肺吸入制劑非臨床藥代動力學研究的一般策略

陳美玲，黃亞軍，姜德建，王小青（湖南省藥物安全評價研究中心，新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室，湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司，長沙 410331）

肺部給藥也稱吸入給藥，是指運用特殊的裝置，將藥物通過呼吸運輸至肺部，發(fā)揮局部或全身作用的一種給藥方式[1-2]。與其他給藥途徑比較，因肺泡表面積大，膜通透性高，肺部酶活性低，肺吸入制劑藥代動力學（pharmacokinetic，PK）具有以下特征：① 藥物吸收迅速，無肝臟首過效應；② 藥物在非靶器官的分布較低，可減少或避免藥物對機體的毒副反應[3-7]。近年來，隨著肺吸入制劑的快速發(fā)展，針對肺吸入制劑PK 研究的評價方法和手段也有了長足的進步。本文結合目前國內外相關研究進展，對肺吸入制劑非臨床PK 研究的一般策略進行綜述，為肺吸入制劑的研究開發(fā)提供支持。

1 肺吸入制劑非臨床PK 研究的一般考慮

常用的肺吸入制劑主要包括定量吸入劑、干粉吸入劑、霧化吸入劑等[8-9]。定量吸入劑又稱氣霧劑，是指將藥物與拋射劑裝于耐壓密閉容器中，借拋射劑將內容物噴出使用的制劑；干粉吸入劑又稱粉霧劑，是指將藥物或與載體的混合物置于吸入裝置內，通過患者自主吸入的一種制劑；霧化吸入劑又稱噴霧劑，是指將藥物或與輔料置于特制裝置中，借助手動泵壓力、高壓氣體或超聲振動將內容物釋出使用的制劑。

與常規(guī)制劑不同的是，肺吸入制劑進入循環(huán)系統(tǒng)主要有兩條途徑：第一條為部分藥物經肺部吸入后，經過黏液層、上皮細胞、基底膜、間質組織吸收入血；第二條為其余部分藥物沉積于口腔，通過吞咽至胃腸道吸收入血。藥物在肺部吸收的方式包括被動擴散、主動轉運、細胞旁路轉運、淋巴細胞吞噬等，一般來說，藥物霧化后的粒徑大小和理化性質對吸收方式及吸收部位有較大影響，如脂溶性較大的藥物吸收方式主要為被動擴散[10-11]。

對于治療肺部疾病的肺吸入制劑，其有效性主要取決于沉積在肺部的藥物量，而其安全性需要考慮兩個方面，包括局部安全性和全身安全性。由于肺部藥物代謝與肝腸代謝存在較大差異，肺部酶活性普遍較低，且表達模式也不同，因此需要特別關注藥物在肺部代謝物的暴露量、藥物間的相互作用、以及藥物是否可被肺部代謝酶活化等，以更好地評估其治療效果或毒性反應。

2 肺吸入制劑非臨床PK 研究的關注點

2.1 動物種屬的選擇

肺吸入制劑的非臨床PK 研究一般采用健康、成年的動物進行。在考慮與人體PK 性質相關性的前提下，盡可能選擇與毒理學和藥效學研究相同的動物。創(chuàng)新性藥物應選用兩種或兩種以上的動物，其中一種為嚙齒類動物，另一種為非嚙齒類動物。其他藥物，可選用一種動物，建議首選非嚙齒類動物。大鼠是肺吸入制劑非臨床PK 研究中最常用的動物，尤其在研發(fā)初期，可用于候選藥物的篩選、劑量設計等。例如，孫杰等[12]利用大鼠考察吸入與注射給予妥布霉素后體內藥物的分布情況及毒性反應。非人靈長類動物（如食蟹猴）因其與人類在免疫學和解剖學上的相似性，也被用于開展一些特殊吸入制劑（如生物大分子）的非臨床PK 研究。有研究顯示，與嚙齒類動物相比，獼猴吸入給予西妥昔單抗時生物利用度更低[12-13]。此外，小鼠、兔等實驗動物也可用于肺吸入制劑的非臨床PK 研究。

2.2 給藥準確性的監(jiān)測

為了確保在吸入給藥時遞送藥物的準確性，在給藥期間需對藥物遞送劑量、遞送均一性和穩(wěn)定性及空氣動力學粒徑分布進行監(jiān)測[14-20]。在非臨床研究階段，通常在正式給藥前需對霧化生成方法及含量檢測方法進行考察和驗證。

2.2.1 遞送劑量的監(jiān)測[21-24]肺吸入制劑的非臨床PK 研究通常采用吸入染毒暴露系統(tǒng)進行。對吸入染毒系統(tǒng)進行參數設定，調整氣溶膠流量及稀釋氣流量，可霧化產生不同濃度的藥物顆粒。通過采樣瓶或合適的濾膜采集一定時間內任意霧化通道霧化后的氣溶膠顆粒（一般連續(xù)多次采集）并通過高效液相色譜儀等方法檢測采樣瓶或濾膜中的藥物濃度，換算成氣溶膠中的藥物濃度，即可獲得一定霧化時間內的藥物劑量。對于液體制劑（氣霧劑和噴霧劑），通常采用高效液相色譜法、氣相色譜法等方法檢測有效成分的含量。對于無揮發(fā)性的單一化合物，可采用稱重法進行氣溶膠濃度的檢測。經濟合作與發(fā)展組織（OECD）對液體和固體型氣溶膠濃度的允許偏差為±20%[13]。

2.2.2 遞送穩(wěn)定性和均一性的考察 肺吸入制劑在吸入染毒系統(tǒng)持續(xù)霧化一定時間后，通過間斷采樣和檢測，可考察持續(xù)霧化的穩(wěn)定性。通過對霧化通道進行分通道采樣，采集多個通道的樣品進行檢測，可考察各霧化通道間的均一性。對于多層的小動物單濃度口鼻動態(tài)暴露吸入染毒系統(tǒng)，還需對各層霧化通道進行分通道采樣和檢測，以考察各層霧化通道間的均一性。霧化后各時間點和各通道的藥物濃度均應在目標濃度的±20%范圍內。

2.2.3 空氣動力學粒徑分布的監(jiān)測 氣溶膠中藥物顆粒的粒徑分布是影響藥物在呼吸道和肺部沉積的關鍵參數，因此，空氣動力學粒徑分布是給藥過程中質量控制的重要指標之一。測試方法主要有碰撞法、激光衍射法和飛行時間粒徑分析法，前兩種方法較為常用[25]。臨床上，FDA 建議采用至少兩種原理的檢測方法進行空氣動力學粒徑分布的研究，且其中一種必須采用多級碰撞法。碰撞法是目前吸入制劑體外粒度分析最經典的方法，也是美國和歐洲藥典評價吸入制劑體外粒度分布推薦使用的方法。比如《中國藥典》收載的雙層液體碰撞器，美國、歐洲藥典收載的Andersen 多級撞擊器、Marple miler 多級撞擊器等。近年來，新一代多級慣性碰撞器使用普遍，質量中值空氣動力學直徑和標準偏差等常用來作為評價參數。

2.3 體內暴露量的檢測

生物樣品的分析方法包括色譜法、免疫學法、放射性同位素標記法和微生物學方法等。其中色譜法包括高效液相色譜法、氣相色譜法和色譜-質譜聯用法；免疫學法包括放射免疫分析法、熒光免疫分析法、酶免疫分析法等。由于生物樣本藥物濃度低、樣品量少、內源性物質干擾多且個體差異大，應根據藥物的性質、生物樣品中藥物的濃度選擇不同的檢測方法。

進行組織分布研究時，除采集心、肝、脾、腎、腦等主要組織器官外，還需關注呼吸系統(tǒng)組織器官如鼻咽（含鼻甲）、喉部（含會厭）、主氣管、支氣管、肺臟及肺灌洗液中藥物的分布。胡文晉等[26]在研究霧化吸入羥基喜樹堿后藥物在肺癌小鼠中的組織分布中發(fā)現，肝臟、心臟、腎臟在給藥30 min 后總堿藥物達到峰值，其中肝內濃度最高，而腎和心的總堿分別占肝內峰濃度的33.8%和74.2%。

在血漿PK 和組織分布的研究中也會廣泛運用到微透析技術，不僅可以減少實驗動物的剖殺，而且微透析的樣品無需勻漿，樣品中不含大分子物質，無需前處理，可極大地節(jié)約時間成本[27-28]。例如，任亞超[28]在鹽酸氨溴索干粉吸入劑的研究中利用微透析技術得出鹽酸氨溴索干粉吸入劑能被運輸到靶部位，與靜脈給藥相比，可達到更高的局部活性、持續(xù)更長的時間。

在進行藥動學參數計算時，因為吸入制劑給藥途徑特殊，需先按實驗動物體質量計算每分鐘通氣量RMV＝0.608m0.852（m是實驗動物的體質量，單位為kg），再計算實際給藥劑量D＝（給藥時長×氣溶膠中藥物濃度×通氣量×IF）/平均體質量（IF為可吸入顆粒的百分數，當氣溶膠中有90%以上的顆粒粒徑小于7 μm 時，IF＝1），最后用實際給藥劑量計算藥動學參數[29]。常見藥動學參數詳見表1。

表1 常見藥動學參數匯總

3 體外PK 研究方法的應用

整體動物PK 研究固然能較為全面、系統(tǒng)地對肺吸入制劑進行評價，但其需要配套的動物設施設備、吸入染毒系統(tǒng)，且費時費力。在研發(fā)早期或因條件受限，無法開展系統(tǒng)的非臨床PK 研究的情況下，研究者們也會運用體外方法進行研究。

3.1 離體臟器的應用

在研究相關機制時，更多地會采用動物離體臟器。例如，Eriksson 等[30]利用大鼠離體肺單向灌注模型（IPRL）研究沙丁胺醇、沙美特羅等十余種藥物的離體滲透性，采用計算機模擬技術建立生理吸收模型，并與體外細胞模型結合，經校正后用于預測藥物肺部吸收。此外，在研究藥物肺部滲透能力時，也會用到蟾蜍。例如，Chen等[31]利用離體蟾蜍肺構建給藥池-肺-接收池模型，研究脂質體的滲透能力。

3.2 酶系的應用

肺部藥物代謝酶主要分布在Ⅱ型細胞中，種類齊全，含量低，主要是細胞色素P450（CYP），其大部分位于Clara 細胞的內質網上，且具有底物特異性[32]。肺部藥物代謝與肝腸代謝存在較大差異，肺部酶活性普遍較低，且表達模式也不同。肺部常見的CYP 酶為CYP1B1、CYP2B6、CYP2E1、CYP2J2、CYP3A5 和CYP1A1，而肝臟中常見的CYP 酶為CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6與CYP3A4。比如，CYP3A4 在肝臟中活性最高，而在肺組織較低。同時，因為肺部的代謝能力低，局部代謝產物難清除，新藥研究過程中需關注肺部局部代謝物之間的毒性風險和相互作用，如可利用肺S9 篩選候選藥物。肺部代謝酶還可活化部分藥物，使其治療效果更佳，如肺部酯酶可將丙酸倍氯米松代謝為更有效的17-倍氯米松單丙酸酯[33]。

3.3 細胞學的應用

Calu-3 細胞是一種非小細胞肺癌細胞，經培養(yǎng)可形成極化的單層細胞，細胞與細胞之間形成緊密連接，具有分泌黏液和表達囊性纖維化跨膜轉導調節(jié)因子、各種離子通道等功能，無論是形態(tài)學還是功能上都與人體呼吸道上皮細胞類似。因此，Calu-3 細胞成為篩選肺吸入制劑的強大工具。肺癌細胞，如A549 細胞，既可作為抗腫瘤藥物的靶細胞用于肺吸入制劑的藥效學研究，又因其無限增殖、性狀穩(wěn)定等特點而被廣泛用于細胞藥物PK 研究。細胞模型的廣泛應用，對肺吸入藥物的作用機制、吸收轉運途徑、大分子藥物的吸入有效性及細胞毒性等研究提供了較大便利[34-35]。

4 結語

非臨床PK 研究在藥物研發(fā)早期的有效性和安全性評價中有著舉足輕重的作用，對于肺吸入制劑這種特殊的給藥劑型，盡早開展PK 研究尤為重要。在歐盟，大多數的肺吸入制劑均以PK研究為基礎而獲批[36]。在涉及到前藥或改變給藥途徑的前藥時，需特別關注前藥是否可以在呼吸系統(tǒng)轉化成原藥；在進行組織分布研究時，除常規(guī)的主要臟器外，還需重點關注呼吸系統(tǒng)組織器官如鼻咽（含鼻甲）、喉部（含會厭）、主氣管、支氣管、肺臟及肺灌洗液中的藥物分布；在進行代謝研究時，需關注藥物是否被肺部藥物代謝酶所代謝，從而影響其生物利用度，并為代謝產物及其途徑的鑒定設計提供參數。