阿膠對(duì)去卵巢小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬Aβ影響的研究

張曉雙，白黎明，白璐（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 7046；.西安市第一醫(yī)院藥學(xué)部，西安 7000）

阿膠是馬科動(dòng)物驢及其他驢皮經(jīng)煎煮濃縮制成的固體膠[1]，其性甘，平，歸肺、肝、腎經(jīng)，阿膠的藥理作用廣泛，有抗氧化、抗疲勞、提高免疫力、促進(jìn)造血、抑制癌細(xì)胞、止血等作用。兩千多年來(lái)，阿膠在中國(guó)作為一種保健食品和傳統(tǒng)中藥被廣泛地應(yīng)用于養(yǎng)生和臨床治療，常治療婦科疾病如陰道出血、痛經(jīng)、崩漏、不孕、月經(jīng)先期、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、多囊卵巢綜合征、宮頸癌等[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)阿膠16 g·kg－1能提高正常小鼠的子宮系數(shù)，提高小鼠血清雌二醇（E2）含量，降低小鼠血清促黃體生成素（LH）和促卵泡素（FSH）的含量，使小鼠子宮內(nèi)膜增厚，子宮腔增大，腺體數(shù)目增多，表明阿膠對(duì)正常小鼠具有一定的雌激素樣作用[3]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，女性絕經(jīng)后阿爾茨海默病（AD）的發(fā)病率是同齡男性的1.5 ～3 倍[4-5]，并且隨著絕經(jīng)后雌激素的減少，AD 的發(fā)生率增加。臨床上雌激素替代療法能顯著改善絕經(jīng)期婦女AD 的相關(guān)癥狀[6]，但會(huì)給患者增加患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，從天然藥物中尋找有效的AD 防治藥物是目前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，考察阿膠對(duì)去卵巢小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。

1 材料

1.1 試藥

阿膠（蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號(hào)：19A55）；戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂(lè)，批號(hào)：283A，法國(guó)拜耳公司）；Mouse ELISA E2kit（96t，森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：20191225）；HE 染色試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：20190810）；免疫組化試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：40113）；Aβ1-40 抗體（艾博抗貿(mào)易有限公司，批號(hào)：GR91656-18）。

1.2 動(dòng)物

雌性未孕小鼠，體質(zhì)量（20±2）g [成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030]。

1.3 儀器

GB-204 電子天平（瑞士梅特勒）；Forma-86℃ULT Freezer（美國(guó)熱電Forma）；KDC-160HR 高速冷凍離心機(jī)（安徽科大創(chuàng)新股份有限公司）；Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）；德國(guó)Leica DM4000B LED 智能型生物顯微鏡（德國(guó)Leica）；BI-2000 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模及分組及給藥

選取健康雌性未孕小鼠，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液35 mg·kg－1麻醉。將小鼠腹位固定，在軀干下1/3，離開(kāi)脊柱兩側(cè)各1 ～2 cm 處作縱形切口，長(zhǎng)約 1 cm，用鑷子拉出脂肪團(tuán)，找到卵巢，結(jié)扎子宮角，剪去卵巢及余線。假手術(shù)組只切除卵巢附近的脂肪，不切除卵巢，將組織推回腹腔，縫合切口。腹腔注射青霉素，每日1 次，連續(xù)一周。逐只進(jìn)行陰道涂片檢查，每日1 次，選取連續(xù)5 d 為間情期小鼠供實(shí)驗(yàn)用。造模成功的小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成模型對(duì)照組、阿膠高劑量組（16 g·kg－1）、阿膠中劑量組（8 g·kg－1）、阿膠低劑量組（4 g·kg－1）和陽(yáng)性對(duì)照組戊酸雌二醇片（0.4 mg·kg－1）組，每組10 只，給藥體積20 mL·kg－1，假手術(shù)組給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃30 d。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 Morris 水迷宮[4]在給藥結(jié)束前5 d，開(kāi)始進(jìn)行4 d 的Morris 水迷宮的定向航行實(shí)驗(yàn)，記錄從入水至找到安全平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期，測(cè)試時(shí)間限定為90 s，超過(guò)者以90 s 計(jì)；空間探索實(shí)驗(yàn)行為測(cè)試第5日撤除平臺(tái)，在站臺(tái)的相鄰象限將小鼠面向池壁放入水中，以原平臺(tái)所在的Ⅱ象限作為目標(biāo)區(qū)，記錄90 s 時(shí)限內(nèi)各組小鼠在原平臺(tái)Ⅱ象限游泳時(shí)間與總游泳時(shí)間的比值和各組小鼠準(zhǔn)確穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

2.2.2 ELISA 法測(cè)定血清E2的水平 末次灌胃24 h 后，摘眼球取血，室溫靜置30 min 后3000 r·min－1離心15 min，分離血清，ELISA 法測(cè)定血清E2的水平。

2.2.3 HE 染色觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài) Morris水迷宮測(cè)試結(jié)束后，各組小鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液0.1 mL/10 g 麻醉，快速開(kāi)胸暴露心臟，將穿刺針通過(guò)左心室進(jìn)入升主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳，快速灌注 37 ℃生理鹽水將血液沖干凈后，緩慢灌注新鮮配制的4 ℃含4%多聚甲醛的 0.1 mol·L－1的磷酸緩沖液，斷頭剝離顱骨，在潔凈冰盤上完整取出大腦，在4%多聚甲醛的磷酸緩沖液中固定，4 ℃保存，制備石蠟切片。HE 染色，觀察海馬神經(jīng)元的細(xì)胞形態(tài)。

2.2.4 免疫組化法檢測(cè)海馬CA1 區(qū)Aβ的表達(dá)參照Aβ試劑盒說(shuō)明書，按常規(guī)SABC 法進(jìn)行，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿著色為棕黃色定為陽(yáng)性細(xì)胞。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 阿膠對(duì)去卵巢小鼠Morris 水迷宮結(jié)果的影響

定向航行實(shí)驗(yàn)中，各組之間第1、2日的潛伏期未見(jiàn)明顯差異。模型組小鼠第3、4日的潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、阿膠高劑量組小鼠第3、4日的潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。空間探索實(shí)驗(yàn)，各組小鼠Ⅱ象限時(shí)間（%）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組站臺(tái)穿越次數(shù)是0，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組，阿膠高、中劑量組站臺(tái)穿越次數(shù)明顯增加（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

表1 阿膠對(duì)去卵巢小鼠Morris 水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)的影響(± s，n ＝10)Tab 1 Effect of Asini Corii Colla on Morris water maze directional navigation experiment and space exploration experiment in ovariectomized mice (± s，n ＝10)

表1 阿膠對(duì)去卵巢小鼠Morris 水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)的影響(± s，n ＝10)Tab 1 Effect of Asini Corii Colla on Morris water maze directional navigation experiment and space exploration experiment in ovariectomized mice (± s，n ＝10)

注（Note）：與假手術(shù)組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01（Compared with the sham operation group，##P ＜0.01；compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

組別劑量 逃避潛伏期/s空間探索實(shí)驗(yàn)第1日第2日第3日第4日Ⅱ象限時(shí)間/%站臺(tái)穿越次數(shù)/次假手術(shù)組－76.46±22.5867.69±25.32 48.26±23.4835.69±18.5126.94±14.211.50±1.00模型組－77.84±20.1874.25±26.54 72.16±26.48## 67.59±26.35## 22.84±15.440.00±0.00##陽(yáng)性對(duì)照組0.4 mg·kg－1 79.60±25.1864.51±22.28 57.42±28.14* 48.88±26.87*24.95±8.331.10±0.89**阿膠高劑量組16 g·kg－175.15±30.4665.62±33.85 59.45±38.72* 53.31±33.29*20.37±9.091.29±0.59**阿膠中劑量組8 g·kg－175.61±18.1271.18±22.73 66.11±30.0659.52±25.6524.56±9.511.43±0.64**阿膠低劑量組4 g·kg－180.82±19.3375.39±22.65 70.50±23.4464.52±25.2821.10±11.330.4±1.00

圖1 阿膠對(duì)去卵巢小鼠Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)軌跡圖Fig 1 Experimental trace of Asini Corii Colla on Morris water maze in ovariectomized mice

3.2 阿膠對(duì)去卵巢小鼠血清E2 激素水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠血清E2水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，阿膠高、中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清E2水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 阿膠對(duì)去卵巢小鼠血清E2 激素水平的影響(± s，n ＝10)Tab 2 Effect of Asini Corii Colla on the serum E2 hormone level in ovariectomized mice (± s，n ＝10)

表2 阿膠對(duì)去卵巢小鼠血清E2 激素水平的影響(± s，n ＝10)Tab 2 Effect of Asini Corii Colla on the serum E2 hormone level in ovariectomized mice (± s，n ＝10)

注（Note）：與假手術(shù)組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01（Compared with the sham operation group，##P ＜0.01；compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

組別劑量E2 /（ng·L－1）假手術(shù)組－52.20±10.57模型組－20.20±4.87##陽(yáng)性對(duì)照組0.4 mg·kg－178.20±16.54**阿膠高劑量組16 g·kg－133.30±4.00**阿膠中劑量組8 g·kg－129.80±9.82*阿膠低劑量組4 g·kg－125.60±6.70

3.3 阿膠對(duì)去卵巢小鼠海馬CA1 區(qū)組織形態(tài)學(xué)的影響

假手術(shù)組海馬CA1 區(qū)可見(jiàn)緊密排列的錐體細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞核仁、核膜清晰，胞漿染色正常；模型組海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，部分神經(jīng)元脫失，神經(jīng)元大小不一，形態(tài)改變，呈三角形或不規(guī)則形，核固縮，模糊不清，部分細(xì)胞皺縮呈細(xì)梭形；陽(yáng)性對(duì)照組、阿膠高、中劑量與模型組相比，神經(jīng)細(xì)胞核固縮減少，神經(jīng)元變性程度減輕，完整錐體細(xì)胞數(shù)明顯增多。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 阿膠對(duì)去卵巢小鼠海馬組織形態(tài)學(xué)的影響（HE，200×）Fig 2 Effect of Asini Corii Colla on histomorphology of hippocampus in ovariectomized mice（HE，200×）

3.4 阿膠對(duì)去卵巢小鼠海馬Aβ 的表達(dá)的影響

假手術(shù)組海馬陽(yáng)性細(xì)胞較少，染色較淡，模型組海馬Aβ陽(yáng)性細(xì)胞較多。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和阿膠高劑量海馬Aβ陽(yáng)性細(xì)胞減少，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 阿膠對(duì)去卵巢小鼠海馬Aβ 表達(dá)的影響（免疫組化，200×）Fig 3 Effect of Asini Corii Colla on Aβ expression in hippocampus of ovariectomized mice（immunohistochemistry，200×）

3.5 圖像分析結(jié)果顯示

與假手術(shù)組比較，模型組海馬Aβ陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度（IOD）顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組，阿膠高、中劑量組海馬Aβ陽(yáng)性細(xì)胞IOD 顯著減少（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 阿膠對(duì)去卵巢小鼠海馬Aβ 陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度(± s，n ＝10)Tab 3 Effect of Asini Corii Colla on integral optical density of Aβ positive cells in the hippocampus of ovariectomized mice (± s，n ＝10)

表3 阿膠對(duì)去卵巢小鼠海馬Aβ 陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度(± s，n ＝10)Tab 3 Effect of Asini Corii Colla on integral optical density of Aβ positive cells in the hippocampus of ovariectomized mice (± s，n ＝10)

注（Note）：與假手術(shù)組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01（compared with the sham operation group，##P ＜0.01；compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

組別劑量 IOD假手術(shù)組－38.28±8.37模型組－75.50±10.23##陽(yáng)性對(duì)照組0.4 mg·kg－155.18±9.18**阿膠高劑量組 16 g·kg－153.58±11.32**阿膠中劑量組 8 g·kg－162.38±12.65*阿膠低劑量組 4 g·kg－167.28±12.82

4 結(jié)論

雌激素是人體內(nèi)重要的類固醇激素，雌激素主要包括E2，其次為雌酮和雌三醇，E2的生理功效最強(qiáng)，雌激素在體內(nèi)含量的變化影響生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)等的生理代謝過(guò)程[7]。卵巢是雌激素的主要來(lái)源，婦女進(jìn)入絕經(jīng)期后，體內(nèi)雌激素水平將會(huì)快速下降，導(dǎo)致更年期綜合征、骨質(zhì)疏松癥、AD 和心血管疾病等。更年期婦女采用雌激素替代療法來(lái)治療或預(yù)防這些絕經(jīng)期易出現(xiàn)的癥狀。但長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素易產(chǎn)生高血壓、水腫等不良反應(yīng)，并增加乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌等婦科腫瘤的發(fā)病危險(xiǎn)。因此人們一直致力于尋求雌激素替代物，期望這種替代物既能發(fā)揮雌激素對(duì)心腦血管等系統(tǒng)的保護(hù)作用，緩解更年期綜合征，又能避免上述不良反應(yīng)，這類物質(zhì)即被稱為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑[8]。

女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素分泌減少會(huì)帶來(lái)許多生理、心理上的變化[9]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，圍經(jīng)期女性存在較高的AD 患病率，而且隨著絕經(jīng)后雌激素的減少，AD 的發(fā)生率越高。雌激素對(duì)于AD 有積極的影響，雌激素能夠促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞軸突、樹(shù)突的生長(zhǎng)、突觸的形成，雌激素可促進(jìn)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)而促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶，雌激素具有抗興奮性氨基酸毒性、增加大腦皮質(zhì)血流量和提高大腦葡萄糖的利用率，雌激素可減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡并且可以防止毒性Aβ片段的產(chǎn)生等[10-11]。去卵巢所致動(dòng)物模型和雌激素信號(hào)通路常用于AD的發(fā)病機(jī)制及抗AD 藥物的藥效與機(jī)制研究[12]。

阿膠屬于膠類藥材，為動(dòng)物的皮熬制而成的明膠類物質(zhì)。從阿膠中檢測(cè)和分離出來(lái)的成分主要包括氨基酸、蛋白質(zhì)/明膠、多糖、揮發(fā)性物質(zhì)、無(wú)機(jī)物等。阿膠以滋陰補(bǔ)血、補(bǔ)虛止血為見(jiàn)長(zhǎng)，適用于血虛萎黃，眩暈心悸、肌痿無(wú)力，心煩不眠，虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)，肺燥咳嗽，勞嗽咯血，便血崩漏，妊娠胎漏等病癥[13]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿膠能夠改善去卵巢AD 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，高劑量組作用比較顯著，可能與其神經(jīng)元保護(hù)作用和減少Aβ沉積有關(guān)。其作用機(jī)制還待進(jìn)一步研究。