朱永興，關(guān)雅靜，李 新，張春義

（1寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，銀川750002；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081）

0 引言

土壤鹽漬化是一個(gè)世界性的資源和生態(tài)難題，嚴(yán)重制約著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和進(jìn)步。中國存在有鹽堿地面積為3.6×107hm2，其中，具有可以利用潛力的鹽漬土面積約1.3×107hm2，約占總耕地面積的10%[1-2]，這是中國開發(fā)利用鹽堿荒地的主要資源。玉米是中度鹽敏感作物，突然鹽漬化嚴(yán)重制約了玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，缺乏耐鹽品種是目前嚴(yán)重制約玉米產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問題[3]。在加強(qiáng)鹽堿地土壤改良的同時(shí)，挖掘作物本身的耐鹽能力，篩選耐鹽品種是加快利用鹽堿土壤最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑。因此，開展玉米品種的耐鹽性綜合評(píng)價(jià)和耐鹽品種篩選，對(duì)于鹽堿地高產(chǎn)栽培及抗性品種選育具有重要意義。

鹽脅迫是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的主要非生物脅迫之一，是一種多形態(tài)脅迫，通過滲透脅迫、營養(yǎng)脅迫和離子毒害三種途徑來降低作物產(chǎn)量甚至導(dǎo)致植物死亡[4]。滲透脅迫和離子效應(yīng)是鹽脅迫對(duì)植物體傷害的兩個(gè)主要方面。鹽脅迫下植物通過液泡中積累無機(jī)鹽離子進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，以葉片中積累的Na+、K+、Cl-起主要作用。有研究表明，植物體內(nèi)因過度積累鈉離子而減少了對(duì)鉀離子、鈣離子等的吸收，致使生殖生長和營養(yǎng)生長不良，進(jìn)而導(dǎo)致作物死亡[5-7]。丁順華[8]認(rèn)為小麥苗期受NaCl脅迫后，地上部和根部Na+含量都增加；王煥文等[9]認(rèn)為鹽敏感小麥植株內(nèi)的Na+、Cl-積累量較耐鹽小麥品種的增加量不顯著；韓金龍等[10]認(rèn)為玉米受到鹽脅迫時(shí)，隨著NaCl濃度的增加，葉片和根中Na+、K+升高，且根中的Na+、K+高于葉片中；高雪等[11]認(rèn)為，青儲(chǔ)玉米在鹽環(huán)境下，與對(duì)照相比，在鹽脅迫下，甜高粱根系、葉片K+含量降低，青貯玉米根系、莖基K+含量降低。研究也表明，植物為了應(yīng)對(duì)鹽脅迫，會(huì)保持低的Na+水平以及正常的K+：Na+比，從而提高其耐鹽水平[12-13]。盡管目前有關(guān)植物耐鹽的分子機(jī)理還不完全清楚，但是一些有關(guān)的調(diào)控因子也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。目前研究表明，植物體內(nèi)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要在液泡膜或者其他細(xì)胞器膜上表達(dá)，當(dāng)植物受到鹽脅迫時(shí)該類蛋白可以將Na+局域化在液泡內(nèi)從而維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)AtNHX1就是典型的液泡膜型的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在其他物種中也克隆到了該基因的同源基因[14-15]。在玉米中，研究表明，不同的玉米自交系也表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫的不同的響應(yīng)，也說明玉米的耐鹽機(jī)理比較復(fù)雜玉米Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZmNHX1是液泡膜型的[16-17]，當(dāng)玉米受到鹽脅迫時(shí)，根中的ZmNHX1基因表達(dá)量上調(diào)，提高玉米的耐鹽性[18]。張凌霄等[19]分離了ZmNHX7，它編碼一個(gè)玉米質(zhì)膜陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在緩解Li+對(duì)植物的毒害和維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡等方面發(fā)揮重要作用。然而，對(duì)于玉米幼苗期離子響應(yīng)的機(jī)理還知之甚少。

鑒于此，本研究以4份玉米自交系為研究對(duì)象，在高鹽脅迫下，對(duì)玉米自交系根部和地上部的Na+、K+、Ca2+進(jìn)行了測定分析，并對(duì)K+:Na+、Ca2+:Na+進(jìn)行了分析，以此為基礎(chǔ)，借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)，初步探索玉米耐鹽生理以及調(diào)節(jié)機(jī)制，為選育耐鹽新品種提供理論支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用的玉米(Zea mays L.)自交系均為本實(shí)驗(yàn)室保存，挑選籽粒飽滿、大小均勻種子用于本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)操作。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 離子測定 挑選籽粒飽滿的玉米自交系S420、S487、S388、B73的種子，用蒸餾水浸泡一天，去除不飽滿的種子，播種于裝滿營養(yǎng)土（草炭土和蛭石3:1）的營養(yǎng)缽中（高12 cm，口徑12 cm），每個(gè)材料種植6盆，其中3盆澆水作為對(duì)照，另外3盆澆灌200 mmol/L NaCl進(jìn)行脅迫，置于光照強(qiáng)度3000～5000 Lx，光照時(shí)間16 h/8 h，溫度20℃～25℃條件下進(jìn)行種子萌發(fā)。14天后選取長勢一致的材料，取其地上、地下部分進(jìn)行Na+、K+、Ca2+進(jìn)行測定，并地上、地下K+:Na+、Ca2+:Na+進(jìn)行了分析；

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測定 以S420、S388為研究對(duì)象，處理方法與離子測定相同，鹽脅迫14天后，選取長勢一致株系，取相同部位的葉片進(jìn)行提取RNA，進(jìn)行RNA-seq。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3 測定方法

玉米地上、地下部分的Na+、K+、Ca2+測定運(yùn)用火焰光度計(jì)進(jìn)行，具體方法參照[20]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

各樣本Na+、K+、Ca2+之間的相關(guān)性分析運(yùn)用DPS7.05進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下Na+含量變化研究

本研究中4份玉米自交系，在200 mmol/L NaCl溶液脅迫21天后，取其葉片、根進(jìn)行Na+含量的測定，并對(duì)葉片、根中Na+含量在鹽脅迫前后的累積量進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示：鹽脅迫后，4個(gè)材料葉片中Na+含量都不同程度的升高，其中最高的是S388，其次是S420、B73，最低的是S487，鹽脅迫后葉片中Na+含量S388與S487呈顯著性差異（圖1A）；鹽脅迫后根中Na+含量也表現(xiàn)出增加的趨勢，其中根中Na+含量最高的是S420，其次是B73、S487，最低的是S388，根中Na+含量S420與S487、S388呈顯著性差異，而S487、S388的Na+含量沒有顯著性差異（圖1B）；4個(gè)材料鹽脅迫前后葉片和根部的Na+含量的累積量也存在明顯差異，鹽脅迫前后葉片中Na+的累積量最高的是B73，其次是S487、NX420，最低的是S388，而根中Na+的累積量最高的是S420、B73，其次是S388、S487（圖1C），這說明S388、S487的根部相對(duì)于S420、B73積累了較少的Na+。

圖1 玉米自交系鹽脅迫下Na+含量變化研究

2.2 鹽脅迫下Ca2+含量變化研究

本研究中4份玉米自交系，在200 mmol/L NaCl溶液脅迫14天后，取其葉片、根進(jìn)行Ca2+含量的測定，并對(duì)葉片中Ca2+含量在鹽脅迫前后的累積量進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示：鹽脅迫后，4個(gè)材料葉片中Ca2+含量都不同程度的降低，其中最低的是S388，其次是S420、S487、B73，鹽脅迫后葉片中Ca2+含量S388與S420呈顯著性差異（圖2A）；鹽脅迫后根中Ca2+含量也表現(xiàn)出降低的趨勢，其中根中Ca2+含量最高的是S420，其次是S388、B73，最低的是 S487，根中 Ca2+含量 S420 與S487、S388呈顯著性差異，而S487、S388、B73的Ca2+含量沒有顯著性差（圖2B）異；4個(gè)材料鹽脅迫前后葉片和根部的Ca2+的減少量也存在明顯差異，鹽脅迫前后葉片中Ca2+的減少量最多的是S388，其次是S487、B73，減少最少的是S420，而根中Ca2+的減少量最高的是 S420，其次是 S388、B73，減少最低的是 S487（圖2C）。

圖2 玉米自交系鹽脅迫下Ca2+含量變化研究

2.3 鹽脅迫下K+含量變化研究

本研究中4份玉米自交系，在200 mmol/L NaCl溶液脅迫21天后，取其葉片、根進(jìn)行K+含量的測定，并對(duì)葉片中K+含量在鹽脅迫前后的累積量進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示：鹽脅迫后，4個(gè)材料葉片中K+含量都不同程度的降低，鹽脅迫后葉片中K+含量4個(gè)材料沒有存在顯著性差異（圖3A）；鹽脅迫后根中K+含量也表現(xiàn)出降低的趨勢，其中根中K+含量降低最高的是B73，其次是S487、S388、S420，根中 K+含量 B73 與 S487、S388、S420呈顯著性差異，而S487、S388、S420的K+含量沒有顯著性差異（圖3B）；4個(gè)材料鹽脅迫前后葉片和根部的K+含量的減少量也存在明顯差異，鹽脅迫前后葉片中K+的含量減少最多的是S420，其次是S487、S388、B73，而根中K+的減少量最高的S388，其次是S420、B73、S487，但它們之間沒有存在顯著性差異（圖3C）。

圖3 玉米自交系鹽脅迫下K+含量變化研究

2.4 鹽脅迫下Na+：K+的變化研究

4份玉米自交系，在200 mmol/L NaCl溶液脅迫14天后，取其葉片、根進(jìn)行Na+、K+含量的測定，并進(jìn)行了K+:Na+比值分析，結(jié)果顯示：4個(gè)材料鹽脅迫后葉片中Na+:K+比最高的是S388、S420，其次是S487、B73，相關(guān)性分析顯示4個(gè)材料葉片的K+:Na+比不存在顯著性差異；而根中K+:Na+比最高的是S487、B73，其次是S388、S420，結(jié)果也顯示，S420根中K+:Na+比與S388、S487、B73呈顯著性差異（圖4）。

圖4 玉米自交系鹽脅迫下K+：Na+比的變化研究

2.5 鹽脅迫下Ca2+：Na+比的變化研究

4份玉米自交系，在200 mmol/L NaCl溶液脅迫14天后，取其葉片、根進(jìn)行Na+、Ca2+含量的測定，并進(jìn)行了Ca2+:Na+比值分析，結(jié)果顯示：4個(gè)材料鹽脅迫后葉片中 Ca2+:Na+比最高的是 S388，其次是 S487、S420、B73，并且S388葉中Ca2+:Na+比與其他3個(gè)自交系呈顯著性相關(guān)；而根中Ca2+:Na+比最高的是S388，其次是S420、S487、B73，相關(guān)性分析顯示沒表現(xiàn)出顯著性差異（圖5）。

圖5 玉米自交系鹽脅迫下Ca2+：Na+比的變化研究

2.6 鹽脅迫下玉米自交系的轉(zhuǎn)錄組分析

以S388、S420為研究對(duì)象，選取籽粒飽滿的種子播種于營養(yǎng)缽中（營養(yǎng)土:蛭石=3:1），每個(gè)營養(yǎng)缽播種8粒，每6個(gè)營養(yǎng)缽放置于一個(gè)托盤中，每個(gè)材料種植6盆，置于一個(gè)托盤中，然后在每個(gè)托盤中加入2 L 200 mmol/L NaCl溶液，并以同樣的方式種植，澆灌2 L淡水，作為對(duì)照(CK)，每隔7天每個(gè)托盤澆1 L淡水，保持足夠的生長所需的水分。14天后分別挑選處理組、對(duì)照組長勢一致的株系，取同一部位葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，進(jìn)行3次重復(fù)。結(jié)果顯示：GO分析顯示可以發(fā)現(xiàn)2個(gè)材料差異基因參與到了離子轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、逆境信號(hào)以及離子跨膜運(yùn)輸。VENE分析顯示，2個(gè)材料在鹽脅迫下240個(gè)基因共表達(dá)，其中S388有6254個(gè)基因表達(dá)，而S420為880個(gè)基因表達(dá)，這對(duì)今后候選基因的確定提供了重要的保障（圖6）。

圖6 玉米自交系轉(zhuǎn)錄組分析

3 討論

玉米作為一個(gè)中度鹽敏感作物，當(dāng)植物遭受鹽脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生兩種脅迫階段，一是滲透調(diào)節(jié)，另一種是離子毒害[21]。由于種間差異，耐鹽種質(zhì)會(huì)產(chǎn)生不同的應(yīng)對(duì)鹽脅迫的調(diào)控機(jī)制，會(huì)將進(jìn)入植物體內(nèi)的Na+排出體外或者區(qū)隔化到液泡里，從而保持體內(nèi)的離子平衡[22]。本試驗(yàn)中4份玉米自交系在200 mmol/L NaCl溶液脅迫14天后，通過對(duì)根部及地上部進(jìn)行Na+、K+、Ca2+測定分析，結(jié)果顯示：4個(gè)自交系中葉片和根中Na+累積量最少的是S388，而其體內(nèi)K+、Ca2+也發(fā)生了比較明顯的變化，F(xiàn)ricke等[23]研究表明，當(dāng)植物受到鹽脅迫時(shí)，其體內(nèi)Na+會(huì)明顯增多，從而影響營養(yǎng)元素的吸收，會(huì)表現(xiàn)出鹽敏感的表型，S388在鹽脅迫前后Na+的累積量最少，說明其具有明顯的抗鹽表型，這與前人的研究基本一致。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，S388的Ca2+:Na+比在4個(gè)材料中表現(xiàn)出最高，這也說明S388的耐鹽機(jī)理是否參與到鈣代謝通路中[24]。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，S388相對(duì)于S420參與了離子轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、逆境信號(hào)以及離子跨膜運(yùn)輸?shù)却x途徑，從離子測定的結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，當(dāng)然僅目前的數(shù)據(jù)還不足以完全證明這一點(diǎn)，還需要進(jìn)一步更深入的進(jìn)行研究證明，為后續(xù)的育種提供更多的證據(jù)和資源。

4 結(jié)論

玉米作為重要的農(nóng)業(yè)及經(jīng)濟(jì)作物，在西北乃至全國占有非常重要的地位，而中國存在大量鹽堿荒地亟待開發(fā)利用，選育有利耐鹽玉米種質(zhì)是最有效的途徑，通過本研究的數(shù)據(jù)證明，4份玉米自交系中S388對(duì)鹽的耐受性最高，表型出葉片和根中積累了較少的Na+含量，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也顯示，S388在鹽脅迫下離子轉(zhuǎn)運(yùn)、逆境信號(hào)以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)代謝途徑，這為今后研究其耐鹽機(jī)理提供了更多的證據(jù)，也為培育耐鹽品種培育提供材料基礎(chǔ)。