痹膠囊能夠顯著降低炎性痛大鼠脊髓組織中炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6 的含量，抑制IKKβ、IκBα及NF-κB 的蛋白表達(dá)，其緩解弗氏完全佐劑所致炎性痛的作用機(jī)制可能為抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活。