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      高效液相色譜法測(cè)定拉莫三嗪片中的有關(guān)物質(zhì)

      2021-09-04 07:22:02姜金生石笑弋劉軼歐陽冬生陳俊陳開義胡杰三金集團(tuán)湖南三金制藥有限責(zé)任公司湖南常德4500湖南省藥品檢驗(yàn)研究院湖南藥用輔料檢驗(yàn)檢測(cè)中心長(zhǎng)沙4000中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所長(zhǎng)沙4000復(fù)雜基質(zhì)樣本生物分析湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)沙40000
      中南藥學(xué) 2021年8期
      關(guān)鍵詞:拉莫三嗪稀釋液

      姜金生,石笑弋,劉軼*,歐陽冬生,陳俊,陳開義,胡杰(.三金集團(tuán)湖南三金制藥有限責(zé)任公司,湖南 常德 4500;.湖南省藥品檢驗(yàn)研究院(湖南藥用輔料檢驗(yàn)檢測(cè)中心),長(zhǎng)沙 4000;3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所,長(zhǎng)沙 4000;4.復(fù)雜基質(zhì)樣本生物分析湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 40000)

      拉莫三嗪(lamotrigine)是新一代的抗癲癇藥,在臨床上可單獨(dú)使用也可聯(lián)合使用治療癲癇,療效顯著,基本上沒有致畸性。臨床上拉莫三嗪還可用于雙相情感障礙的治療,安全性較好[1]。在合成拉莫三嗪原料藥中可能引入工藝雜質(zhì),比如2,3-二氯苯甲酰氯、2,3-二氯苯甲酰氰、2,3-二氯苯甲酸(拉莫三嗪雜質(zhì)I,文中稱為雜質(zhì)B)等,在拉莫三嗪制劑儲(chǔ)存過程中可能產(chǎn)生一些降解雜質(zhì),如2,3-二氯苯甲酸(雜質(zhì)B)、3-氨基-6-(2,3-二氯苯基)-1,2,4-三嗪-5-(4H)-酮(雜質(zhì)C)、6-(2,3-二氯苯基)-1,2,4-三嗪-3,5-(2H,4H)-二酮(雜質(zhì)E)等(見表1)。目前關(guān)于這些雜質(zhì)檢測(cè)方法的文獻(xiàn)報(bào)道不多[2-3],且各國(guó)藥典與國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)雜質(zhì)的命名各不相同。

      表1 拉莫三嗪片有關(guān)物質(zhì)Tab 1 Related impurity in lamotrigine tablets

      英國(guó)藥典(BE2018)[4]與歐洲藥典(EP9.0)[5]中拉莫三嗪原料藥與片劑的檢測(cè)方法相同,均采用兩個(gè)不同的液相色譜方法分別測(cè)定拉莫三嗪的有關(guān)物質(zhì),美國(guó)藥典(USP41)[6]對(duì)拉莫三嗪原料藥與片劑的有關(guān)物質(zhì)采用不同的液相色譜方法分別偏重于工藝雜質(zhì)與降解雜質(zhì)的檢測(cè)。黃諾哲等[7]在EP9.0 的基礎(chǔ)上,把150 mm 長(zhǎng)度的色譜柱改為250 mm 色譜柱同步改變洗脫持續(xù)時(shí)間并采用雙波長(zhǎng)的高效液相色譜方法,該方法雖能同時(shí)檢測(cè)雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D,但對(duì)BP 藥典中雜質(zhì)G 與某氧化降解雜質(zhì)的分離度不理想,工藝雜質(zhì)2,3-二氯苯甲酰氰、2,3-二氯苯甲酰氯和可能的降解雜質(zhì)E 未見檢測(cè)報(bào)道。Emami 等[8]以高效液相色譜等度洗脫的方法能同時(shí)檢測(cè)雜質(zhì)C和雜質(zhì)D,但對(duì)雜質(zhì)B、雜質(zhì)E 以及工藝雜質(zhì)等未能有效檢出。文獻(xiàn)采用以甲醇-0.5%三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0)為流動(dòng)相的高效液相色譜等度洗脫法對(duì)拉莫三嗪片進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)[2-3],與企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9-10]一樣,由于流動(dòng)相pH 值相同,雜質(zhì)B 與拉莫三嗪主峰分離不好,雜質(zhì)D與雜質(zhì)E 出峰時(shí)間在100 min 左右,不能有效對(duì)拉莫三嗪有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

      本文在企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YBH0245 2014[9]、WS1-(X-119)-2012Z[10]、YBH04392010[11]的基礎(chǔ)上結(jié)合國(guó)內(nèi)外拉莫三嗪相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及文獻(xiàn)報(bào)道[2-7],參照《中國(guó)藥典》2020年版四部[12]、《化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)原則》[13]和《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[14],進(jìn)一步開發(fā)出能同時(shí)檢測(cè)可能的工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)的高效液相色譜方法,并對(duì)主要控制雜質(zhì)進(jìn)行相對(duì)保留時(shí)間和校正因子研究,為拉莫三嗪原料藥與制劑的質(zhì)量控制提供參考。

      1 材料

      1.1 儀器

      MS205DU 十萬分之一電子天平(Mettler Toledo 公司);LC-20A 島津高效液相色譜儀(日本島津公司);PHSJ-4F pH 計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

      1.2 試藥

      拉莫三嗪片(批號(hào):181208、181209、181210,自制);拉莫三嗪對(duì)照品(批號(hào):100775-201902,中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度:99.7%);雜質(zhì)B(拉莫三嗪雜質(zhì)I)對(duì)照品(批號(hào):510086-201401,中國(guó)食品藥品檢定研究院,供有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)用);拉莫三嗪雜質(zhì)C 對(duì)照品(批號(hào):F3L329,USP,供有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)用);2,3-二氯苯甲酰氯(批號(hào):170037,自制);2,3-二氯苯甲酰氰(雜質(zhì)F,批號(hào):1703007,自制);縮合物(雜質(zhì)A1,批號(hào):10901-1806005y,自制);拉莫三嗪雜質(zhì)D 對(duì)照品(批號(hào):F1H279,USP,供有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)用);拉莫三嗪雜質(zhì)E 對(duì)照品(批號(hào):L2011011,U.K,供有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)用);甲醇(色譜純,TEDIA)、磷酸(色譜純)、三乙胺(色譜純)、鹽酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、30% 過氧化氫(分析純)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);純化水(自制)。

      2 方法

      2.1 色譜條件

      色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相A 為甲醇,流動(dòng)相B 為 0.5%三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至4.5),梯度洗脫(見表2);流速為0.8 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm;柱溫為40℃;進(jìn)樣量為20 μL。

      表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution program

      2.2 溶液配制

      2.2.1 供試品溶液 取本品細(xì)粉適量(相當(dāng)于拉莫三嗪約20 mg),精密稱定,置于50 mL 量瓶中,加入稀釋液(甲醇-0.1 mol·L-1鹽酸溶液=20∶80,V/V)適量,制成每1 mL 中約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液,搖勻,作為供試品溶液。

      2.2.2 對(duì)照溶液 精密量取供試品溶液適量,加稀釋液定量稀釋制成每1 mL 中約含拉莫三嗪0.8 μg 的溶液,作為對(duì)照溶液。

      2.2.3 空白溶劑 以稀釋液作為空白溶劑。

      2.2.4 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 分別稱取拉莫三嗪、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)A1、雜質(zhì)F 自制對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇適量溶解,再以稀釋液稀釋成適當(dāng)濃度的溶液,作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

      2.2.5 系統(tǒng)適用性溶液 取拉莫三嗪約10 mg,加適量6 mol·L-1氫氧化鈉溶液,置90℃加熱約1 h,用6 mol·L-1鹽酸溶液中和,再加入10 mL 雜質(zhì)B 對(duì)照品溶液(精密稱取雜質(zhì)B 對(duì)照品適量,加甲醇溶解并稀釋成 0.1 mg·mL-1)和雜質(zhì)E 對(duì)照品溶液約2 mL(精密稱取雜質(zhì)E 對(duì)照品適量,加甲醇溶解并稀釋成 0.1 mg·mL-1),用稀釋液稀釋至每1 mL 中約含拉莫三嗪0.4 mg、雜質(zhì)B 0.04 mg、雜質(zhì)E 0.008 mg 的混合溶液,作為系統(tǒng)適用性溶液。

      2.3 專屬性試驗(yàn)

      2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液及空白溶劑,空白輔料溶液按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備,進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,雜質(zhì)B、拉莫三嗪、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E 依次出峰,分離度符合要求,拉莫三嗪理論塔板數(shù)不低于5000,雜質(zhì)B 峰相對(duì)保留時(shí)間約為0.8,與拉莫三嗪峰分離度達(dá)到1.5,相對(duì)保留時(shí)間1.0 ~2.0 的雜質(zhì)C(主要降解雜質(zhì))的相對(duì)保留時(shí)間約為1.7,系統(tǒng)適應(yīng)性良好(見圖1)。

      圖1 系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖Fig 1 Chromatogram of system suitability test

      取雜質(zhì)A1、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F 對(duì)照品儲(chǔ)備液用稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度后按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定,結(jié)果各雜質(zhì)出峰時(shí)間分別約為46.61、48.96、50.36 min,分離度均大于6.5,能較好地檢測(cè)分離。

      2.3.2 破壞性試驗(yàn)

      ① 未破壞:取拉莫三嗪片(規(guī)格:50 mg,批號(hào):181208)按“2.2.1”項(xiàng)下方法配制未破壞溶液。

      ② 酸、堿破壞:分別取本品粉末適量(約相當(dāng)于拉莫三嗪20 mg),精密稱定,分別加入1 mL 6 mol·L-1鹽酸溶液或6 mol·L-1氫氧化鈉溶液,90℃水浴加熱分別約3 h(酸破壞)和1 h(堿破壞),放冷至室溫,取6 mol·L-1氫氧化鈉溶液或6 mol·L-1鹽酸溶液中和,加稀釋液溶解并稀釋成每1 mL 約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液,濾過,取續(xù)濾液作酸、堿降解樣品溶液;稱取處方量空白輔料,同法配制,作為空白輔料降解溶液。

      ③ 氧化破壞:取本品粉末適量(約相當(dāng)于拉莫三嗪20 mg),精密稱定,加入30%過氧化氫溶液1 mL,90℃水浴加熱約1 h,放置室溫,加稀釋液溶解并稀釋成每1 mL 約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液,濾過,取續(xù)濾液作氧化降解樣品溶液;稱取處方量空白輔料,同法配制,作為空白輔料降解溶液。

      ④ 光照、高溫破壞:分別取本品粉末適量,分別置105℃烘烤8 h、(4500±500)Lx 強(qiáng)度下光照3 d,精密稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于拉莫三嗪20 mg),加適量稀釋液溶解并稀釋成每1 mL 中約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液,濾過,取續(xù)濾液即得光照、高溫降解樣品溶液;稱取處方量空白輔料,同法配制,作為空白輔料降解溶液。

      取上述各溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。結(jié)果空白輔料不干擾主成分峰、特定雜質(zhì)峰的檢測(cè)。拉莫三嗪峰與雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 分離較好。在高溫、光照條件下,拉莫三嗪片較穩(wěn)定,在酸、堿、氧化條件下所產(chǎn)生雜質(zhì)均能與主峰良好分離,不干擾本品有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定(見圖2)。

      圖2 樣品破壞性試驗(yàn)色譜圖Fig 2 Chromatogram of sample destruction test

      2.4 相對(duì)保留時(shí)間

      分別精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,加稀釋液稀釋成每1 mL 約含雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 和拉莫三嗪均為0.5 μg 的混合液。對(duì)雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 相對(duì)拉莫三嗪的保留時(shí)間在不同色譜柱[Welch、thermo、Agela、Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)]進(jìn)行研究,雜質(zhì)B 相對(duì)拉莫三嗪主峰保留時(shí)間(RRT)較穩(wěn)定,均為0.8;雜質(zhì)C 相對(duì)拉莫三嗪RRT 在1.5 ~1.7,其中Agela 色譜柱和Kromasil色譜柱的RRT 均為1.7??紤]到不同色譜柱對(duì)雜質(zhì)C 的相對(duì)保留時(shí)間有一定的影響,對(duì)同一品牌(Kromasil)不同批次填料(色譜柱1 和色譜柱2)及不同序列號(hào)的色譜柱(色譜柱2 和色譜柱3)進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 的相對(duì)保留時(shí)間都較穩(wěn)定,相對(duì)拉莫三嗪主峰RRT 約為0.8、1.7,同時(shí)以系統(tǒng)適應(yīng)性溶液按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行雜質(zhì)定位與驗(yàn)證。

      2.5 線性關(guān)系與校正因子

      根據(jù)“2.4”項(xiàng)下不同色譜柱考察結(jié)果,以Kromasil 色譜柱考察雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 的校正因子。分別精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,稀釋成一系列濃度的混合對(duì)照品溶液,取3 根不同色譜柱按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果雜質(zhì)B、雜質(zhì)C與拉莫三嗪質(zhì)量濃度在0.5 ~5 μg·mL-1與峰面積呈較好的線性關(guān)系,計(jì)算拉莫三嗪相對(duì)于雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 的校正因子F(F=K雜質(zhì)線性斜率/K拉莫三嗪線性斜率),結(jié)果雜質(zhì)B 的平均校正因子為2.7,雜質(zhì)C 的平均校正因子為1.4,結(jié)果見表3。

      表3 雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 和拉莫三嗪線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 3 Linearity of impurity B,impurity C and lamotrigine

      2.6 定量限和檢測(cè)限

      取“2.2.4”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,再用稀釋液稀釋成適當(dāng)濃度的對(duì)照品溶液,照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣。以信噪比(S/N)=3 為檢測(cè)限,以S/N=10 為定量限,結(jié)果拉莫三嗪、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 的定量限分別為3.9、9.1、10.6 ng;檢測(cè)限分別為1.3、2.7、3.3 ng。

      2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

      取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液和對(duì)照溶液于室溫下放置,另取雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對(duì)照品適量,精密稱定,加適量甲醇溶解并用稀釋液稀釋成每1 mL 約含0.8 μg 雜質(zhì)B 和2 μg 雜質(zhì)C 的混合溶液,于室溫下放置。供試品溶液于0、2、4.5、7、9.5、14、17.5、26 h 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣;對(duì)照溶液于0、2、4.5、7、9.5、17.5、23.5、26 h 分別進(jìn)樣測(cè)定,雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 的混合溶液于0、2、4.5、6、8、10.5、13、19.5 h 分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液、對(duì)照溶液放置26 h,拉莫三嗪峰面積RSD分別為0.050%、1.7%,穩(wěn)定性均較好。雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 溶液放置19.5 h,峰面積RSD分別為0.90%、0.60%,穩(wěn)定性均較好。

      2.8 精密度與準(zhǔn)確度

      2.8.1 精密度試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液和對(duì)照溶液各 6 份,另取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量,分別加稀釋液稀釋成每1 mL 含雜質(zhì)B 約0.8 μg、雜質(zhì)C 約2 μg 的對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,結(jié)果供試品溶液拉莫三嗪、對(duì)照溶液拉莫三嗪、對(duì)照品溶液中雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 的保留時(shí)間和峰面積RSD均小于2.0%,表明儀器精密度良好。

      2.8.2 中間精密度試驗(yàn) 由不同操作人員在不同時(shí)間和不同儀器分別按“2.8.1”項(xiàng)下方法測(cè)定,結(jié)果各成分峰面積RSD均小于2.0%,表明本法的中間精密度較好。

      2.8.3 雜質(zhì)回收試驗(yàn)與重復(fù)性 稱取9 份拉莫三嗪片細(xì)粉(約相當(dāng)于拉莫三嗪20 mg),置50 mL量瓶中,加適量稀釋液溶解,再分別加每1 mL含雜質(zhì)B 約 0.8 μg,雜質(zhì)C 約2 μg 的對(duì)照品溶液1、2、3 mL(相當(dāng)于雜質(zhì)對(duì)照品溶液濃度的50%、100%、150%),各3 份,加入稀釋液稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),計(jì)算回收率并考察方法的重復(fù)性,結(jié)果各已知雜質(zhì)回收率均滿足0.1%雜質(zhì)限度的回收率范圍(90%~108%),回收率及重復(fù)性RSD均在5%以內(nèi),說明該方法的準(zhǔn)確度及重復(fù)性較好。

      2.9 耐用性試驗(yàn)

      2.9.1 相對(duì)保留時(shí)間耐用性 取每1 mL 含雜質(zhì)B約0.8 μg、雜質(zhì)C 約2 μg、雜質(zhì)E 0.4 μg 的對(duì)照品溶液,對(duì)流動(dòng)相比例、柱溫、流速、鹽濃度、pH 值、色譜柱進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,考察方法的耐用性。結(jié)果表明主峰和各雜質(zhì)峰均能達(dá)到良好的分離效果;雜質(zhì)C 的相對(duì)保留時(shí)間主要受流動(dòng)相的比例、柱溫、流動(dòng)相pH 值的影響,雜質(zhì)B 的相對(duì)保留時(shí)間受的影響均較少。從耐用性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)看,雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 的相對(duì)保留時(shí)間均較穩(wěn)定,結(jié)果見表4。

      表4 耐用性試驗(yàn)結(jié)果匯總Tab 4 Summary of durability test

      2.9.2 校正因子重現(xiàn)性 在確定好雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C相對(duì)保留時(shí)間的基礎(chǔ)上進(jìn)行了校正因子的研究。對(duì)比了3 個(gè)實(shí)驗(yàn)室的方法學(xué)驗(yàn)證與校正因子復(fù)核數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)在擬定的液相色譜條件下,流動(dòng)相種類和初始比例、檢測(cè)波長(zhǎng)、鹽濃度、經(jīng)系統(tǒng)適應(yīng)性溶液驗(yàn)證后的儀器狀態(tài)和色譜柱對(duì)校正因子的賦值沒有明顯影響,該方法的校正因子重現(xiàn)性主要受流動(dòng)相pH 值以及實(shí)驗(yàn)員稱量對(duì)照品的細(xì)微偏差的影響,但各實(shí)驗(yàn)室計(jì)算所得的校正因子數(shù)值均未高于本方法擬定的值,數(shù)據(jù)顯示雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 校正因子在流動(dòng)相pH 值4.45 ~4.55 內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

      2.10 有關(guān)物質(zhì)的檢查

      照“2.1”項(xiàng)下方法,對(duì)3 批拉莫三嗪片長(zhǎng)期穩(wěn)定性(22 個(gè)月)考察樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定,按“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液、對(duì)照溶液、空白溶液進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算各雜質(zhì)的含量、其他單個(gè)雜質(zhì)的含量和雜質(zhì)總量。結(jié)果3 批樣品的雜質(zhì)檢查均符合規(guī)定,見表5。

      表5 拉莫三嗪片中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果(%,校正因子法)Tab 5 Determination of related substances in lamotrigine tablets(%,calibration factor method)

      3 討論

      3.1 流動(dòng)相pH 值的考察

      前期研究中發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇-0.5%三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.0 ~5.0)時(shí),拉莫三嗪與雜質(zhì)B 分離度隨流動(dòng)相pH 值增加而增大,流動(dòng)相調(diào)節(jié)pH 值至4.2 ~5.0 時(shí)拉莫三嗪與雜質(zhì)B的分離度在5.61 ~13.08,本文選擇pH 4.5 作為本方法流動(dòng)相pH 值,能有效分離拉莫三嗪主峰與雜質(zhì)B,且該pH 值條件下色譜柱的耐受性較好。

      3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察

      通過對(duì)氧化降解樣品進(jìn)行DAD 全波長(zhǎng)掃描,發(fā)現(xiàn)在230 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)的雜質(zhì)個(gè)數(shù)較多且基線平穩(wěn),結(jié)合各已知雜質(zhì)的紫外掃描圖,優(yōu)選230 nm 作為本品有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

      3.3 破壞試驗(yàn)方法的考察

      拉莫三嗪在常規(guī)的高溫、光照條件下,未見明顯的雜質(zhì)產(chǎn)生,說明拉莫三嗪在常規(guī)環(huán)境中相對(duì)較穩(wěn)定。拉莫三嗪在加酸或堿的同時(shí)置90℃水浴中高溫破壞,能生成雜質(zhì)C 和少量的雜質(zhì)E,氧化降解雖然能夠同時(shí)產(chǎn)生雜質(zhì)C、雜質(zhì)B和少量的雜質(zhì)E,但產(chǎn)生雜質(zhì)C、雜質(zhì)B 的量較少且氧化降解的產(chǎn)物復(fù)雜。本研究中以拉莫三嗪10 mg 加6 mol·L-1NaOH 溶液1 ~5 mL 置90 ℃水浴30 ~90 min 降解產(chǎn)生雜質(zhì)C,放冷后用6 mol·L-1HCl 溶液中和,并加雜質(zhì)B 對(duì)照品溶液的方法來制備系統(tǒng)適用性溶液,從而節(jié)省了從國(guó)外購(gòu)買雜質(zhì)C 的時(shí)間和成本。該系統(tǒng)適用性溶液可用于雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 相對(duì)保留時(shí)間的驗(yàn)證,進(jìn)而用于拉莫三嗪原料藥和制劑的有關(guān)物質(zhì)分析。黃諾哲等[7]取拉莫三嗪加30%過氧化氫溶液3 mL 在80 ℃水浴15 min,色譜圖顯示可能氧化降解產(chǎn)生了少量的雜質(zhì)D,本研究取拉莫三嗪加30%過氧化氫溶液1 mL 在90 ℃水浴1 h,在約49 min 雜質(zhì)D 出峰處未見明顯出峰或低于檢測(cè)限,而在約37 min 處檢出了少量的雜質(zhì)E。本研究與文獻(xiàn)報(bào)道不同[7],可能是由于氧化降解試驗(yàn)方法或者液相色譜檢測(cè)方法不同引起的。

      3.4 雜質(zhì)含量的限定

      拉莫三嗪片長(zhǎng)期穩(wěn)定性樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示雜質(zhì)C 有增長(zhǎng)趨勢(shì),從0 個(gè)月時(shí)的未檢出到22 個(gè)月時(shí)檢出0.01%,但未檢出雜質(zhì)E,最大單雜0.05%,總雜質(zhì)0.06%,均符合企業(yè)制訂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外藥典標(biāo)準(zhǔn),即雜質(zhì)B(相對(duì)保留時(shí)間約0.8)按校正后的峰面積計(jì)算(乘以校正因子2.7),不得大于對(duì)照溶液主峰面積(0.2%);雜質(zhì)C(相對(duì)保留時(shí)間約1.7)按校正后的峰面積計(jì)算(乘以校正因子1.4),不得大于對(duì)照溶液主峰面積的2.5 倍(0.5%);其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積(0.2%);各雜質(zhì)峰面積的和按校正后的峰面積計(jì)算不得大于對(duì)照溶液主峰面積的3.75 倍(0.75%)。

      3.5 本研究的不足

      本試驗(yàn)中氧化降解還產(chǎn)生了4 個(gè)未知雜質(zhì),文獻(xiàn)報(bào)道[7]氧化降解未知雜質(zhì),可能是3,5-二氨基-6-(2,3-二氯苯基)-2-氧基-1,2,4-三嗪或3,5-二氨基-6-(2,3-二氯苯基)-4-氧基-1,2,4-三嗪。本方法分離檢測(cè)到的4 個(gè)未知氧化降解雜質(zhì)有待進(jìn)一步的LC-MS/MS 結(jié)構(gòu)確證。拉莫三嗪雖然在60 ℃以內(nèi)的條件下仍較穩(wěn)定[7],但在加強(qiáng)酸或強(qiáng)堿或30%雙氧水情況下并90 ℃水浴破壞試驗(yàn)中,可產(chǎn)生少量的雜質(zhì)E,考慮到該雜質(zhì)有降解途徑,后續(xù)將對(duì)雜質(zhì)E 進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂的研究。此外,基于企業(yè)生產(chǎn)檢驗(yàn)實(shí)際考慮,本研究未對(duì)影響雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 相對(duì)保留時(shí)間和校正因子的流動(dòng)相比例、柱溫、流動(dòng)相pH 值進(jìn)行更廣泛、更深入的耐用性與驗(yàn)證研究。

      3.6 小結(jié)

      綜上所述,本方法專屬性強(qiáng),能有效分離和檢測(cè)樣品中可能的工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì),采用相對(duì)保留時(shí)間和校正因子來定量相關(guān)雜質(zhì),可應(yīng)用于拉莫三嗪片和拉莫三嗪原料藥中有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制。

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