周牡娜，劉檢，石雕，劉蓉，鄒自征，歐陽方丹*（.益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南 益陽 4000；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 40000；.湖南省直中醫(yī)醫(yī)院，湖南 株洲 4000）

由于惡性腫瘤性質(zhì)類型各異、累及的組織和器官不同、病期不同以及現(xiàn)在診斷技術(shù)的局限，大多數(shù)惡性腫瘤患者在確診時已為中晚期，手術(shù)治療無法實現(xiàn)，因而治療藥物的研發(fā)十分必要[1]。目前中醫(yī)藥治療腫瘤的臨床研究正進(jìn)入循證醫(yī)學(xué)、個體化、規(guī)范化的時代，因其有降低毒副作用、減輕癥狀或延長帶瘤生存期等特點得到了廣泛認(rèn)可[2]。順鉑是臨床治療中常用的化療藥物，但順鉑產(chǎn)生的腎毒性、耳毒性、耐藥性等在臨床上不可避免，近年來以順鉑為核心聯(lián)合用藥的“增效減毒”研究較多[3]，而六味地黃具有改善腎功能、抗氧化、改善免疫功能、消除自由基、抗腫瘤等作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸能夠?qū)Ψ暖熅哂性鲂p毒的作用[5]，同時通過減少誘發(fā)腫瘤炎癥因子的生成，調(diào)節(jié)免疫力，增強(qiáng)抗癌基因和抑制原癌基因表達(dá)等來發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。本文通過觀察六味地黃提取物及其聯(lián)合順鉑對人肝癌BEL-7402 一般形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遷移的影響，并探討其對血管新生因子基因表達(dá)水平的影響，闡述其抗腫瘤的可能機(jī)制，為臨床治療肝癌提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 六味地黃藥材

六味地黃由熟地黃（玄參科植物地黃干燥塊根，益陽三和中藥飲片有限公司）24 g，山萸肉（山茱萸科植物山茱萸果肉，三湘中藥飲片有限公司）12 g，山藥（薯蕷科植物薯蕷干燥根莖，永靛中藥飲片有限公司）12 g 及澤瀉（澤瀉科植物澤瀉的干燥塊莖，三湘中藥飲片有限公司）、牡丹皮（毛茛科植物牡丹干燥根皮，三湘中藥飲片有限公司）、茯苓（多孔菌科真菌茯苓干燥菌核，博世康中醫(yī)藥有限公司）各9 g 組成，經(jīng)湖南省直中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部主管藥師石雕鑒定以上中藥飲片均符合用藥標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器及試藥

CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；胎牛血清、胰蛋白酶、1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司）；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管素-2（Ang-2）、血小板反應(yīng)素（TSP）、金屬蛋白酶-2 組織抑制因子（TIMP2）人抗體（武漢博士德公司）；順鉑（齊魯制藥有限公司，規(guī)格：10 mg，批號：8C0214B02）。

1.3 細(xì)胞株

人肝癌BEL-7402 細(xì)胞（Procell）。

2 方法

2.1 六味地黃提取物的制備

按“1.1”項下藥材量打粉過篩后稱取粉末25 g，用60%乙醇50 mL 浸潤6 h，超聲（25 Hz，60 ℃）提取40 min，過濾，濾渣用60%乙醇50 mL 提取40 min，過濾，合并濾液，揮干乙醇，定容至25 mL，制備成生藥含量為1 g·mL－1的提取物待用。作用于細(xì)胞前，先用培養(yǎng)基稀釋至500 mg·mL－1，再用0.22 μm 微孔濾膜過濾，滅菌，并用培養(yǎng)基稀釋至所需的藥物濃度。

2.2 初篩六味地黃提取物給藥濃度

調(diào)整BEL-7402 細(xì)胞密度至5000 個/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，靜置培養(yǎng)24 h，設(shè)置六味地黃提取物質(zhì)量濃度梯度（500、400、300、200、100、50、25、12.5 mg·mL－1，即C1 ～C8），另設(shè)對照組，合計9 組，每組3 個復(fù)孔。待細(xì)胞充分貼壁后，加入不同質(zhì)量濃度六味地黃提取物，正常組則加入等體積的培養(yǎng)液。分別繼續(xù)培養(yǎng)48 h、72 h 后，每孔加入完全培養(yǎng)基180 μL、CCK8 溶液20 μL，孵育4 h 后用酶標(biāo)儀于450 nm 波長下測定各孔吸光度值（A），并計算各組細(xì)胞的相對抑制率。

2.3 觀察BEL-7402 細(xì)胞的一般形態(tài)學(xué)

胰蛋白酶溶液消化BEL-7402 細(xì)胞后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁后，順鉑（1 mg·mL－1）組、六味地黃提取物（100 mg·mL－1）組、聯(lián)合用藥（六味地黃提取物100 mg·mL－1＋順鉑1 mg·mL－1）組加入相應(yīng)藥物，對照組加入等量培養(yǎng)液。分別處理48 h 后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)。

2.4 細(xì)胞劃痕法檢測BEL-7402 細(xì)胞遷移能力

將對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化后，調(diào)整至適宜密度，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁后，棄掉孔內(nèi)液體，換成無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基過夜，次日采用200 μL 規(guī)格的槍頭，同時用直尺比著均勻劃出“十”字，PBS 潤洗3 次，加入低血清（含5%FBS）培養(yǎng)基，除對照組給予等量培養(yǎng)液外，其余各組加入相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，對各孔“十”字的四個邊進(jìn)行觀察，并拍照記錄細(xì)胞生長及遷移情況，隨機(jī)選取10 個視野進(jìn)行計數(shù)，并計算細(xì)胞遷移率。

2.5 Western blot 法檢測VEGF、Ang-2、TSP、TIMP2 蛋白表達(dá)

按“2.3”項下方法培養(yǎng)后收集細(xì)胞，加入RIPA 細(xì)胞裂解液和含1%PMSF 蛋白酶抑制劑混合液，于4℃條件下裂解2 h，12 000 r·min－1離心15 min，吸取上清液，分裝備用。采用BCA 法進(jìn)行蛋白（TSP、TIMP2、VEGF、Ang-2）含量測定，依據(jù)蛋白分子質(zhì)量大小選擇適宜的電泳濃縮膠和分離膠。待上樣緩沖液和蛋白樣品混勻、變性后，進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)模、封閉后，加入一抗稀釋液（VEGF、Ang-2、TSP、TIMP2），孵育過夜（4℃），加入二抗緩沖液（HRP 標(biāo)記），室溫振搖孵育1 h，通過定量分析和蛋白印跡成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，計算各蛋白目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的光密度比值以表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

2.6 RT-PCR 法檢測VEGF、Ang-2、TSP、TIMP2基因水平

將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化后，調(diào)整至適宜密度，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁后，各干預(yù)組加入對應(yīng)的藥物，對照組加入等量培養(yǎng)液。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS 潤洗2 次，采用Trizol 法（4℃，60 min）提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以real-time PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，用2－△△Ct法檢測目標(biāo)基因mRNA 的相對表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法

實驗數(shù)據(jù)用±s表示，SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，并用LSD-t檢驗進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 六味地黃提取物給藥濃度初篩結(jié)果

不同質(zhì)量濃度六味地黃提取物對BEL-7402細(xì)胞均具有明顯的抑制作用，質(zhì)量濃度為100 mg·mL－1作用48 h 后的平均細(xì)胞抑制率更接近50%，結(jié)果見圖1，故選擇質(zhì)量濃度為100 mg·mL－1作用時間48 h 進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度六味地黃提取物對BEL-7402 細(xì)胞的影響Fig 1 Effect of different concentrations of Liuwei Dihuang extracts on BEL-7402 cells

3.2 對BEL-7402 細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)的影響

對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞分布均勻，胞質(zhì)均勻透亮，胞核清晰。與對照組比較，六味地黃提取物組、順鉑組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞干預(yù)48 h 后均可見貼壁細(xì)胞減少，部分細(xì)胞變圓變小，細(xì)胞間距增大，脫落浮于培養(yǎng)液中；聯(lián)合用藥組可見有較多待脫落細(xì)胞。結(jié)果見圖2。

3.3 對BEL-7402 細(xì)胞遷移能力的影響

與對照組比較，細(xì)胞劃痕面積愈合率順鉑組為（35.6±3.5）%、六味地黃提取物組為（42.6±2.8）%、聯(lián)合用藥組為（28.4±4.2）%，細(xì)胞遷移能力均下降，兩側(cè)細(xì)胞間距明顯加大，無細(xì)胞向劃痕處遷移生長，且死亡細(xì)胞顯著增加。結(jié)果見圖3。

圖3 各組對BEL-7402 細(xì)胞遷移的影響（100×）Fig 3 Effect of each group on the migration of BEL-7402 cells（100×）

3.4 對細(xì)胞TSP、TIMP2、VEGF 及Ang-2 蛋白表達(dá)水平的影響

與對照組比較，六味地黃提取物組、順鉑組、聯(lián)合用藥組BEL-7402 細(xì)胞內(nèi)TSP、TIMP2 蛋白表達(dá)水平顯著升高，VEGF、Ang-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低；與六味地黃提取組和順鉑組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)TSP、TIMP2 蛋白表達(dá)水平顯著升高，VEGF、Ang-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低。結(jié)果見圖4。

圖4 各組細(xì)胞內(nèi)VEGF、Ang-2、TSP 及TIMP2 蛋白表達(dá)水平（± s，n ＝3）Fig 4 Protein expression of VEGF，Ang-2，TSP，and TIMP2 in each group（± s，n ＝3）

3.5 對細(xì)胞TSP、TIMP2、VEGF 及Ang-2 基因表達(dá)水平的影響

與對照組比較，六味地黃提取物組、順鉑組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)TSP、TIMP2 mRNA 表達(dá)水平顯著升高，VEGF、Ang-2 mRNA 表達(dá)水平顯著降低；與六味地黃提取組和順鉑組比較，聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)TSP、TIMP2 mRNA 表達(dá)水平顯著升高，VEGF、Ang-2 mRNA 表達(dá)水平顯著降低，結(jié)果見圖5。

圖5 各組細(xì)胞內(nèi)VEGF、Ang-2、TSP 及TIMP2 基因表達(dá)情況（± s，n ＝3）Fig 5 Gene expression of VEGF，Ang-2，TSP，and TIMP2 in each group（± s，n ＝3）

4 討論

目前，每年全球新增肝癌患者30 萬～100萬例[7]，中國占全世界發(fā)病人數(shù)的50% 以上[8]。血管新生是指從已經(jīng)存在的毛細(xì)血管網(wǎng)上再大量生成新生血管的過程，新生血管為無限增殖的細(xì)胞提供充足的養(yǎng)料和氧氣[9]。當(dāng)腫瘤生長到1 ～2 mm 時，腫瘤內(nèi)部就會有新生血管的生成，以維持腫瘤細(xì)胞對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的需要，新生血管已成為一個具有腫瘤治療前景的靶點[10]。新生血管功能和結(jié)構(gòu)的不完整可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。新生血管是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞的無限增殖和遷移是肝癌相關(guān)死亡的重要原因。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，各用藥組BEL-7402 細(xì)胞間距明顯加大，無細(xì)胞向劃痕處遷移生長，且死亡細(xì)胞顯著增加，其中聯(lián)合用藥組的抑制細(xì)胞遷移作用更為明顯，提示六味地黃提取物及其聯(lián)合順鉑對BEL-7402 細(xì)胞遷移生長具有明顯的抑制作用。

腫瘤新生血管形成過程與促血管生成因子和抗血管生成因子正負(fù)調(diào)節(jié)失衡有關(guān)，血管系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致血管生長過度或退化，新生血管是腫瘤發(fā)生和發(fā)展中一個重要的病理特征。VEGF 是一種同源二聚體糖蛋白，是調(diào)控血管生成的重要表達(dá)因子，VEGF 表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、新生血管生成。此外，VEGF 還可以自分泌的形式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[12]。腫瘤組織的缺氧、缺血、ras基因突變等生物因子的變化也會影響VEGF 的表達(dá)等[13]。Ang-2 主要呈點狀分布，僅局限在內(nèi)皮細(xì)胞和相關(guān)的外周細(xì)胞中，通過抑制 Ang-1 活化程度，形成內(nèi)分泌調(diào)節(jié)環(huán)路以維持血管生長、退化的動態(tài)平衡。Ang-2 的表達(dá)增加可促進(jìn)腫瘤血管新生和新的毛細(xì)血管再建及形成[14]。有研究表明，Ang-2 在腫瘤組織中呈高表達(dá)[15]。本實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，各干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)VEGF、Ang-2 蛋白和mRNA 表達(dá)水平顯著降低；與六味地黃提取組和順鉑組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)VEGF、Ang-2 蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低。這提示六味地黃提取物及其聯(lián)合順鉑可能通過抑制VEGF、Ang-2 mRNA 表達(dá)，繼而下調(diào)VEGF、Ang-2 蛋白表達(dá)水平來抑制血管新生。血小板反應(yīng)蛋白（TSP）能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移、抑制內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成，是一種有效的抗血管新生活性的分泌蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，TSP 可通過影響抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的轉(zhuǎn)化成有活性的形式以及通過結(jié)合CD36和CD148受體，抑制肝癌細(xì)胞遷移和新生血管生成[16]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能分解纖維類膠原的酶，以無活性的酶原形式分泌，在細(xì)胞外基質(zhì)重塑的部位易于誘導(dǎo)表達(dá)。TIMP 是MMPs 的內(nèi)源性特異性抑制因子[17]。MMP2 是明膠酶，能特異性的降解基膜中的Ⅳ型膠原，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，TIMP2 是MMP2 的抑制劑，屬于非糖基化蛋白，它以共價鍵的形式與MMP2 相結(jié)合成1∶1 復(fù)合體，對血管新生具有重要的調(diào)節(jié)作用，被證實可抑制多種癌癥的惡性轉(zhuǎn)移過程[18]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，各用藥組中TSP、TIMP2 的蛋白和mRNA 表達(dá)水平均顯著升高；與順鉑組和六味地黃提取物組比較，聯(lián)合用藥組中TSP、TIMP2 的蛋白和mRNA 表達(dá)水平均顯著升高。這提示六味地黃提取物及其聯(lián)合順鉑可能通過促進(jìn)TSP、TIMP2 mRNA 表達(dá)，繼而上調(diào)TSP、TIMP2 蛋白表達(dá)水平發(fā)揮抑制抗血管新生的作用。

綜上，六味地黃提取物及其聯(lián)合順鉑對BEL-7402 細(xì)胞遷移生長具有明顯的抑制作用，并可能通過促進(jìn)BEL-7402 細(xì)胞TSP、TIMP2 的mRNA表達(dá)水平，抑制VEGF、Ang-2 的mRNA 表達(dá)水平來抑制肝癌細(xì)胞血管新生。本研究從基因表達(dá)水平研究六味地黃提取物抗腫瘤的機(jī)制，為其臨床抗腫瘤提供了參考依據(jù)，后續(xù)將進(jìn)一步通過體內(nèi)動物實驗探究六味地黃提取物聯(lián)合順鉑抗腫瘤的作用機(jī)制。