馬里苷通過調(diào)控自噬保護(hù)糖尿病db/db小鼠心肌損傷

祖力皮亞·阿布拉，李甜，蘭怡，克迪熱亞·卡迪爾，宋志鵬，張博翔，張雁潮，彭小雨，毛新民，5*（.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 80000；.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，烏魯木齊 80000；.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 80000；.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 80000；5.新疆維吾爾自治區(qū)中西醫(yī)重點(diǎn)學(xué)科，烏魯木齊 80000）

糖尿病是以細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞功能障礙，引起胰島素抵抗或進(jìn)行性分泌不足的以血糖、血脂、蛋白質(zhì)代謝紊亂為特征的代謝性疾病[1]。其中2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）在糖尿病類型中最為常見，主要表現(xiàn)特征有高血糖、胰島素分泌缺陷、胰島素抵抗和高胰島素血癥等。心血管病變的加速發(fā)展是2 型糖尿病主要致死致殘的主要原因之一[2]。尋找新的靶點(diǎn)或藥物對糖尿病患者的心肌病變進(jìn)行預(yù)防和治療具有重要臨床意義。

目前，糖尿病心肌病變的機(jī)制不清。自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種自穩(wěn)機(jī)制，它通過溶酶體降解來消除細(xì)胞中多余和受損的結(jié)構(gòu)，以維持細(xì)胞正常生理功能，從而適應(yīng)各種不良刺激[3]。自噬在維持心臟功能和形態(tài)中起著重要作用。心肌細(xì)胞自噬不僅是心肌細(xì)胞正常的生理反應(yīng)，同時(shí)還參與心臟功能紊亂、心肌纖維化、心肌肥大等心肌損傷過程，調(diào)控心肌細(xì)胞自噬對心肌功能紊亂發(fā)揮積極作用[4]。

兩色金雞菊（Coreopsis tinctoriaNutt）又名昆侖雪菊，為菊科金雞菊屬的野生草本植物，始載于《新華本草綱要》[5]，其頭狀花序入藥，具有降血糖、降血脂、降壓、軟化血管、抑制細(xì)菌生長的功效，是防治糖尿病、冠心病等疾病的特殊藥食兩用的草藥[6]。研究發(fā)現(xiàn)，兩色金雞菊富含黃酮類化合物[7]。馬里苷（marein）是黃酮類化合物的主要活性成分之一，為查爾酮主要的葡萄糖苷[8]，其具有良好的降血糖[9]、調(diào)血脂、降血壓[10]等功效。本課題組前期研究已證實(shí)，兩色金雞菊的活性成分通過降血糖、抗氧化應(yīng)激等發(fā)揮保護(hù)腎臟、肝臟的作用，但對心臟保護(hù)作用的機(jī)制仍有待于研究。因此，本實(shí)驗(yàn)研究兩色金雞菊中馬里苷對2 型糖尿病db/db 小鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

5 ～6 周齡，SPF 級(jí)雄性db/db 小鼠24 只，雄性db/m 小鼠6 只，體質(zhì)量22 ～35 g [江蘇卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010]。本實(shí)驗(yàn)所用db/db和db/m 小鼠及實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)條件均符合國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)制訂的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 試藥

馬里苷由本課題組提?。ㄐ陆t(yī)科大學(xué)藥學(xué)院從兩色金菊中提取，HPLC 法測定純度為99%），鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：H20023370），小鼠胰島素（INS）ELISA 試劑盒（江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，批號(hào)：MB-3315B 48T），蘇木素（Biosharp life Science，批號(hào)：69090030），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Thermo，批號(hào)：RH237562），聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）凝膠試劑盒（北京索萊寶有限公司，批號(hào)：20190708），抗LC3Ⅱ/Ⅰ單克隆抗體（批號(hào)：4108S）、抗P62 單克隆抗體（批號(hào)：39749S）（美國 Cell-Technology 公司），GAPDH（批號(hào)：GA003-R）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H ＋L）二抗（批號(hào)：IH-0011）（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.3 儀器

卓越精采血糖儀（瑞士Roche 公司），STS-2型脫色搖床（上海琪特分析儀器有限公司），Axio-ObserverZ1 倒置顯微鏡（德國ZEISS），Benchmark PLUS 全波長酶標(biāo)儀、156-8001 型垂直電泳槽、Gel-DocXR ＋凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥

db/db 小鼠24 只，按體質(zhì)量和空腹血糖值（FBG）隨機(jī)分為模型組、陽性對照組（鹽酸二甲雙胍 280 mg·kg－1）和實(shí)驗(yàn)組（馬里苷，50 mg·kg－1）[11-12]，每組6 只；選取同來源的db/m小鼠6 只設(shè)為正常對照組。各組灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)8 周，模型組和正常對照組給予相應(yīng)的等體積的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液。

2.2 小鼠體質(zhì)量和FBG 檢測

觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況，記錄大鼠攝食、飲水情況，注意小鼠皮毛色澤的變化等；給藥后每周檢測小鼠體質(zhì)量；在給藥干預(yù)的第0、4、6、8 周，小鼠禁食不禁水，尾靜脈采血，用血糖儀檢測各組小鼠FBG。

2.3 生化檢測TC 和TG 含量

各組小鼠用藥物干預(yù)8 周后，禁食12 h 不禁水，眼眶取血，37℃放置30 min，3000 r·min－1離心10 min，分離血清。采用生化儀檢測血清中TC、TG 含量。

2.4 ELISA 檢測血清胰島素含量

采用ELISA 法按試劑盒說明測定血清胰島素水平。

2.5 HE 染色觀察小鼠心肌組織病理形態(tài)改變

小鼠頸脈脫臼處死，迅速提取小鼠心臟，用遇冷的生理鹽水沖洗干凈，吸水紙吸干多余的水分，即得心肌組織。取心肌組織，用4% 多聚甲醛溶液固定24 h 后，脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，脫水透明，封固，在光鏡下觀察小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變。

2.6 透視電鏡觀察自噬小體

剪取約1 mm2小塊左心室組織置于2.5% 戊二醛固定，用 PBS 清洗，用四氧化鋨固定液固定2 h 后棄固定液，用乙醇逐級(jí)脫水，包埋切片，使用透視電鏡觀察心肌細(xì)胞自噬體。

2.7 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測分析

將冷存的心肌組織解凍，取50 mg 組織研磨，加入預(yù)冷的含1% 蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液500μL，裂解30 min，勻漿，離心10 min（4℃ 12 000 r·min－1），取上清液，并用BCA 蛋白試劑盒測定蛋白濃度；通過電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育，顯色成像。以GAPDH 為內(nèi)參，檢測微管關(guān)聯(lián)蛋白1A 和1B（LC3）、SQSTM1 蛋白（p62）的表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），當(dāng)P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 馬里苷對db/db 小鼠FBG 和體質(zhì)量的影響

正常對照組小鼠FBG 和體質(zhì)量穩(wěn)定。與正常對照組比較，模型組小鼠FBG 和體質(zhì)量明顯升高；與模型組相比較，實(shí)驗(yàn)組FBG 和體質(zhì)量無明顯變化（見圖1）。

圖1 馬里苷對空腹血糖、體質(zhì)量的影響Fig 1 Effect of marein on fasting glucose and body mass

3.2 馬里苷對小鼠TC、TG 及胰島素水平的影響

正常對照組小鼠TC、TG 及胰島素水平穩(wěn)定。模型組小鼠較正常對照組小鼠血清中TC、TG 及胰島素水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組TC、TG 及胰島素水平顯著降低（P＜0.01），說明馬里苷可改善db/db 小鼠血脂異常和胰島素抵抗（見表1）。

表1 馬里苷對TC、TG 及胰島素水平的影響(± s)Tab 1 Effect of marein on the level of TC，TG and insulin (± s)

表1 馬里苷對TC、TG 及胰島素水平的影響(± s)Tab 1 Effect of marein on the level of TC，TG and insulin (± s)

注（Note）：與正常對照組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，**P ＜0.01（Compared with the normal control group，##P ＜0.01；compared with the model group，**P ＜0.01）。

胰島素/（mU·L－1）正常對照組 1.82±0.521.43±0.1530.11±1.71模型組10.19±1.52##7.70±1.36##36.70±0.85##陽性對照組 7.62±1.25**5.86±0.59**25.93±3.99**實(shí)驗(yàn)組 6.10±1.31**4.74±1.47**29.21±3.29**組別TC/（mmol·L－1）TG/（mmol·L－1）

3.3 小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化

心肌組織HE 染色結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠心肌纖維肥大、腫脹明顯、可見部分心肌纖維斷裂及局部炎細(xì)胞浸潤、細(xì)胞間質(zhì)明顯增多。陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌纖維無明顯肥大、腫脹、心肌間質(zhì)正常（見圖2）。

圖2 馬里苷對db/db 小鼠心肌組織病理學(xué)的影響（HE，400×）Fig 2 Effect of marein on the myocardial histopathology in db/db mice（HE，400×）

3.4 透射電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)和自噬小體

透射電鏡檢測顯示，正常對照組小鼠顯示連續(xù)規(guī)則的肌節(jié)并構(gòu)成肌原纖維，線粒體分布于肌原纖維之間，自噬小體形成；而模型組小鼠出現(xiàn)肌原纖維斷裂、肌原原纖維紊亂、線粒體排列紊亂，自噬小體數(shù)量減少；馬里苷干預(yù)后上述情況有所改善，且自噬小體數(shù)量有所增加（見圖3）。

圖3 馬里苷對心肌超微結(jié)構(gòu)和自噬小體的影響Fig 3 Effect of marein on the myocardial ultrastructure and autophagosomes

3.5 馬里苷對心肌組織自噬指標(biāo)p62 和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)的影響

自噬對心臟功能及結(jié)構(gòu)的維持至關(guān)重要，在應(yīng)激狀態(tài)下自噬的激活可以通過降解、循環(huán)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生能量來維持心肌細(xì)胞存活。Western blot 結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠心肌組織p62 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），表明心肌細(xì)胞自噬被抑制；馬里苷干預(yù)后，小鼠心肌組織p62表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），表明馬里苷可以促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬（見圖4）。

圖4 馬里苷對db/db 小鼠心肌自噬的影響Fig 4 Effect of marein on the myocardial autophagy in db/db mice

4 討論

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，2019年全球糖尿病患病率為9.3%（4.63 億人），到2030年預(yù)測患病率將上升到10.2%（5.78 億），到2045年將上升到10.9%（7 億）[13]。在2 型糖尿病患者中，患有心血管疾病的數(shù)量逐日上升[14]。1972年臨床首次發(fā)現(xiàn)與2 型糖尿病有關(guān)的心肌病患者，并推測患者心肌病變由彌漫性心肌纖維化、心肌肥大和糖尿病性微血管引起的[15]。

馬里苷為兩色金雞菊黃酮類化合物主要有效成分之一。馬里苷具有抗氧化[16]和較好的自由基清除能力[17]，且可以改善高血糖引起的胰島素抵抗，抑制細(xì)胞凋亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，馬里苷藥物干預(yù)后，糖尿病小鼠TC、TG 和胰島素水平顯著降低。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，兩色金雞菊黃酮有效成分，在高糖誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞損傷模型中，通過促進(jìn)自噬，從而發(fā)揮對HUVEC 內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[18]。本實(shí)驗(yàn)采用db/db 糖尿病動(dòng)物模型，探討兩色金雞菊黃酮主要有效成分馬里苷通過調(diào)控自噬對糖尿病db/db 小鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

自噬是一種自我降解的過程，在平衡機(jī)體發(fā)育所需能量和調(diào)節(jié)營養(yǎng)等方面至關(guān)重要。自噬可以清除錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白、受損的細(xì)胞器（包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體等）以及細(xì)胞內(nèi)病原體，被認(rèn)為是自我保護(hù)過程。自噬在癌癥、糖尿病、神經(jīng)變性、心肌病、肝病、感染性疾病與自身免疫性疾病等疾病的預(yù)防和治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[19]。Sybers 等[20]在1976年發(fā)現(xiàn)了心肌細(xì)胞內(nèi)存在自噬現(xiàn)象，心肌細(xì)胞自噬失調(diào)導(dǎo)致心肌功能紊亂、心肌纖維化、心肌肥大、心力衰竭和過早死亡等[4]。自噬是維持心肌細(xì)胞大小以及整體心臟結(jié)構(gòu)和功能的一種穩(wěn)態(tài)機(jī)制，在衰竭心臟中通過上調(diào)自噬從而使心肌細(xì)胞免受血流動(dòng)力學(xué)應(yīng)激的影響[21]。自噬障礙可以引起心肌肥大、壓力超負(fù)荷心力衰竭、缺血性心肌病及糖尿病心肌病等[22]。自噬的調(diào)控機(jī)制很復(fù)雜，它是由多種信號(hào)通路及其調(diào)控因子共同介導(dǎo)完成的。微管關(guān)聯(lián)蛋白1A 和1B（microtubuleassociated proteins 1A/1B light chain 3，LC3）是一種可溶性蛋白，分布在哺乳動(dòng)物組織中，是哺乳動(dòng)物Atg8基因的同源物，主要定位在前自噬泡和自噬泡膜的表面，是自噬體特異性標(biāo)志蛋白[23]。LC3 前體加工形成LC3-Ⅰ，經(jīng)泛素化修飾后通過Atg7/Atg3 與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變到LC3-Ⅱ是自噬啟動(dòng)的標(biāo)志，由LC3-Ⅱ/Ⅰ反映自噬表達(dá)水平[24-25]。p62 是一種多域蛋白，也是哺乳動(dòng)物選擇性自噬的載體蛋白[26]，p62 可與定位在自噬小體內(nèi)膜上的LC3-Ⅱ形成復(fù)合體，從而削弱LC3-Ⅱ的活性，同時(shí)，p62 蛋白本身又受自噬調(diào)節(jié)的作用，其表達(dá)與自噬活性成負(fù)相關(guān)[27]。研究發(fā)現(xiàn)，高糖缺氧誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，自噬相關(guān)蛋白LC3 表達(dá)下調(diào)，p62 表達(dá)上調(diào)，高糖缺氧條件下，自噬功能受損，上調(diào)自噬可以降低凋亡率，保護(hù)細(xì)胞受損[28]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組中，LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)顯著降低，p62 的表達(dá)顯著升高，自噬小體數(shù)量減少，自噬被抑制，心肌肌原纖維斷裂，心肌纖維肥大、腫脹、排列紊亂，心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變；馬里苷干預(yù)后，LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)顯著升高，p62 的表達(dá)顯著降低，自噬小體數(shù)量增加。提示馬里苷可促進(jìn)自噬，改善心肌組織結(jié)構(gòu)，保護(hù)心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次探討馬里苷對糖尿病db/db 小鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，并初步證實(shí)馬里苷通過促進(jìn)自噬，改善心肌組織結(jié)構(gòu)，保護(hù)心肌細(xì)胞損傷，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。