21種天然產(chǎn)物對(duì)小麥根腐病菌的抑菌活性

張 博，張悅麗，馬立國(guó)，祁 凱，劉 蘋，李長(zhǎng)松，齊軍山

（1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/山東省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250100；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，濟(jì)南250100）

0 引言

小麥根腐病是由多種土壤傳播病原菌單獨(dú)或混合侵染引起的重要病害，在小麥整個(gè)生育期均可發(fā)生，導(dǎo)致小麥減產(chǎn)，一般在20%～30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%以上[1]。該病主要病原是多種鐮刀菌和小麥根腐蠕孢菌。近些年，腐霉菌導(dǎo)致的根腐病日趨頻繁，小麥出苗期造成缺苗斷壟，在分蘗和返青拔節(jié)期造成植株萎蔫矮化，生長(zhǎng)不良，嚴(yán)重時(shí)引起根部和莖基部腐爛，造成植株枯死，產(chǎn)量降低[2-4]。目前，該病害的防治主要利用內(nèi)吸性殺菌劑為活性成分的種衣劑進(jìn)行種子包衣，或利用三唑類殺菌劑進(jìn)行拌種，防治效果明顯且藥效能持續(xù)至拔節(jié)期[5-6]，但化學(xué)制劑的長(zhǎng)期和超量使用，造成了土壤中有益微生物的種群的破壞，重金屬超標(biāo)等環(huán)境污染問(wèn)題[7]。因此，生物防治倍受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，植物提取物等天然物質(zhì)研究應(yīng)用得到發(fā)展，國(guó)外報(bào)道無(wú)患子果皮提取物皂苷對(duì)蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)具有很好的抑菌活性[8]；石榴皮提取物能夠抑制橄欖炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)菌絲生長(zhǎng)且防病效果明顯[9]；另有研究發(fā)現(xiàn)白芥子的水提取物中的Pure Yellow Mustard and Tillecur對(duì)Fusarium graminearum抑制效果顯著，濃度為1%時(shí)完全抑制病菌菌絲生長(zhǎng)[10]；國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)大黃、博落回和狼毒提取物對(duì)4種病原細(xì)菌的抑菌活性顯著[11]；博落回、木醋酸、八角、丁香、細(xì)辛醚、石菖蒲6種植物提取物對(duì)番茄4種主要病害病原菌的抑制率達(dá)到60%以上[12]；生姜、花椒、八角和辣椒提取物對(duì)蕎麥立枯病菌的抑制效果顯著，抑制率能達(dá)75%以上[13]。本研究針對(duì)小麥根腐病的病原菌禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、刺腐霉菌(Pythium spinosum)和小麥根腐離蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)，收集21種天然抑菌物質(zhì)，研究其對(duì)3種病原菌的抑制活性，為拓寬該病害生物防治的新思路提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及小麥品種

禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、刺腐霉菌(Pythium spinosum)和小麥根腐離蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)，由本研究室分離、純化、鑒定并保存。

1.2 供試天然物質(zhì)

大黃素、白藜蘆醇、青蒿素、槲皮素、芹菜素、反式細(xì)辛醚、順式細(xì)辛醚從抑菌植物中提取獲得（本課題組對(duì)抑菌成分分離并鑒定）。

供試精油為薰衣草油、肉桂油、月桂油、丁香酚油、天竺葵油、薄荷酮油、桉樹(shù)油、香茅油、葡萄籽油、迷迭香油、野菊精油、檸檬精油、茶樹(shù)油、柚皮苷精油，均為單方精油，購(gòu)自上海香匯生物科技有限公司。

1.3 室內(nèi)抑菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)法測(cè)定[14-19]：初次篩選按照100 mg/L濃度進(jìn)行，選出有效天然物質(zhì)；二次篩選將有效天然物質(zhì)與滅菌PDA培養(yǎng)基均勻混合，配制成不同濃度梯度，倒入培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中制成含藥培養(yǎng)基平板，滅菌水作對(duì)照，每濃度重復(fù)3次。在預(yù)培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌、刺腐霉菌和小麥根腐離蠕孢菌菌落邊緣打取菌餅（直徑0.5 cm），挑出置于PDA平板中間，分別在25℃（刺腐霉菌）和28℃（禾谷鐮刀菌和離蠕孢菌）的暗培養(yǎng)7～10天，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率并運(yùn)用DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，得到EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 21種天然產(chǎn)物對(duì)小麥根腐病菌的抑菌活性初篩

將天然產(chǎn)物（需用丙酮溶解），按照100 mg/L濃度與PDA培養(yǎng)基混勻，進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，21種天然產(chǎn)物對(duì)小麥根腐病菌抑菌活性具有顯著差異性，其中，白藜蘆醇抑菌活性顯著，對(duì)禾谷鐮刀菌抑制率為18.75%，刺腐霉菌抑制率為85%，對(duì)離蠕孢菌抑制率為75%；其次是順式細(xì)辛醚，對(duì)禾谷鐮刀菌抑制率為56.25%，對(duì)刺腐霉菌抑制率為62.5%，對(duì)離蠕孢菌抑制率為56.2%；反式細(xì)辛醚對(duì)禾谷鐮刀菌抑制率為51.25%，對(duì)刺腐霉菌抑制率為37.5%，對(duì)離蠕孢菌抑制率為62.5%；丁香酚對(duì)禾谷鐮刀菌和刺腐霉菌抑制率均為37.5%，對(duì)離蠕孢菌抑制率為71.25%；薰衣草精油對(duì)3種病原菌均無(wú)抑菌活性；就小麥根腐病菌對(duì)天然產(chǎn)物的敏感程度而言，禾谷鐮刀菌對(duì)順式細(xì)辛醚最敏感，其次是反式細(xì)辛醚；刺腐霉菌對(duì)白藜蘆醇最敏感，其次是順式細(xì)辛醚和檸檬精油；離蠕孢菌對(duì)白藜蘆醇最敏感，其次是丁香酚。因此，說(shuō)明小麥根腐病菌對(duì)21種天然產(chǎn)物的敏感程度同樣具有顯著差異性。

圖1 不同天然抑菌產(chǎn)物對(duì)小麥根腐病菌的抑制效果

2.2 天然產(chǎn)物對(duì)禾谷鐮刀菌抑菌EC50值測(cè)定

依據(jù)初篩結(jié)果，設(shè)計(jì)濃度梯度，順式細(xì)辛醚為250、100、75、50、10 mg/L，反式細(xì)辛醚為 500、250、100、75、50、10 mg/L，分別結(jié)果如表1所示。

表1 天然產(chǎn)物對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性

由圖表可以看出，反式細(xì)辛醚抑菌活性明顯，EC50值為69.9972 mg/L，順式細(xì)辛醚效果不顯著，EC50值為130.2344 mg/L（圖2、圖3）。

圖2 反式細(xì)辛醚對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性

圖3 順式細(xì)辛醚對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性

2.3 天然產(chǎn)物對(duì)刺腐霉菌抑菌EC50值測(cè)定

依據(jù)初篩結(jié)果，設(shè)計(jì)濃度梯度，白藜蘆醇為100、75、50、10、5 mg/L，順式細(xì)辛醚為250、100、75、50、10 mg/L，檸檬精油為500、250、100、50、10、5 mg/L，如表2所示。

表2 天然產(chǎn)物對(duì)刺腐霉菌的抑菌活性

由表可以看出，白藜蘆醇對(duì)刺腐霉菌有明顯抑菌活性，EC50值為24.4683 mg/L，其次是順式細(xì)辛醚和檸檬精油效果較好，EC50值分別為71.0284 mg/L和79.8388 mg/L。

2.4 天然產(chǎn)物對(duì)離蠕孢菌抑菌EC50值測(cè)定

依據(jù)初篩結(jié)果，設(shè)計(jì)濃度梯度，將白藜蘆醇為250、100、50、10、5 mg/L，丁香酚為200、100、50、10、1、0.5 mg/L。結(jié)果如表3所示。

表3 天然產(chǎn)物對(duì)離蠕孢菌的抑菌活性

由圖表可以看出，丁香酚對(duì)離蠕孢菌有明顯抑菌活性，EC50值為14.0664 mg/L，其次是白藜蘆醇，EC50值為22.0968 mg/L。

3 討論與結(jié)論

目前，國(guó)家大力倡導(dǎo)化學(xué)農(nóng)藥減施技術(shù)研究，植物提取物等天然產(chǎn)物在病害防治方面的研究和應(yīng)用得到進(jìn)一步提升，例如張亮等[20]測(cè)定了4種植物提取物對(duì)茶炭疽病菌抑制效果，結(jié)果表明蘆柑皮抑制效果顯著，EC50值為8.981 mg/L，艾蒿對(duì)分生孢子的抑制率為85.54%；張格杰等[21]測(cè)定26種植物乙醇提取物對(duì)植物病原菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)黃花草木樨、艾草、鐵桿蒿和黃花蒿抑菌效果好可應(yīng)用于無(wú)公害植物源殺菌劑的開(kāi)發(fā)；沈佳鑫等[22]研究發(fā)現(xiàn)山茶葉提取物對(duì)蘋果腐霉病菌和小麥赤霉病菌抑制率在80%以上，可應(yīng)用于無(wú)公害植物源殺菌劑的開(kāi)發(fā)；楊婷[23]研究發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物香芹酚、丁香酚、異丁香酚、枯茗醛、百里香酚對(duì)炭疽菌和鏈格孢有較好的抑菌活性，其中香芹酚抑菌活性最強(qiáng)，IC50分別為40.89 mg/L和18.19 mg/L。同時(shí)，在小麥根腐病防治方面，發(fā)現(xiàn)黃瑞香提取物對(duì)Fusarium graminearum有很好的效果[24]；蒼耳提取物對(duì)小麥根腐病菌也有較好的抑制作用[25]；張維庫(kù)等[26]發(fā)現(xiàn)牛心樸子所產(chǎn)生的生物堿能夠很好地抑制小麥根腐病菌的生長(zhǎng)。本研究基于國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，較全面的收集天然產(chǎn)物，有針對(duì)性的篩選出對(duì)3種小麥根腐致病菌分別具有抑菌活性的天然產(chǎn)物，尤其是刺腐霉防治方面研究在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，為小麥根腐病生物防治具有指導(dǎo)意義，在協(xié)同化學(xué)防控小麥根腐病和開(kāi)發(fā)新型植物源農(nóng)藥提供參考依據(jù)。同時(shí)，天然產(chǎn)物也具有一定的局限性，例如生物提取量較低、很多研究局限在室內(nèi)研究階段、在田間的持效性較短及田間多方因素對(duì)防效的影響等均是今后需要進(jìn)一步探索研究的新方向。

圖4 白藜蘆醇對(duì)離蠕孢菌的抑菌活性

圖5 丁香酚對(duì)離蠕孢菌的抑菌活性

本文研究了21種天然產(chǎn)物對(duì)小麥根腐病的主要病原菌禾谷鐮刀菌、刺腐霉和小麥離蠕孢菌的抑菌活性，明確了天然產(chǎn)物反式細(xì)辛醚、白藜蘆醇、丁香酚對(duì)3種病原菌具有顯著抑菌活性，其中，反式細(xì)辛醚對(duì)禾谷鐮刀菌活性顯著，EC50值為69.9972 mg/L；白藜蘆醇對(duì)刺腐霉菌活性顯著，EC50值為24.468 mg/L；丁香酚對(duì)離蠕孢菌活性顯著，EC50值為14.0664 mg/L。同時(shí)，說(shuō)明了小麥根腐病菌對(duì)21種天然產(chǎn)物的敏感程度同樣具有顯著差異性，例如：白藜蘆醇抑菌活性對(duì)3種病原菌的抑制率分別為18.75%、85%和75%；反式細(xì)辛醚對(duì)3種病原菌的抑制率分別為51.25%、37.5%和62.5%；丁香酚對(duì)禾谷鐮刀菌和刺腐霉菌抑制率均為37.5%，對(duì)離蠕孢菌抑制率為71.25%；薰衣草精油對(duì)3種病原菌均無(wú)抑菌活性。因此，要有針對(duì)性的選擇天然抑菌物質(zhì)，提高小麥根腐病的生物防治效果。