李建衛(wèi) 李煥煥 楊 勇 張 培 黃玉梅

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科 山東 濱州 256603；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科 山東 濱州 256603；3 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科 山東 濱州 256603

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)不僅具有多向分化潛能，同時因其具有取材方便，來源廣泛和易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)成為了越來越多研究者的選擇對象[1-3]。前期有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)力刺激能夠促進(jìn)ADSCs的骨向分化[4]，但是力學(xué)作用下ADSCs骨向分化的分子機(jī)制還不清楚。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類堿基長度約為22 bp的內(nèi)源性非編碼蛋白小分子RNA，通過識別mRNA的3′-非翻譯區(qū)抑制其翻譯而參與調(diào)控一系列的生命活動[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了多個miRNA在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的調(diào)控作用[7-9]。目前關(guān)于機(jī)械應(yīng)力加載下ADSCs骨向分化過程中相關(guān)miRNA表達(dá)模式的研究較少。本研究采用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞加力裝置對細(xì)胞施加單一周期的張力刺激誘導(dǎo)骨向分化，篩選力學(xué)作用下成骨分化相關(guān)的miRNA，并探討其在力學(xué)刺激不同時間點(diǎn)的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究應(yīng)力下成骨相關(guān)miRNA的功能及力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑儀器 C57BL/6小鼠由濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶(Sigma公司，美國)，胎牛血清(Gibco公司，美國)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Cyagen 公司，美國)，總RNA提取Trizol試劑、α-MEM培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent kit、PCR反應(yīng)試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa公司，大連)，miRNA標(biāo)記試劑盒miRCURYTMPower labeling kit、miRNA芯片miRCURYTMLNA Array(Exiqon公司，丹麥)，紫外分光光度計(Nanodrop公司，美國)，GenePix 4000B芯片掃描儀、GenePix Pro 6.0圖像分析軟件(Axon Instruments公司，美國)。成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、Ⅰ型膠原蛋白(type I collagen, Col1)、骨鈣素(Osteocalcin, OCN)以及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成，其序列見表1。

表1 mRNA引物序列

1.2 小鼠ADSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下取6周齡雄性C57BL/6小鼠雙側(cè)腹股溝處的脂肪組織，PBS沖洗3次后將其剪碎至乳糜狀。按照體積比1∶1加入0.2%的Ⅰ型膠原酶充分混合，置恒溫?fù)u床37 ℃消化40 min后加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中止消化。100 μm尼龍濾網(wǎng)過濾，1 000 r·min-1離心8 min，棄去上清液。所獲細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d后更換培養(yǎng)基，細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代。取第3代ADSCs進(jìn)行成骨及成脂誘導(dǎo)分化，成脂誘導(dǎo)1周后行油紅O染色觀察脂滴，成骨誘導(dǎo)2周后行茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)。

1.3 細(xì)胞加力 將第3代小鼠ADSCs分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。采用四點(diǎn)彎曲加力儀對實(shí)驗(yàn)組ADSCs進(jìn)行加力。將75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶制作成3 cm×8 cm大小的細(xì)胞加力板，第3代ADSCs消化后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個·mL-1，將l mL細(xì)胞懸液均勻接種于加力板上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后在加力培養(yǎng)皿內(nèi)加力。加力儀加力參數(shù)設(shè)置為位移1 mm，頻率為0.5 Hz，此時細(xì)胞受力2 000 με(μstrain，微應(yīng)變)，每天加力2 h。對照組細(xì)胞在相同孵箱內(nèi)培養(yǎng)但不加力。

1.4 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測成骨相關(guān)基因mRNA 實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞分別于處理1、3、5、7 d后收獲細(xì)胞，利用 Trizol 試劑按說明書要求提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計測量其濃度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqII試劑盒在Bio-Rad iQ5系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，1個循環(huán)，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法分析2組細(xì)胞1、3、5、7 d的ALP、Runx2、OCN及Col1 mRNA相對表達(dá)量。

1.5 基因芯片技術(shù)篩選力學(xué)刺激誘導(dǎo)ADSCs骨向分化過程中成骨相關(guān)miRNA Trizol法提取實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞第5天總RNA，使用紫外分光光度計測定RNA 260 nm/RNA 280 nm的光密度值以檢測RNA樣品的純度和濃度；用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA純度及完整性。使用miRNA標(biāo)記試劑盒，用標(biāo)記酶將Hy3TM熒光基團(tuán)標(biāo)記兩細(xì)胞樣本的miRNA，得到用于與芯片雜交的熒光探針；使用雜交儀將標(biāo)記好的探針與miRCURYTM芯片進(jìn)行雜交，雜交后采用GenePix 4000B芯片掃描儀讀取芯片圖像的原始信號強(qiáng)度，并用GenePix Pro 6.0圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。表達(dá)變化在2倍以上認(rèn)為是顯著差異變化的miRNA。

1.6 成骨相關(guān)miRNA的檢測 選取第3代ADSCs進(jìn)行細(xì)胞加力實(shí)驗(yàn)，分別取加力第0、3、5、7 d的細(xì)胞提取總RNA。因miRNA序列較短，難以采用常規(guī)方法設(shè)計PCR引物，本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計相應(yīng)的具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再利用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，以U6作為內(nèi)參計算各成骨相關(guān)miRNA在不同時間點(diǎn)的表達(dá)強(qiáng)度。相關(guān)mmu-miRNA及內(nèi)參U6正反向引物序列見表2， miRNA反向引物可與正向引物部分配對，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠ADSCs的鑒定 電子顯微鏡下可見典型的小鼠ADSCs呈短梭形，3代細(xì)胞培養(yǎng)3～5 d后，細(xì)胞生長旺盛，呈明顯的集落狀生長(圖1A)。第3代ADSCs成骨誘導(dǎo)14 d后茜素紅染色發(fā)現(xiàn)明顯鈣結(jié)節(jié)(圖1B)，成脂誘導(dǎo)7 d后油紅O染色發(fā)現(xiàn)明顯脂滴(圖1C)。

表2 miRNA引物序列

A.第3代ADSCs細(xì)胞形態(tài) 電子顯微鏡 ×40；B.茜素紅染色圖像 ×100；C.油紅O染色 ×100。

2.2 成骨相關(guān)基因 mRNA的表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果見圖2，統(tǒng)計分析表明，與不加力組相比，加力組細(xì)胞OCN mRNA水平在加力的5、7 d顯著增高，ALP mRNA水平在加力的3、5 d顯著增高， Col1 mRNA水平在加力1、3、5、7 d顯著增高，Runx2 mRNA水平在加力3、5、7 d顯著增高(P<0.05)。

圖2 兩組細(xì)胞在不同時間點(diǎn)的成骨相關(guān)基因OCN、ALP、Col1及Runx2的表達(dá)

2.3 基因芯片篩選成骨相關(guān)miRNA 紫外分光光度計檢測A260 nm/A280 nm為1.8～2.0，電泳檢測RNA帶顯示28 S、18 S條帶清晰(圖3)，表明RNA質(zhì)量較好。通過miRNA芯片實(shí)驗(yàn)篩選，在機(jī)械牽張力促進(jìn)ADSCs骨向分化過程中顯著差異表達(dá)miRNA共有11個，其中表達(dá)上調(diào)5個，表達(dá)下調(diào)6個。表達(dá)上調(diào)的miRNA分別為mmu-miR-300-5p(2.33)、mmu-miR-290a-3p(3.45)、mmu-miR-669c-3p(3.62)、mmu-miR-1895(2.49)、mmu-miR-763(3.08)，表達(dá)下調(diào)的miRNA分別為mmu-miR-214-3p(0.37)、mmu-miR-140-5p(0.46)、mmu-miR-30d-3p(0.41)、mmu-miR-26a-5p(0.46)、mmu-miR-335-5p(0.44)、mmu-miR-154-5p(0.42)，括號內(nèi)數(shù)字為表達(dá)變化量。

1. 不加力組；2. 加力組。

2.4 成骨相關(guān)miRNA在加力進(jìn)程中的表達(dá) 在6個表達(dá)下調(diào)miRNA中，miR-214-3p、miR-140-5p、miR-30d-3p及miR-154-5p在加力過程中呈持續(xù)降低趨勢，其中第5天的變化最顯著(圖4)；miR-26a-5p及miR-335-5p的表達(dá)在第3天時降至最低水平，第5、7天有一定程度上升。在5個表達(dá)上調(diào)的miRNA中，miR-763于加力的第3天升至最高水平， miR-290a-3p于加力的第5天升至最高水平，其后有一定程度下降趨勢；其余3個miRNA均成持續(xù)上調(diào)趨勢(圖5)。

圖4 加力第0、3、5、7天成骨相關(guān)下調(diào)miRNA 的相對表達(dá)強(qiáng)度

3 討論

機(jī)械力學(xué)刺激在骨的形成及改建過程中具有重要作用[10-12]，ADSCs細(xì)胞能夠感應(yīng)機(jī)械力學(xué)刺激信號并將其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)信號，適當(dāng)?shù)膽?yīng)力刺激下能夠加速ADSCs細(xì)胞骨向分化的進(jìn)程[4,12]。但是有關(guān)ADSCs力轉(zhuǎn)導(dǎo)的確切機(jī)制并不清楚。已有研究證實(shí)miRNA在成骨分化和骨形成過程中起著重要的調(diào)控作用[7-9]，但是目前關(guān)于機(jī)械應(yīng)力加載下ADSCs骨向分化過程中相關(guān)miRNA表達(dá)的研究報道較少。

圖5 加力第0、3、5、7天成骨相關(guān)上調(diào)miRNA 的相對表達(dá)強(qiáng)度

本實(shí)驗(yàn)在驗(yàn)證ADSCs的多向分化潛能之后，將其分為加力組及不加力組，對加力組進(jìn)行張應(yīng)力刺激，在不同的時間點(diǎn)利用qRT-PCR檢測成骨相關(guān)mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示ADSCs經(jīng)張應(yīng)力刺激后，成骨相關(guān)基因ALP、Runx2、Col1和OCN mRNA表達(dá)水平總體高于對照組，提示本實(shí)驗(yàn)機(jī)械牽張力可促進(jìn)ADSCs的骨向分化。

本實(shí)驗(yàn)利用miRNA基因芯片，分析第5天實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞miRNA基因表達(dá)譜，篩選出在力學(xué)刺激誘導(dǎo)ADSCs成骨分化過程中表達(dá)變化明顯的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個miRNA表達(dá)上調(diào)，6個miRNA表達(dá)下調(diào)。ADSCs骨向分化過程中miR-300-5p、miR-290a-3p、miR-669c-3p、miR-1895、miR-763表達(dá)上調(diào)，正向參與力學(xué)刺激下ADSCs成骨分化，結(jié)合miRNA與靶向mRNA的抑制機(jī)制，此5個miRNA的靶基因mRNA在ADSCs骨向分化中表達(dá)下調(diào)，相關(guān)靶基因蛋白為骨向調(diào)控的負(fù)性因子；ADSCs骨向分化過程中miR-214-3p、miR-140-5p、miR-30d-3p、miR-26a-5p、miR-335-5p、miR-154-5p表達(dá)下調(diào)，負(fù)向參與力學(xué)刺激下ADSCs成骨分化，此6個miRNA的靶基因在ADSCs骨向分化中表達(dá)上調(diào)，相關(guān)靶基因蛋白為骨向調(diào)控的正性因子。同時本研究采用qRT-PCR技術(shù)，在張應(yīng)力刺激的不同時間點(diǎn)，檢測各miRNA的相對表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示：成骨相關(guān)miRNA 在加力的第3天即出現(xiàn)差異性變化，多數(shù)miRNA在加力過程中呈持續(xù)上調(diào)或下調(diào)趨勢，在第5天時差異性最顯著；但miR-26a-5p、 miR-335-5p及miR-763的表達(dá)在第3天時差異性最顯著，其后又有一定程度的反調(diào)。提示加力刺激的第5天是miRNA調(diào)控的關(guān)鍵時間，多數(shù)miRNA發(fā)生顯著變化，miR-26a-5p、 miR-335-5p及miR-763可能參與力學(xué)促進(jìn)成骨的早期調(diào)控。

本研究證實(shí)適當(dāng)應(yīng)力刺激可促進(jìn)ADSCs骨向分化，并篩選出應(yīng)力下11個與成骨分化相關(guān)的miRNA，并初步探討了其在張應(yīng)力刺激不同時間點(diǎn)的表達(dá)模式。后續(xù)研究中將進(jìn)一步研究相應(yīng)miRNA的靶基因，生物信息學(xué)分析miRNA的靶向mRNA及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子，雙熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證其靶向調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建上調(diào)下調(diào)miRNA表達(dá)的慢病毒載體，感染ADSCS進(jìn)一步研究mRNA、信號通路關(guān)鍵分子、成骨相關(guān)指標(biāo)的變化。探索miRNA對成骨功能的影響及其參與力轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子調(diào)控機(jī)制。