公海鳳 褚 微 張 冰 鄭 靜 蘇慶國 梅延輝 紀(jì) 洪

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科 山東 濱州 256603；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科 山東 濱州 256603；3 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)中心 山東 濱州 256603

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)占泌尿系腫瘤第二位，是最常見的腎臟腫瘤(90%～95%)，最新數(shù)字顯示美國每年有超過63 000人被診斷為RCC，超過14 000人死于本病[1]。RCC起病隱匿，就診時(shí)近20%的病人處于高分期。治療以手術(shù)切除為主，但RCC易復(fù)發(fā)，好轉(zhuǎn)移，30%的患者在腫瘤切除后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。晚期RCC患者預(yù)后差，死亡率高。放療、化療、免疫治療等其他輔助治療效果欠佳。舒尼替尼是治療晚期RCC的一線靶向藥物，但約10%～20%的RCC患者初次治療時(shí)對其先天性耐藥，其余患者在6～15個(gè)月的治療后出現(xiàn)舒尼替尼耐藥和腫瘤進(jìn)展[3-4]。因此早期診斷，并在術(shù)后規(guī)律隨訪對提高患者生存質(zhì)量、延長生存期非常必要。但目前臨床缺乏有效的早期診斷及預(yù)后隨訪相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記。外周循環(huán)生物標(biāo)記，具有便捷、創(chuàng)傷小的優(yōu)勢，但現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物如CA-125及CEA等在RCC診斷及隨訪中價(jià)值有限。因此有必要尋找更好的外周血標(biāo)志物。

外周血中的非編碼RNA，比如miRNA及l(fā)ncRNA引起了人們的關(guān)注。長鏈非編碼RNA是一種轉(zhuǎn)錄本長度超過200個(gè)堿基的核酸序列，不具備編碼蛋白的功能，參與細(xì)胞多種功能[5]，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。已有研究表明lncRNA在RCC中發(fā)揮重要作用[6-15]，但RCC外周血中l(wèi)ncRNA的研究少見。因此本實(shí)驗(yàn)擬用芯片對RCC 外周血lncRNA及mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行系統(tǒng)探討，期望為RCC早期診斷和預(yù)后判斷提供新的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年12月至2017年3月在我院經(jīng)病理學(xué)診斷的RCC患者5例作為實(shí)驗(yàn)組，同期健康人5例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整；實(shí)驗(yàn)組均按照2016年WHO關(guān)于泌尿系統(tǒng)疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)檢查；對照組沒有基礎(chǔ)疾病及泌尿系疾??；兩組年齡性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并感染性疾病及肝腎疾病患者；合并心血管疾病、內(nèi)分泌疾病及自身免疫性疾病者。其中實(shí)驗(yàn)組年齡52～76歲(中位年齡為67歲)，對照組年齡52～74歲(中位年齡為70歲)，兩組均為男性3名，女性2名。抽取參與實(shí)驗(yàn)者的靜脈血各5 mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)，4℃離心后于取上層血漿，放入液氮中保存?zhèn)溆谩４搜芯拷?jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有參與實(shí)驗(yàn)者均簽署知情同意書。

1.2 基因芯片分析 使用Trizol試劑提取外周血血漿中的總RNA，使用NanoDrop ND-1000評估RNA的量和質(zhì)量。采用Arraystar人類lncRNA芯片(V4.0)，該芯片檢測40 173個(gè)lncRNA和20 730個(gè)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本。其中l(wèi)ncRNA是從權(quán)威公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(包括Refseq、UCSC knowngenes、Gencode等)和高影響因子論文中仔細(xì)挑選的。芯片雜交、洗滌、固定并掃描雜交芯片。兩組樣品間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)lncRNA或mRNA通過P-value/FDR(<0.05)篩選。兩個(gè)樣品間差異表達(dá)lncRNA或mRNA通過fold change(≥2)篩選。

1.3 基因本體(gene ontology，GO)分析及通路分析(Pathway分析) 差異表達(dá)mRNA進(jìn)行GO(www.geneontology.org)和Pathway(www.genome.ad.jp/kegg/)的富集分析。GO分析包括分子功能(molecular function，MF)、生物學(xué)過程(biological process，BP)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)三部分。Pathway分析主要尋找差異表達(dá)基因主要富集的細(xì)胞通路。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR的驗(yàn)證 由于外周血受影響因素較多，為鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，隨機(jī)選取差異表達(dá)的三個(gè)lncRNA：上調(diào)表達(dá)的ENST00000547549、ENST00000591689及下調(diào)表達(dá)的NR_038263，在進(jìn)行芯片研究的5例RCC患者及5例正常人剩余的血漿中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證。Trizol試劑提取外周血血漿的總RNA，離心后加入異丙醇沉淀，75%乙醇清洗后重新溶解于無RNA酶的水中。使用NanoDrop?ND-1000測定RNA濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以β-actin為內(nèi)對照，所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，如下：2×Mater Mix 5 μL，10 μM的PCR上下游引物各0.5 μL，2 μL樣品cDNA，加水至10 μL。所有的指標(biāo)均按以下程序進(jìn)行：95℃，10 min；40個(gè)PCR循環(huán)(95℃，10 s；60℃，60 s)。為建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按 (95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s)；并從60℃緩慢加熱到99℃。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果。引物如表1。

表1 lncRNA及內(nèi)對照引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RCC患者外周血與正常人外周血血漿中差異表達(dá)的lncRNA與mRNA 與正常人外周血血漿比較，RCC患者有3 664個(gè)lncRNA異常表達(dá)(fold change≥2,P<0.05)，其中1 511個(gè)lncRNA上調(diào)表達(dá)，2 153個(gè)lncRNA下調(diào)表達(dá)；mRNA差異表達(dá)有2 268個(gè)(fold change≥2,P<0.05)，其中932個(gè)mRNA上調(diào)表達(dá)，1 336個(gè)mRNA下調(diào)表達(dá)。lncRNA及mRNA均以下調(diào)表達(dá)為主。其中上調(diào)及下調(diào)表達(dá)倍數(shù)變化的前20個(gè)lncRNA及mRNA如圖1、2所示。

紅色，上調(diào)；綠色，下調(diào)；黑色，無差異。T，實(shí)驗(yàn)組(RCC患者)；C，對照組(健康人)。

紅色，上調(diào)；綠色，下調(diào)；黑色，無差異。T，實(shí)驗(yàn)組(RCC患者)；C，對照組(健康人)。

有詳細(xì)注釋的差異表達(dá)lncRNA中最多見的是基因間lncRNA(intergenic lncRNA，占61%)，隨后依次為天然反義lncRNA(natural antisense lncRNA，占16%)，內(nèi)含子反義lncRNA(intronic antisense lncRNA，占14%)，內(nèi)含子同義重疊lncRNA(intron sense-overlapping lncRNA，占4%)，雙向lncRNA(bidirectional lncRNA，占3%)及外顯子同義重疊lncRNA(exon sense-overlapping lncRNA，占2%)，其分布情況如圖3。

圖3 RCC患者外周血中差異表達(dá)lncRNA的不同類型及其分布

2.2 GO分析結(jié)果 GO分析提示RCC患者外周血血漿在分子功能方面異常表達(dá)的mRNA主要涉及脂蛋白顆粒受體活性、肌動蛋白結(jié)合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合、視黃酸類物質(zhì)結(jié)合及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子的活性等方面(圖4A)。在細(xì)胞組分方面異常表達(dá)的mRNA主要集中在細(xì)胞骨架、鞭毛軸絲、中間絲、樹突、胞漿液泡等(圖4B)。生物學(xué)過程主要富集在全身動脈血壓調(diào)節(jié)、腎臟發(fā)育、泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育、內(nèi)分泌過程等(圖4C)。

A. 分子功能(淺色代表下調(diào)mRNA富集的分子功能，深色代表上調(diào)mRNA富集的分子功能)；B. 細(xì)胞組分(淺色代表下調(diào)mRNA富集的細(xì)胞組分，深色代表上調(diào)mRNA富集的細(xì)胞組分)；C. 生物學(xué)過程(淺色代表下調(diào)mRNA富集的生物學(xué)過程，深色代表上調(diào)mRNA富集的生物學(xué)過程)。

2.3 KEGG分析結(jié)果 KEGG分析結(jié)果顯示異常表達(dá)的mRNA主要集中參與黑素原形成、堿基切除修復(fù)、Hippo信號通路、血管平滑肌收縮、戊糖與葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、脂肪酸延長、維生素消化與吸收、長時(shí)程增強(qiáng)等通路(圖5)。其中Hippo信號通路是包括RCC在內(nèi)的多種腫瘤中關(guān)鍵的生長調(diào)節(jié)通路。

淺色代表下調(diào)mRNA富集的通路，深色代表上調(diào)mRNA富集的通路。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果 相較于健康人的外周血血漿，5例RCC患者外周血血漿中ENST00000547549上調(diào)表達(dá)(P=0.0127 50),ENST00000591689上調(diào)表達(dá)(P=0.0136 84)，NR_038263下調(diào)表達(dá)(P=0.001 694)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且結(jié)果與芯片結(jié)果一致(圖6)。說明芯片結(jié)果穩(wěn)定可靠，外周血異常表達(dá)的lncRNA和mRNA可能成為RCC患者的早期診斷的生物分子。

*為P<0.05,**P<0.01。圖6 RCC患者(實(shí)驗(yàn)組)及健康人(對照組)外周血IncRNA表達(dá)水平驗(yàn)證

3 討論

RCC是腎臟最常見的惡性腫瘤，對于放化療不敏感，現(xiàn)有靶向藥物治療效果有限，尤其是晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，預(yù)后極差，中位生存期僅6～12個(gè)月[16]。因此早期發(fā)現(xiàn)和診斷十分重要。但目前臨床工作中，現(xiàn)有的外周血中標(biāo)記物在RCC中診斷價(jià)值有限，尚未有高敏感性及高特異性的指標(biāo)。既往一些研究報(bào)道了lncRNA在RCC組織中的表達(dá)譜[6-15]。2008年，Brito等首次報(bào)道6例RCC患者一組下調(diào)表達(dá)的內(nèi)含子lncRNA，同一研究小組進(jìn)行微陣列實(shí)驗(yàn)，結(jié)合公開數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)29個(gè)內(nèi)含子lncRNA在RCC腫瘤組織和非腫瘤組織間差異表達(dá)，且與患者5年生存結(jié)果顯著相關(guān)[7-17]，提示lncRNA可能成為RCC患者早期診斷和預(yù)測預(yù)后的可靠指標(biāo)。而其他研究使用了包含所有l(wèi)ncRNA類型的芯片，且使用的樣本包括不同TNM分期的病例，包括轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移病例[6-15]。Zhou等利用lncRNA啟動子芯片，結(jié)合對lncRNA表達(dá)譜的分析，發(fā)現(xiàn)了一系列啟動子區(qū)高甲基化的lncRNA表達(dá)下調(diào)[18]。但RCC患者血漿中l(wèi)ncRNA的研究較少，目前還沒有對RCC血漿中l(wèi)ncRNA的系統(tǒng)研究。我們使用微陣列系統(tǒng)分析了RCC患者和健康對照組的血漿中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示相較于健康人，RCC患者中確實(shí)存在差異表達(dá)的lncRNA及mRNA，且以下調(diào)基因?yàn)橹鳌?/p>

通過在Pubmed中查閱文獻(xiàn)，并與我們的芯片結(jié)果進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的組織中高表達(dá)lncRNA或低表達(dá)lncRNA也出現(xiàn)在我們異常表達(dá)的lncRNA結(jié)果中，這些分子可能成為新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。如RCC中上調(diào)表達(dá)的lncRNA H19[19-20]、核富集豐富轉(zhuǎn)錄本1 (nuclear enriched abundant transcript1，NEAT1)[21]，在我們外周血血漿芯片結(jié)果中也是上調(diào)表達(dá)的(數(shù)據(jù)未展示)，與組織表達(dá)的結(jié)果一致。再比如我們檢測到在RCC患者外周血血漿下調(diào)表達(dá)的前20個(gè)lncRNA中的HOTAIRM1(HOXA transcript antisense RNA，Myeloid-Specific 1，HOTAIRM1)也在文獻(xiàn)研究中表明在RCC組織中表達(dá)均下調(diào)[22]。HOTAIRM1在分化細(xì)胞中的主要轉(zhuǎn)錄本是胞漿型的HM1-3亞型，而HM1-3在90%的RCC中下調(diào)。這些結(jié)果均提示我們芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，而這些分子都有望成為診斷和預(yù)后監(jiān)測中的生物學(xué)分子，并可能成為治療的靶點(diǎn)。

NR_038263(suppressor of cytokine signaling 2-antisense transcript 1，SOCS2-AS1)位于12號染色體，是從編碼SOCS2蛋白基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄而來的反義lncRNA[23]。在雄激素陽性的前列腺癌細(xì)胞中雄激素誘導(dǎo)的lncRNA——SOCS2-AS1，在去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞模型中表達(dá)升高。SOCS2-AS1增強(qiáng)去勢抵抗和雄激素依賴的細(xì)胞生長。敲除SOCS2-AS1后，凋亡通路相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，包括腫瘤壞死因子超家族10(tumor necrosis factor superfamily 10，TNFSF10)，提高前列腺癌對多西他賽治療反應(yīng)，提示雄激素誘導(dǎo)的SOCS2-AS1通過抑制細(xì)胞凋亡在去勢抵抗前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[23]。在我們的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)與健康人外周血血漿相比，RCC患者外周血血漿中SOCS2-AS1的表達(dá)明顯下調(diào)，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。在其它疾病中SOCS2-AS1的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。而ENST00000591689定位于17號染色體，長度508 bp，含有2個(gè)外顯子，ENST00000547549定位于16號染色體，長度677 bp，僅含有1個(gè)外顯子。截止目前，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過高通量基因芯片系統(tǒng)檢測了RCC患者外周血差異表達(dá)的lncRNA與mRNA，且對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)比對芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一些潛在的生物學(xué)分子，但本研究僅為小樣本的研究，存在一定的研究偏倚，尚需大樣本的進(jìn)一步驗(yàn)證及相應(yīng)的分子機(jī)制研究。