元小冬，張萍淑，劉妍，李妍，耿賀梅，王賀永，張淑清，劉青

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是神經(jīng)重癥醫(yī)學(xué)科（Neurological Intensive Care Unit，NICU）患者感染的主要病原菌，多見于呼吸道、泌尿道、血液感染［1-2］。近年耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）逐漸增多，全球耐藥率達(dá)20%～70%，其耐藥基因可由質(zhì)粒介導(dǎo)，通過(guò)轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)等形式傳遞，進(jìn)而形成多重耐藥菌［3］，目前關(guān)于KP的毒力基因特征已成為臨床的研究熱點(diǎn)。全基因組測(cè)序技術(shù)（whole genome sequencing，WGS）能夠直接反映基因組DNA的遺傳信息，對(duì)確定耐藥基因型、預(yù)測(cè)細(xì)菌耐藥表型的特異度、靈敏度較高，能夠較全面地了解病原菌來(lái)源、感染、耐藥、傳播等機(jī)制［3］，為本課題組對(duì)細(xì)菌基因組中攜帶毒力基因與其臨床致病機(jī)制的關(guān)系研究提供了有力的技術(shù)支撐。本課題組在NICU感染患者中篩選出具有特定同源關(guān)系的非多重耐藥KP進(jìn)行全基因組測(cè)序，并應(yīng)用多種生物信息學(xué)軟件在全基因組測(cè)序中篩選出其攜帶的毒力基因，進(jìn)而分析其分布和傳播特征，以期為KP感染的防控提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 樣本來(lái)源 收集2015—2018年開灤總醫(yī)院收治的93例NICU感染患者的非多重耐藥KP 94株。所有KP應(yīng)用K-B法進(jìn)行抗菌藥物敏感試驗(yàn)及脈沖場(chǎng)凝膠電泳法（PFGE）進(jìn)行同源性分析，將相似度為100%視為同一克隆株，相似度≥80%視為同一流行克隆系［4］。選出其中的無(wú)同源性KP 3株，即2015年、2016年、2017年各1株，分別編號(hào)為P20、P39、P66；2018年，選出與P66為同一流行克隆系的KP 2株，分別編號(hào)為P90、P91，且P90與P91為同一克隆株。

1.2 WGS 將5株非多重耐藥KP進(jìn)行二代、三代全基因組測(cè)序，將所得的基因組測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI的prokaryotic annotation pipeline系統(tǒng)，進(jìn)行基因組預(yù)測(cè)基因注釋，并應(yīng)用BLAST軟件進(jìn)行對(duì)比分析，獲取病原菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)（Virulence Factors Datebase，VFDB），比對(duì)基因注釋結(jié)果，篩選條件：一致性＞80%，E值＞0。

2 結(jié)果

2.1 NICU感染患者的臨床特征 在選出的5例NICU非多重耐藥KP感染患者中，男4例，女1例；年齡50～76歲，平均（66.0±10.5）歲；疾病類型：肺炎4例、肺炎+泌尿系統(tǒng)感染1例；抗生素（青霉素類/頭孢類/大環(huán)內(nèi)酯類）用藥種類：1種3例，≥2種2例；侵入性操作：泌尿道插管5例、鼻飼營(yíng)養(yǎng)3例、呼吸機(jī)通氣2例、氣管插管2例、動(dòng)靜脈插管1例、氣管切開1例。

2.2 NICU感染患者非多重耐藥KP的毒力基因類型 將NICU感染患者5株非多重耐藥KP的基因組測(cè)序結(jié)果與VFDB進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5株非多重耐藥KP中共篩選出6大類52種毒力基因，其中黏附類17種（32.7%）、鐵吸收類15種（28.8%）、分泌系統(tǒng)類15種（28.8%）、調(diào)節(jié)類3種（5.8%）、內(nèi)毒素類1種（1.9%）、侵入類1種（1.9%），其中P20攜帶19種（36.5%）、P39攜帶18種（34.6%）、P66攜帶2種（3.8%）、P90攜帶47種（90.4%）、P91攜帶49種（94.2%），見表1。

表1 NICU感染患者非多重耐藥KP的毒力基因類型〔n（%）〕Table 1 Toxicity gene type of non-multiple-resistant KP in patients with NICU infection

2.3 NICU感染患者非多重耐藥KP的毒力基因注釋結(jié)果NICU感染患者非多重耐藥KP的基因注釋結(jié)果顯示：（1）黏附類毒力基因：P90、P91中均檢出fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI、ecpB、ecpE、ecpR、mrkA、mrkB、mrkD、mrkF、yagZ/ecpA、fliY基因各1個(gè)，P20、P39中僅檢出1個(gè)fliY基因，P66未檢出此類毒力基因。（2）鐵吸收類毒力基因：在同一克隆株P(guān)90、P91中均檢出fepB、fepC、fepD、fepG、entA、entB、entS、iroE、ybtA、ybtX、sitB、sitC基因各1個(gè)，P90還檢出1個(gè)ybtT基因，其同一流行克隆系P66檢出iucB、iroC基因各1個(gè)，P20、P39均未檢出此類毒力基因。（3）分泌系統(tǒng)類毒力基因：P20、P39、P90、P91中均檢出ECS88-3547、pulB、pulD、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS基 因 各 1個(gè)，P20、P90、P91均檢出1個(gè)EC55989-3327基因，P20、P39、P91均檢出pulC、pulG基因，P91檢出1個(gè)EC55989-3335基因，P66未檢出此類毒力基因。（4）調(diào)節(jié)類毒力基因：P20、P39、P90、P91中均檢出fur、PMI0229基因各1個(gè)，P90、P91還各檢出1個(gè)phoP基因，P66未檢出此類毒力基因。（5）在P20、P39、P90、P91中均檢出1個(gè)內(nèi)毒素類毒力基因（kdsA基因）和1個(gè)侵入類毒力基因（Z1307基因）。

2.4 NICU感染患者非多重耐藥KP毒力基因表達(dá)的毒力因子 NICU患者非多重耐藥KP全基因組中，黏附類毒力基因表達(dá)的毒力因子包括Ⅰ型菌毛（fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI）、Ⅲ型菌毛（mrkA、mrkB、mrkD、mrkF）、大腸桿菌菌毛 ECP（ecpB、ecpE、ecpR、yagZ/ecpA）、腹膜鞭毛AⅠ139（fliY）；鐵吸收類毒力基因表達(dá)的毒力因子包括腸桿菌素（entA、entB、entS、fepB、fepC、fepD、fepG）、耶爾西菌素（ybtA、ybtT、ybtX）、氣桿菌素（iucB）、沙門菌素（iroC、iroE）、鐵/錳酶轉(zhuǎn)運(yùn)（sitB、sitC）；分泌系統(tǒng)類毒力基因表達(dá)的毒力因子包括Ⅱ型分泌系統(tǒng)（T2SS）（pulB、pulC、pulD、pulG、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS）和Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS）（EC55989-3327、EC55989-3335、ECS88-3547）； 調(diào) 節(jié) 類毒力基因表達(dá)的毒力因子包括Fur（fur）、PhoPQ（phoP）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通透酶（PMI0029）；內(nèi)毒素類毒力基因表達(dá)的毒力因子為L(zhǎng)OS（kdsA）；侵入類毒力基因表達(dá)的毒力因子為OmpA（Z1307）。

3 討論

KP是引發(fā)NICU患者呼吸道感染的主要病原菌，可通過(guò)克隆形式在病房環(huán)境和患者中傳播和定植［5］。KP感染的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，與其攜帶的毒力基因激活后表達(dá)的毒力因子有關(guān)，其主要毒力因子及其傳播形式目前尚不完全明確。

本研究將NICU感染患者5株非多重耐藥KP的基因組測(cè)序結(jié)果與VFDB進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5株非多重耐藥KP中共篩選出52種毒力基因，其中P20攜帶19種（36.5%）、P39攜帶18種（34.6%）、P66攜帶2種（3.8%）、P90攜帶47種（90.4%）、P91攜帶49種（94.2%），可見NICU感染患者的非多重耐藥KP基因組（P90、P91）中存在著大量的毒力基因。本研究結(jié)果還顯示，NICU感染患者的非多重耐藥KP全基因組中檢出6大類共52種毒力基因，其中黏附類毒力基因最多，為17種（32.7%），主要毒力因子包括Ⅰ型菌毛（fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI）、Ⅲ型菌毛（mrkA、mrkB、mrkD、mrkF）、大腸桿菌菌毛ECP（ecpB、ecpE、ecpR、yagZ/ecpA）、腹膜鞭毛AⅠ139（fliY）。Ⅰ型菌毛和Ⅲ型菌毛黏附于宿主黏膜表面或與宿主細(xì)胞進(jìn)行充分接觸是導(dǎo)致KP感染的首要環(huán)節(jié)［6］，其中Ⅰ型菌毛能夠穿過(guò)KP莢膜基質(zhì)向外延伸，并調(diào)節(jié)細(xì)菌對(duì)宿主上皮細(xì)胞的D-甘露糖-敏感性黏附［7］；Ⅲ型菌毛可使KP牢固地黏附于人體呼吸道、消化道和泌尿生殖道等部位的黏膜上皮細(xì)胞，并促使KP在宿主表面形成生物被膜，其中fimH、mrkD基因分別編碼Ⅰ型和Ⅲ型菌毛黏附因子［8-10］，可見KP攜帶的大量黏附類毒力基因是使其黏附、固定于患者各腔道部位上皮細(xì)胞并促進(jìn)生物被膜形成而致病的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，NICU感染患者的5株非多重耐藥KP攜帶的鐵吸收類毒力基因多達(dá)15種（28.8%），主要毒力因子包括腸桿菌素（entA、entB、entS、fepB、fepC、fepD、fepG）、耶爾西菌素（ybtA、ybtT、ybtX）、氣桿菌素（iucB）、沙門菌素（iroC、iroE）、鐵/錳酶轉(zhuǎn)運(yùn)（sitB、sitC）；分泌系統(tǒng)類基因表達(dá)的毒力因子包括Ⅱ型分泌系統(tǒng)（T2SS）（pulB、pulC、pulD、pulG、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS）和Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS）（EC55989-3327、EC55989-3335、ECS88-3547）。研究表明，鐵是細(xì)菌生物代謝、電子傳遞等生命活動(dòng)中重要的氧化還原催化劑［11］。KP無(wú)法在宿主內(nèi)直接獲得鐵元素，其主要通過(guò)分泌鐵載體來(lái)獲取，而鐵載體是細(xì)菌分泌的高親和力的胞外鐵離子螯合劑，可與宿主鐵結(jié)合蛋白釋放的Fe3+相結(jié)合。腸桿菌素作為腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生的一種鄰二苯酚鹽型鐵載體蛋白，與鐵具有較高的親和力，主要通過(guò)結(jié)合血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白中的鐵來(lái)促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)［12］，且KP腸桿菌素合成基因entB的表達(dá)還可促進(jìn)其生物被膜成熟。另外，耶爾西菌素作為混合型鐵載體蛋白，與鐵具有中等親和力［13］，其可在機(jī)體缺鐵狀態(tài)時(shí)激活外膜蛋白FyuA來(lái)促進(jìn)KP生物被膜形成；氣桿菌素是一種氧肟酸鹽與羧酸鹽混合型鐵載體，與鐵親和力不高，但其可高效利用其他細(xì)菌合成的氣桿菌素而發(fā)揮作用［14］。耶爾西菌素、氣桿菌素均可阻斷活性氧產(chǎn)生，間接降低宿主先天免疫細(xì)胞的滅菌能力。沙門菌素及其受體iroN均是由基因簇iroA（iroBCDN）編碼合成，其是一種鄰苯二酚鹽型鐵載體，具有較高的鐵親和力，沙門菌素螯合鐵可促進(jìn)細(xì)菌復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌感染的發(fā)生發(fā)展［15］，其特征性的抗氧化劑作用還可催化產(chǎn)生羥自由基，進(jìn)而加重組織損傷，增強(qiáng)細(xì)菌的致病力。因此，KP攜帶的鐵吸收類基因表達(dá)的毒力因子在促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)、生物被膜成熟、加重組織損傷、感染傳播等方面具有重要作用。

研究表明，細(xì)菌的分泌系統(tǒng)可通過(guò)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特定的生物大分子實(shí)現(xiàn)分泌毒力蛋白等各種生物因子，以適應(yīng)環(huán)境的變化，進(jìn)而使細(xì)菌在宿主內(nèi)定植、繁殖、擴(kuò)散而致病［16］。目前在革蘭陰性菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9種蛋白分泌系統(tǒng)，可根據(jù)分泌系統(tǒng)跨越內(nèi)膜和外膜方式分為單膜鑲嵌分泌系統(tǒng)和雙膜鑲嵌分泌系統(tǒng)，依據(jù)效應(yīng)物的釋放方式可將其分泌機(jī)制分為一步分泌機(jī)制和兩步分泌機(jī)制［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，NICU感染患者非多重耐藥KP攜帶的分泌系統(tǒng)類毒力基因達(dá)15種，主要為Ⅱ型分泌系統(tǒng)（T2SS）和Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS），T2SS主要攜帶pul基因簇（pulB、pulC、pulD、pulG、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS），pul基 因 序 列 中pulC到pulO構(gòu)成了一個(gè)獨(dú)立操縱子，而pulB、pulS位于其附近，可將支鏈淀粉酶分泌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到壁膜間隙，再由12～16個(gè)蛋白組成的精細(xì)分泌裝置將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，完成兩步分泌機(jī)制的過(guò)程［18］。KP可以利用Ⅱ型分泌系統(tǒng)分泌毒力因子，還可為毒力因子生存提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本研究在KP檢出的T6SS主要包括EC55989-3327、EC55989-3335、ECS88-3547基因，均屬于雙膜鑲嵌分泌系統(tǒng)，是一種接觸依賴性蛋白分泌裝置，其效應(yīng)物通過(guò)一步分泌機(jī)制直接從細(xì)胞質(zhì)被靶定至細(xì)胞外或宿主細(xì)胞內(nèi)，可在不同環(huán)境中產(chǎn)生細(xì)菌拮抗，將毒素注射到目標(biāo)細(xì)胞中可避免KP受損、促進(jìn)菌落的形成與定植，進(jìn)而導(dǎo)致宿主感染［19-20］。因此，KP攜帶的Ⅱ型、Ⅵ型分泌系統(tǒng)類毒力基因表達(dá)合成的分泌蛋白不但可為自身提供生存保障，還可進(jìn)一步損傷宿主細(xì)胞功能。

本研究結(jié)果顯示，NICU感染患者的5株非多重耐藥KP全基因組中，共檢出調(diào)節(jié)類毒力基因3種、內(nèi)毒素類毒力基因1種、侵入類毒力基因1種，調(diào)節(jié)、內(nèi)毒素、侵入類毒力基因表達(dá)的毒力因子具有保護(hù)細(xì)菌逃避宿主的免疫殺傷、抵抗巨噬細(xì)胞吞噬及發(fā)揮損傷宿主細(xì)胞功能等作用［21］。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，KP攜帶的黏附類毒力基因除表達(dá)為腹膜鞭毛AⅠ139因子的fliY基因外，其他僅存于以克隆傳播的P90、P91中，提示黏附類毒力基因主要以克隆形式在KP中進(jìn)行傳播。同樣，鐵吸收類毒力基因也僅存于同一流行克隆系的P66、P90、P91中，其中腸桿菌素和耶爾西菌素類的合成基因主要存在于同一克隆株P(guān)90、P91中，而氣桿菌素和沙門菌素類的合成基因主要存在于P90的同一流行克隆系P66中，因此鐵吸收類毒力基因主要以同一流行克隆系形式在KP中進(jìn)行傳播。但并未發(fā)現(xiàn)KP攜帶的分泌系統(tǒng)類、調(diào)節(jié)類、侵入類、內(nèi)毒素類毒力基因傳播與KP的傳代方式有明顯關(guān)系。同時(shí)，本課題組發(fā)現(xiàn)同一克隆KP毒力基因類型明顯多于同一流行克隆系KP，表明以克隆方式傳代的KP具有更強(qiáng)致病毒力的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，且黏附類和鐵吸收類毒力因子是其致病毒力更強(qiáng)的主要原因。

綜上所述，NICU感染患者非多重耐藥KP中攜帶著大量的致病毒力基因，主要為黏附類、鐵吸收類、分泌系統(tǒng)類毒力基因，還有少量的調(diào)節(jié)類、內(nèi)毒素類、侵入類毒力基因。黏附類和鐵吸收類毒力基因以克隆方式進(jìn)行傳播，這也是以克隆方式傳代的KP具有更強(qiáng)致病毒力的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。但本研究為單中心研究，樣本量較少，同時(shí)缺少多重耐藥菌的基因組對(duì)比分析，今后仍需多中心研究進(jìn)一步完善相關(guān)分析。

作者貢獻(xiàn)：元小冬、張萍淑、劉妍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；張萍淑、劉妍進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；劉妍、李妍、耿賀梅、王賀永、張淑清、劉青進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；元小冬撰寫論文，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；劉妍、李妍、劉青進(jìn)行論文的修訂。

本文無(wú)利益沖突。