姜雪雍，岳元春，孫養(yǎng)存，高冬妮，平文祥，葛菁萍

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150080；2微生物黑龍江省高校重點實驗室/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150500）

0 引言

刺激次生代謝產(chǎn)物生物合成的一種方法是用生物脅迫來挑戰(zhàn)給定的微生物，該脅迫可以通過與其他微生物共培養(yǎng)來實現(xiàn)[1]。共培養(yǎng)可以提高菌株活性，也可以在基礎(chǔ)水平上提高代謝物的產(chǎn)量[2]。然而在自然環(huán)境中，微生物在共培養(yǎng)狀態(tài)下的生態(tài)學(xué)關(guān)系繁雜多變，微生物之間的協(xié)同代謝、互惠共生、相互競爭、代謝物中的信號分子等的相互作用，都對共培養(yǎng)體系中目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量和新物質(zhì)的產(chǎn)生有影響[3]。在一定條件下，微生物共培養(yǎng)時的代謝活動會偏利于其中一方或二者互惠共生，從而提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量[4]。以乳酸菌和芽孢桿菌的共培養(yǎng)來說，分泌細(xì)菌素和產(chǎn)生芽孢都是爭奪營養(yǎng)及空間的有效方式[5-6]，乳酸菌和芽孢桿菌種類的不同、共培養(yǎng)中菌群密度的改變，在某種程度上會影響二者的生態(tài)關(guān)系[6-7]。研究證明，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BN會促進(jìn)乳酸桿菌的生長，二者共培養(yǎng)具有互利共生的關(guān)系[8]。當(dāng)納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌的接種比例為1:2時，關(guān)系為偏利共生，代謝產(chǎn)物納豆激酶(NK)活力及吡咯喹啉醌(PQQ)含量得到顯著提升[9]。將蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)NVH 45與干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)2756進(jìn)行共培養(yǎng)時，B.cereus的生長被抑制并且無芽孢形成，體現(xiàn)對其偏害的生態(tài)關(guān)系，但與嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)NCFB 1748共培養(yǎng)時B.cereus僅略有減少并有芽孢形成，體現(xiàn)互利共生的生態(tài)關(guān)系，其中乳酸菌的接種量(107cfu/mL)遠(yuǎn)高于B.cereus(102cfu/mL)[10]。將青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)ATCC 15703與B.cereus ATCC 9634共培養(yǎng)，當(dāng)B.adolescentis的接種量遠(yuǎn)高于B.cereus時，B.adolescentis的生長速率遠(yuǎn)高于純培養(yǎng)對照，而B.cereus的菌數(shù)顯著下降，此時二者形成的是對B.adolescentis偏利而對B.cereus偏害的生態(tài)關(guān)系[11]。將保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)接入培養(yǎng)至48 h的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中，L.bulgaricus的生長受到抑制，在這種條件下是對L.bulgaricus偏害的生態(tài)關(guān)系，然而將同等比例的L.bulgaricus和B.subtilis同時接種，二者均可進(jìn)入穩(wěn)定生長期，并能提高代謝產(chǎn)物紅豆抗氧劑的濃度[12]。

副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)HD1.7可以產(chǎn)生細(xì)菌素Paracin1.7，其抑菌能力比Nisin更廣泛，具有抑菌譜廣等特點，是一種極具應(yīng)用潛力的天然防腐劑[13-14]。L.paracasei HD1.7與B.subtilis以1:1(%,v/v)的接種比例共培養(yǎng)時，B.subtilis能促進(jìn)L.paracasei HD1.7的生長、細(xì)菌素Paracin 1.7產(chǎn)量增加與群體感應(yīng)相關(guān)基因基因luxS、prcK和prcR的上調(diào)表達(dá)，然而L.paracasei HD1.7則抑制B.subtilis的生長、芽孢形成及芽孢形成相關(guān)基因spo0A、sigE、sigF和sigG的表達(dá)[15]。此條件下L.paracasei HD1.7對B.subtilis偏害，而B.subtilis對L.paracasei HD1.7偏利。為了促成B.subtilis與L.paracasei HD1.7協(xié)同合作的種間關(guān)系，以及確定芽孢桿菌屬微生物分泌的信號物質(zhì)對L.paracasei HD1.7產(chǎn)細(xì)菌素的促進(jìn)作用是否具有普遍性，本文旨在探究芽孢桿菌初始接種比例和種類的不同對于共培養(yǎng)體系中種間關(guān)系穩(wěn)定以及對L.paracasei HD1.7產(chǎn)細(xì)菌素的影響，通過提高芽孢桿菌的初始接種量，探究在此條件下二者的生態(tài)學(xué)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)HD1.7是從東北酸菜發(fā)酵液中分離得到的菌株[14]，用作實驗菌種。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(ATCC 11774)為共培養(yǎng)實驗菌種以及抑菌試驗指示菌，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)以及蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)為共培養(yǎng)實驗菌種，探究芽孢桿菌屬與L.paracasei HD1.7種間關(guān)系。以上菌種均保藏于黑龍江大學(xué)微生物重點實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS(De Man,Rogosa and Sharp)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸銨2 g，無水亞硫酸鈉0.1 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，無水乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 mL，補蒸餾水至1000 mL，pH 5.5，108℃高壓滅菌20 min，用于L.paracasei HD1.7的活化。在MRS固體培養(yǎng)基（含2%瓊脂的液體培養(yǎng)基）上培養(yǎng)48 h，得到菌落計數(shù)。

BP(Beef Extract Peptone)培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1000 mL，pH 7.0，121℃高壓滅菌15 min，作為芽孢桿菌屬的種子液培養(yǎng)基。在BP固體培養(yǎng)基（含2%瓊脂的液體培養(yǎng)基）上測定菌落數(shù)和芽孢數(shù)。在抑菌試驗中，使用BP半固體培養(yǎng)基（含0.75%瓊脂的液體培養(yǎng)基）為上層培養(yǎng)基，下層為水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂20 g，補蒸餾水至1000 mL，pH自然，121℃滅菌15 min。

CO培養(yǎng)基：酵母提取物10 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2.5 g，硫酸鎂0.2 g，1 mol/L硝酸鈣1 mL，0.1 mol/L氯化錳1 mL，1 mmol/L硫酸亞鐵1 mL，pH 6.5，加蒸餾水至 1000 mL，108℃滅菌 20 min，作為 L.paracasei HD1.7與芽孢桿菌屬共培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.1.3 擴增引物 熒光定量PCR試驗所用引物由Invitrogen技術(shù)有限公司合成，群體感應(yīng)相關(guān)基因引物序列：luxS-up：5′-ATGGCAAAAGTT GAAAGTTTCA C-3′和 luxS-down：5′-CTAGACAACCTGACGCGT GTACG-3′；prcK-up：5′-AAGATGGTATTTGGATGTC GGC-3′和 prcK-down，5′-GCTCGTCGTGATTCATTG GTG-3′；prcR-up：5′-AGGGATGTCAATGTCCAGC AG-3′和 prcR-down：5′-GCCGAAATCAAATTCACC ACTC-3′。芽孢形成相關(guān)基因引物序列：spo0A-up：5′-ATGGAAGTGATCGGCGTTGC-3′和 spo0A-down：5′-CTTCCTGCCCAAAGGCTGTC-3′；sigE-up：5′-CTGC TGATGAAACTTGGGCTG-3′和 sigE-down：5′-CGG GAGGCATAGGTAGCAAGC-3′；sigF-up：5′-CCAAA ATGGCGACCAGCAG-3′和 sigF-down：5′-CGCGC CGGATTTTGTTTC-3′；sigG-up：5′-CTTGTAAACG GGAACTTGCG-3′和 sigG-down：5′-CGGCTCCTTG CTTGTCTCAC-3′。

1.2 菌體及芽孢計數(shù)

取0.5 mL各發(fā)酵時期的L.paracasei HD1.7和B.subtilis接觸共培養(yǎng)的發(fā)酵液于4.5 mL無菌水中進(jìn)行梯度稀釋后，取0.1 mL涂布于BP及MRS固體培養(yǎng)基中，置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24 h（芽孢桿菌）和 48 h(L.paracasei HD1.7)，進(jìn)行菌落計數(shù)[16-17]。取不同時期發(fā)酵液1.5 mL置于2 mL離心管中，80℃水浴鍋中加熱20 min（確保將營養(yǎng)體全部殺死），稀釋涂布于BP固體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行芽孢計數(shù)。

1.3 細(xì)菌素Paracin 1.7粗制液的制備

將取得的發(fā)酵液樣品于12000 r/min、4℃離心10 min，去除沉淀并將上清液用0.22 μm細(xì)菌濾器進(jìn)行過濾除菌，所得的發(fā)酵上清液即為含有Paracin 1.7的粗制液[18-20]。使用杯碟法檢測發(fā)酵上清液的抑菌活性[21]，其中細(xì)菌素Paracin 1.7對指示菌B.subtilis抑菌圈直徑差值(x)與細(xì)菌素效價對數(shù)值(y)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)[22]。

1.4 共培養(yǎng)實驗

首先，將B.subtilis與L.paracasei HD1.7的初始接種比例調(diào)整為3:1、5:1和5:2(%)，分別接種于100 mL的CO培養(yǎng)基中，接觸性共培養(yǎng)60 h，37℃、160 r/min，每隔4 h進(jìn)行取樣，以接種量為1%和2%單培養(yǎng)的L.paracasei HD1.7以及3%和5%單培養(yǎng)的B.subtilis為對照，檢測各組分發(fā)酵液pH、活菌數(shù)、產(chǎn)芽孢數(shù)以及細(xì)菌素的抑菌活性，在發(fā)酵培養(yǎng)36 h時，采用qRT-RCR檢測L.paracasei HD1.7群體感應(yīng)相關(guān)基因luxS、prcK和prcR以及B.subtilis芽孢形成相關(guān)基因sigE，sigF，sigG和spo0A的基因表達(dá)差異情況。確定最佳的接種比例后，將該比例應(yīng)用于L.paracasei HD1.7與芽孢桿菌屬微生物的共培養(yǎng)中，進(jìn)而驗證二者在調(diào)整比例后的生態(tài)學(xué)關(guān)系。

1.5 熒光定量PCR檢測基因轉(zhuǎn)錄水平變化

使用RNA prep Pure細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取菌液RNA，通過Nanodrop 2000核算分析儀檢測RNA樣本的純度和濃度。利用BioRT cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以2種菌株單獨培養(yǎng)為對照組，共培養(yǎng)為實驗組，每組取適量cDNA作為模板，添加特異性引物、SYBR Solution/RealMasterMix和去離子水，擴增群體感應(yīng)相關(guān)基因luxS、prcK和prcR以及芽孢形成相關(guān)基因spo0A、sigE、sigF和sigG。獲得各樣品的CT值以相對定量2-△△CT法進(jìn)行分析，以內(nèi)參基因16S rRNA校正[23]。

1.6 試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS(StatisticalProductandService Solutions)軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以X±SD表示。采用T-TEST對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)P＜0.05為差異顯著，用*表示；當(dāng)P＜0.01為差異極顯著，用**表示。利用Canoco 5(version 5.0)進(jìn)行理化因子與微生物的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.subtilis接種率對共培養(yǎng)體系的影響

L.paracasei HD1.7單培養(yǎng)以及與B.subtilis共培養(yǎng)時，各組pH表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律，均在0～24 h呈現(xiàn)下降趨勢，24～60 h趨于平穩(wěn)，最后都達(dá)到了3.2～3.8之間，其中當(dāng)B.subtilis與L.paracasei HD1.7的接種比例為5%：1%時，pH的降低被延緩，最終為3.79。當(dāng)B.subtilis單培養(yǎng)時，pH的趨勢為先下降后上升再下降（圖1A）。說明隨著B.subtilis接種比例提高可能消耗部分乳酸，減緩共培養(yǎng)體系內(nèi)pH的降低[24]。

從B.subtilis的活菌數(shù)來看（圖1B），不同比例共培養(yǎng)相對于其各自單培養(yǎng)而言，其活菌數(shù)均下降，并且3%：1%和5%：2%均在36 h后檢測不到菌體。然而，接種量比例為5%：1%時，在60 h依然有活菌的存在，為1.70±0.31 log10(CFU/mL)，說明該比例條件可以有效的延長芽孢桿菌的存活時間。

圖1 不同接種比例單培養(yǎng)以及共培養(yǎng)體系中pH的變化(A)和B.subtilis活菌數(shù)(B)

對于L.paracaseiHD1.7而言（圖2A），5%：1%共培養(yǎng)的比例下其活菌數(shù)從6.30±0.08 log10(CFU/mL)開始上升至12 h后出現(xiàn)緩慢下降并于36 h達(dá)到穩(wěn)定，為8.00±0.09 log10(CFU/mL)，而3%：1%和5%：2%共培養(yǎng)的比例下，活菌數(shù)均先上升至24 h后下降，在60 h時活菌數(shù)分別為8.32±0.16 log10(CFU/mL)和8.43±0.13 log10(CFU/mL)。說明此接種比例提高會抑制共培養(yǎng)體系內(nèi)L.paracaseiHD1.7的生長，促使其活菌數(shù)減少。

3%:1%、5%:1%和5%:2%三種不同比例的共培養(yǎng)相對于單培養(yǎng)而言，細(xì)菌素的產(chǎn)生時間均從12 h提前到8 h，并且均在36 h達(dá)到穩(wěn)定，其產(chǎn)量相對于單培養(yǎng)而言分別提高了1.18、1.21和1.34倍，差異均極顯著（圖2B）。與此同時，對于3種不同比例共培養(yǎng)后B.subtilis產(chǎn)芽孢量均出現(xiàn)提高，分別為其單培養(yǎng)的3.68、5.95和4.88倍（表1）。

表1 不同接種比例共培養(yǎng)與單培養(yǎng)中B.subtilis產(chǎn)芽孢數(shù)之比

圖2 不同接種比例單培養(yǎng)以及共培養(yǎng)體系中L.paracasei HD1.7活菌數(shù)(A)及其抑菌活性(B)

由共培養(yǎng)體系中物種與環(huán)境變量相關(guān)關(guān)系的冗余分析(RDA（)圖3）可知，細(xì)菌素的產(chǎn)生與發(fā)酵時間、芽孢數(shù)、L.paracaseiHD1.7活菌數(shù)呈正相關(guān)，與B.subtilis活菌數(shù)、pH及B.subtilis比L.paracaseiHD1.7的接種比例呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。從投影長度來看，發(fā)酵時間、B.subtilis活菌數(shù)以及芽孢數(shù)對L.paracaseiHD1.7產(chǎn)細(xì)菌素的相關(guān)性最高。

圖3 L.paracasei HD1.7與B.subtilis共培養(yǎng)體系中物種與環(huán)境變量相關(guān)關(guān)系的冗余分析(RDA)

綜合以上結(jié)果可知，共培養(yǎng)體系中B.subtilis營養(yǎng)體及芽孢的存在都對L.paracaseiHD1.7產(chǎn)細(xì)菌素有刺激作用。當(dāng)調(diào)整二者的接種比例后，隨著B.subtilis促進(jìn)L.paracaseiHD1.7產(chǎn)細(xì)菌素的同時，其自身也形成更多的芽孢來回避細(xì)菌素的攻擊，形成協(xié)同合作的種間關(guān)系，最適比例為5%:1%。

2.2 不同比例下群體感應(yīng)及芽孢形成相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

2.2.1L.paracaseiHD1.7群體感應(yīng)相關(guān)基因檢測 由圖4A可知，5%:1%和3%:1%共培養(yǎng)的接種比例下，其luxS、prcK和prcR基因的轉(zhuǎn)錄水平均高于1%單培養(yǎng)的L.paracaseiHD1.7，其中l(wèi)uxS表達(dá)水平分別提高3.14倍和2.91倍，prcK表達(dá)水平提高4.98和4.03倍，prcR表達(dá)水平提高5.41和4.90倍。而5%:2%共培養(yǎng)的接種比例下相對于2%單培養(yǎng)的L.paracaseiHD1.7而言，其luxS、prcK和prcR基因的轉(zhuǎn)錄水平分別提高了3.19、5.06和5.46倍，其相對于各自的對照組而言均差異極顯著。

2.2.2B.subtilis芽孢形成相關(guān)基因檢測 由圖4B可知，5%:1%和5%:2%共培養(yǎng)的接種比例下，B.subtilis芽孢形成相關(guān)基因spo0A、sigE、sigF和sigG基因的轉(zhuǎn)錄水平均高于5%單獨培養(yǎng)的B.subtilis，其中spo0A轉(zhuǎn)錄水平提高2.37倍和2.17倍，sigE基因的轉(zhuǎn)錄水平提高2.71倍和2.35倍，sigF基因的轉(zhuǎn)錄水平提高3.15倍和3.03倍，sigG基因的轉(zhuǎn)錄水平提高2.56倍和2.13倍。而3%:1%共培養(yǎng)的接種比例下相對于3%單培養(yǎng)的B.subtilis而言，其spo0A、sigE、sigF和sigG基因的轉(zhuǎn)錄水平分別提高了2.02、1.43、2.47和2.08倍。

圖4 不同比例下L.paracasei HD1.7群體感應(yīng)相關(guān)基因luxS、prcK和prcR(A)以及B.subtilis芽孢形成基因spo0A、sigE、sigF和sigG(B)相對表達(dá)量的差異

結(jié)果表明，將L.paracaseiHD1.7與B.subtilis的接種比例調(diào)整為3%:1%、5%:1%和5%:2%三種不同的接種比例后，相對于單培養(yǎng)而言L.paracaseiHD1.7群體感應(yīng)相關(guān)基因均上調(diào)，并且B.subtilis芽孢形成相關(guān)基因也均上調(diào)，與2.1中發(fā)酵試驗結(jié)果一致，由此可以說明：在此條件下L.paracaseiHD1.7與B.subtilis共培養(yǎng)時，既提高了細(xì)菌素產(chǎn)量，B.subtilis也通過形成更多的芽孢回避細(xì)菌素的攻擊，協(xié)同合作最佳的接種比例是B.subtilis:L.paracaseiHD1.7為5%:1%，將此接種比例應(yīng)用于芽孢桿菌屬中，探究在此比例下，二者的協(xié)同合作關(guān)系在芽孢桿菌屬中是否為普遍現(xiàn)象。

2.3 芽孢桿菌屬與L.paracasei HD1.7以5%:1%比例共培養(yǎng)

將6種芽孢桿菌屬5%的接種量單培養(yǎng)于CO培養(yǎng)基中，除B.pumilus發(fā)酵液pH從最初的大約6.07下降到24 h（pH為4.65）隨后迅速上升至6.65外，其余5株芽孢桿菌的發(fā)酵液pH的總趨勢均下降且B.cereus、B.megaterium、B.laterosporus、B.licheniformis和B.thuringiensis等發(fā)酵液pH 分別降至4.76、4.61、4.63、4.65和4.54（圖5A）。當(dāng)芽孢桿菌屬與L.paracaseiHD1.7接種比例為5%:1%時，其發(fā)酵液的pH隨著時間的推移而下降，其中B.cereus、B.megaterium、B.pumilus、B.laterosporus、B.licheniformis和B.thuringiensis分別下降至3.67、3.74、3.17、3.81、4.09和4.12，由于引入產(chǎn)酸的L.paracaseiHD1.7因此共培養(yǎng)的發(fā)酵液pH均低于其5%單培養(yǎng)（圖5B）。

將6種芽孢桿菌屬以5%的接種量單培養(yǎng)于CO培養(yǎng)基中，在8 h前，各體系活菌數(shù)均上升，B.pumilus于36 h后又出現(xiàn)緩慢上升的趨勢直至48 h后穩(wěn)定，其余芽孢桿菌均降至大約36 h后趨于穩(wěn)定（圖6A）。共培養(yǎng)體系中，各芽孢桿菌活菌數(shù)也與其單培養(yǎng)一樣出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且培養(yǎng)至60 h時，B.licheniformis、B.megaterium和B.pumilus仍然有活菌的存在，而B.cereus、B.thuringiensis和B.laterosporus分別在36、48和60 h檢測不到活菌（圖6B），同時其共培養(yǎng)情況下產(chǎn)芽孢量相對于單培養(yǎng)而言也無顯著提升（表2）。芽孢桿菌屬在共培養(yǎng)中，B.pumilus芽孢的產(chǎn)生量相對于單培養(yǎng)而言提升最多，在60 h其共培養(yǎng)的產(chǎn)孢量約是單培養(yǎng)的4.88倍。

表2 芽孢桿菌屬產(chǎn)芽孢共培養(yǎng)與單培養(yǎng)之比

圖6 6種芽孢桿菌5%接種量單培養(yǎng)(A)及與L.paracasei HD1.7以5%:1%的比例共培養(yǎng)(B)菌體生長變化情況

當(dāng)6種芽孢桿菌與L.paracaseiHD1.7以5%:1%的比例進(jìn)行共培養(yǎng)時，與B.cereus和B.pumilus共培養(yǎng)的L.paracaseiHD1.7的活菌數(shù)分別上升至9.08±0.21 log10(CFU/mL)和 9.46±0.19 log10(CFU/mL)后趨于穩(wěn)定 ，而 與B.megaterium、B.laterosporus、B.licheniformis和B.thuringiensis等芽孢桿菌共培養(yǎng)的L.paracaseiHD1.7活菌數(shù)均先上升至8～12 h后下降（圖7A）。

L.paracaseiHD1.7與6種芽孢桿菌以5%:1%共培養(yǎng)時，與B.pumilus共培養(yǎng)的L.paracaseiHD1.7所產(chǎn)細(xì)菌素隨時間的增加而擴大，在60 h其細(xì)菌素產(chǎn)量達(dá)到最大，為77.46±0.38 AU/mL是單培養(yǎng)的1.27倍，而與其他芽孢桿菌共培養(yǎng)時細(xì)菌素產(chǎn)量均下降（圖7B），并且與B.licheniformis和B.thuringiensis共培養(yǎng)時，其細(xì)菌素的產(chǎn)生被抑制。

圖7 L.paracasei HD1.7與6種芽孢桿菌以5:1的比例共培養(yǎng)L.paracasei HD1.7菌體生長情況以及產(chǎn)細(xì)菌素情況

當(dāng)6種芽孢桿菌屬微生物與L.paracaseiHD1.7以5%:1%的比例共培養(yǎng)時，B.pumilus與L.paracaseiHD1.7的共培養(yǎng)組中，細(xì)菌素產(chǎn)量提升的同時B.pumilus也形成更多的芽孢，二者之間形成的是協(xié)同合作關(guān)系。B.licheniformis和B.thuringiensis與L.paracaseiHD1.7共培養(yǎng)時，芽孢的產(chǎn)量僅略有提升，但卻完全抑制了細(xì)菌素的產(chǎn)生，它們形成的是對L.paracaseiHD1.7偏害的生態(tài)關(guān)系。B.cereus、B.megaterium和B.laterosporus而言，芽孢桿菌產(chǎn)孢量提升，細(xì)菌素的產(chǎn)量減少，形成的是對B.cereus、B.megaterium和B.laterosporus偏利并對L.paracaseiHD1.7偏害的生態(tài)關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

代謝產(chǎn)物的合成需要產(chǎn)生菌達(dá)到一定的菌體密度時才能合成[25]。Mehdi等[26]將乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)與解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)以不同接種比例共培養(yǎng)，接種比例為1:1的條件下，可獲得最高的乳酸鏈球菌素產(chǎn)量。當(dāng)Y.lipolytica與L.lactis的接種比例大于1時，Y.lipolytica的生長速度和底物的利用率降低。Zhu等[27]證明共培養(yǎng)體系中巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)孢子形成和孢子穩(wěn)定性是促進(jìn)普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigenium Vulgare)生長以及合成2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG)的重要因素。可以見得，接種比例和產(chǎn)芽孢量的不同都會對共培養(yǎng)下的菌群結(jié)構(gòu)造成影響。本實驗中調(diào)整L.paracasei HD1.7與B.subtilis共培養(yǎng)的比例，二者的生態(tài)關(guān)系確實隨之改變。當(dāng)B.subtilis:L.paracasei HD1.7為5%:1%時，形成了協(xié)同合作的生態(tài)關(guān)系，細(xì)菌素的產(chǎn)生為單培養(yǎng)的1.21倍，芽孢的產(chǎn)生為單培養(yǎng)的5.95倍，提高了二者在種群間的競爭力，維系了產(chǎn)細(xì)菌素的L.paracasei HD1.7與B.subtilis間的穩(wěn)定，使二者處于相互平衡的生態(tài)關(guān)系。

接種比例相同但菌種不同會產(chǎn)生不同的生態(tài)關(guān)系，Bertrand等[28]發(fā)現(xiàn)，將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)04BBA15共培養(yǎng)時出現(xiàn)了對S.cerevisiae偏利的共生關(guān)系以及與發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)04BBA19進(jìn)行共培養(yǎng)時，體現(xiàn)為互利共生關(guān)系。與同一屬中的不同種細(xì)菌進(jìn)行共培養(yǎng)時，生態(tài)關(guān)系也不盡相同。Tremonte等[29-30]指出將清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)與兩種凝固酶陰性葡萄球菌:木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)和變異微球菌(Kocuria varians)進(jìn)行共培養(yǎng)時，每二者之間均形成了協(xié)同合作的關(guān)系，且前者促進(jìn)了后者的蛋白水解活性。本文研究結(jié)果說明，L.paracasei HD1.7與芽孢桿菌屬的共培養(yǎng)中，在同一條件下與不同種的芽孢桿菌之間形成的生態(tài)關(guān)系也是不相同的，既有與之共培養(yǎng)后對L.paracasei HD1.7偏利的芽孢桿菌，同樣也存在對其偏害的芽孢桿菌。