習瓚娜,裴江蘭,甄永康,王夢芝

（揚州大學動物科學與技術(shù)學院,中國江蘇 揚州 225009）

晝夜節(jié)律存在于生物體內(nèi)多種生理生化過程中,調(diào)節(jié)機體環(huán)境與生理過程之間的相互作用,使生物體能更好地適應(yīng)外界環(huán)境的節(jié)律改變[1]。研究表明,晝夜節(jié)律能夠調(diào)控生物體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收代謝,并影響各種營養(yǎng)物質(zhì)的功能[2～3]。例如:大鼠的體內(nèi)實驗顯示,葡萄糖攝取具有明顯的24 h節(jié)律[4];小鼠腸道中肽轉(zhuǎn)運蛋白1（peptide transporter 1,PEPT1）的表達具有節(jié)律性[5];芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白樣1（brain and muscle ARNT-like 1,Bmal1）基因被證明可以調(diào)節(jié)腸道脂質(zhì)吸收的節(jié)律[6]。晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)多種胃腸功能,包括細胞增殖、免疫穩(wěn)態(tài)、腸道通透性及微生物的平衡和代謝[7～12]。晝夜節(jié)律的破壞會造成多種生理功能的失調(diào),對生物體的健康產(chǎn)生極其嚴重的影響。比如:Bmal1突變的小鼠和Clock（circadian locomotor output cycles kaput）突變的小鼠的胃腸都表現(xiàn)出細胞增殖的紊亂[8～9];Per1（Period1）和 Per2（Period2）基因敲除小鼠的腸道微生物的節(jié)律消失,晝夜節(jié)律被打亂,導致腸道菌群失調(diào)[10～12]。此外,晝夜節(jié)律紊亂會增加消化系統(tǒng)疾病的易感性,如腸道炎癥、十二指腸潰瘍、腸應(yīng)激疾病和胃腸癌癥[13～14]。相關(guān)研究報道,結(jié)腸癌組織中存在Clock基因的突變[15];在小鼠中,晝夜節(jié)律紊亂損害腸道屏障的完整性[16];敲除Clock或Cry（cryptochrome）基因的小鼠比野生小鼠產(chǎn)生更多的促炎細胞因子[17];與白班工人相比,夜班工人感染胃炎和消化性潰瘍的風險較高[18]。因此,晝夜節(jié)律在胃腸中發(fā)揮重要作用,進一步研究生物鐘與消化道營養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝之間的關(guān)系,對調(diào)控機體健康有一定的參考意義。

1 消化道晝夜節(jié)律系統(tǒng)及其對消化循環(huán)的影響

沿胃腸道布的營養(yǎng)傳感器可釋放大量影響胃腸功能、營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)和能量平衡的信號肽[19]。Furuya和Yugari首先在1974年證明了腸道吸收在大鼠中表現(xiàn)出晝夜節(jié)律[20～21]。與早餐后的消化率相比,晚餐后的消化率和腸吸收率要低[22]。研究表明,消化道存在生物鐘基因,這些生物鐘基因參與胃腸功能和活動,如胃排空、結(jié)腸蠕動、胃液分泌和酶的活動[7,23]。Bmal1通過調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng),促進腸上皮24 h節(jié)律的產(chǎn)生[8]。敲除Per1或Per2會改變結(jié)腸的運動節(jié)律,同時敲除Per1和Per2可使小鼠結(jié)腸活動的晝夜節(jié)律消失[24]。有研究發(fā)現(xiàn),嚙齒動物的生物鐘基因在胰腺中也以晝夜節(jié)律的方式表達。針對缺乏生物鐘基因Bmal1的小鼠胰腺進行的研究發(fā)現(xiàn),實驗小鼠存在嚴重的葡萄糖不耐受和胰島素分泌缺陷[25～26]。目前,胰酶淀粉酶和胰蛋白酶分泌的晝夜節(jié)律變化在人類受試者中已被報道[27]。此外,胰島素分泌率也被證明有晝夜節(jié)律性,其中血漿胰島素水平在清晨增加,下午達到峰值,晚上下降[28]。由此可見,消化道的生物鐘基因以晝夜節(jié)律的方式表達,它們可能是胃腸活動的重要調(diào)控因子。

2 晝夜節(jié)律與消化道營養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝

晝夜節(jié)律系統(tǒng)在營養(yǎng)吸收方面起著重要作用,正常的生物鐘系統(tǒng)有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。腸道生物鐘的破壞會影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與節(jié)律性,Pan等[29]研究發(fā)現(xiàn),在小鼠小腸中,轉(zhuǎn)運營養(yǎng)物質(zhì)水解產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運蛋白的mRNA表達具有晝夜節(jié)律,而這些營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白的晝夜節(jié)律在Clock突變小鼠中消失,并且Clock突變小鼠吸收營養(yǎng)物質(zhì)的量也發(fā)生了改變,這說明生物鐘調(diào)控著腸道內(nèi)多種營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。

2.1 葡萄糖吸收代謝的節(jié)律性和調(diào)節(jié)機制

碳水化合物主要由單糖（葡萄糖、果糖和半乳糖）、二糖（乳糖和蔗糖）和多糖（淀粉和纖維素）組成。多糖通過小腸刷狀緣水解酶的作用分解為單糖,腸腔中的單糖被腸上皮細胞吸收,這些單糖通過腸上皮細胞基底外側(cè)的轉(zhuǎn)運蛋白從漿膜側(cè)輸出到腸上皮細胞外,進入血液循環(huán)[30]。鈉葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白1（sodium/glucose cotransporter 1,SGLT1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2（glucose transporter 2,GLUT2）和GLUT5是存在于嚙齒動物小腸中的主要己糖轉(zhuǎn)運蛋白,它們協(xié)同促進腸道中葡萄糖的吸收[31]。

大鼠體內(nèi)實驗顯示,無論是在實驗前1 h禁食還是按照預定的喂養(yǎng)方案喂食,葡萄糖攝取都表現(xiàn)出明顯的24 h節(jié)律[4],這表明在正常喂養(yǎng)條件下,葡萄糖攝取的晝夜節(jié)律與進食模式無關(guān),可能由視交叉上核（suprachiasmatic nucleus,SCN）中的晝夜節(jié)律系統(tǒng)調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn),Sglt1的mRNA表達具有明顯的晝夜節(jié)律[32～33]。此外,Glut2和Glut5的表達也具有節(jié)律性[34～35]。染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）實驗發(fā)現(xiàn),Bmal1與己糖轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的啟動子結(jié)合[35]。以上信息提示,Bmal1可能直接調(diào)節(jié)基因Sglt1、Glut2和Glut5的表達,己糖轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控直接受時鐘基因的控制。

O′brien等[19]在研究鼠胃腸道糖傳感器相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達水平時發(fā)現(xiàn),甜味受體（Tas1r2,Tas1r3,Gnat3,Gnat1）、糖轉(zhuǎn)運蛋白（Sglt1,Glut2,Glut5）和特定糖傳感器（Slc5a4a,Slc5a4b）基因的表達水平分別在舌頭、近端與遠端小腸中最高,生物鐘基因（Cry2/Bmal1）在所有研究區(qū)域均可檢測到活動,盡管SGLT3蛋白的表達未檢測到節(jié)律性,但是Slc5a4a和Slc5a4b基因的表達分別在小腸和胃中顯示出明顯的晝夜節(jié)律性,同時,Tas1r2、Tas1r3和Gnat1在近端小腸中也表現(xiàn)出明顯的表達節(jié)律。這說明,胃腸道糖傳感器基因可能受生物鐘基因調(diào)控,生物鐘基因與營養(yǎng)素相互作用。

2.2 脂質(zhì)吸收代謝的節(jié)律性和調(diào)節(jié)機制

生物鐘在調(diào)節(jié)腸細胞的脂質(zhì)吸收中也起重要作用,越來越多的研究表明,晝夜節(jié)律紊亂會增加脂質(zhì)積累的風險,導致脂質(zhì)吸收受損[36～37]。脂肪從腸腔攝取到腸細胞的主要步驟是膽汁乳化、脂肪酶水解和轉(zhuǎn)運體攝取[38～44]。脂肪酸通過脂肪酸結(jié)合蛋白在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,脂肪酸用于合成三?；视?、磷脂和膽固醇酯,這些脂質(zhì)被包裝成稱為乳糜微粒的脂蛋白[45～46]。乳糜微粒是非常大的富含三?；视偷那蛐晤w粒,含有磷脂和膽固醇,這些顆粒的表面覆蓋有磷脂單層、游離膽固醇和幾種載脂蛋白。乳糜微粒組裝需要兩種蛋白質(zhì):載脂蛋白B（apolipoprotein B,ApoB）和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（microsomal triglyceride transfer protein,MTP）。

有研究表明,脂質(zhì)的吸收在24 h內(nèi)差異顯著,Clock的過表達會顯著降低Mtp的表達[29,47]。CLOCK:BMAL1異二聚體有節(jié)奏地激活小異二聚體伴侶（small heterodimer partner,SHP）,從而抑制Mtp的表達[47]。相關(guān)研究報道,小鼠在夜間吸收的甘油三酯和膽固醇含量明顯高于白天,并且甘油三酯和膽固醇的吸收與ApoB和MTP的表達表現(xiàn)出相關(guān)的晝夜波動[48];小鼠小腸中有晝夜節(jié)律因子Noc（nocturnin）的表達,與Noc+/+小鼠相比,Noc-/-小鼠吸收更少的甘油三酯和膽固醇[49～50];Noc的轉(zhuǎn)錄起始位點上游具有E-box,而CLOCK:BMAL1異二聚體可與這些序列直接結(jié)合[51]。這些研究表明Clock參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運的日常調(diào)控。

此外,Pan等[29]在正常晝夜循環(huán)和自由獲取食物的條件下,還研究了其他參與脂質(zhì)合成和吸收的基因的表達,發(fā)現(xiàn)二脂?；视王；D(zhuǎn)移酶2（diacylglycerol acyltransferase 2,Dgat2）、脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid-binding protein,Fabp）、硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearyl coenzyme A dehydrogenase 1,Scd1）和肪酸合成酶（fatty acid synthase,Fas）的mRNA呈現(xiàn)日變化。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),生物鐘基因參與瘤胃上皮揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid,VFA）代謝的調(diào)控,Clock、Bmal1、Per2 和Per3與單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1/4（monocarboxylate transporter 1/4,Mct1/4）存在顯著的相關(guān)性[52]。綜上可知,晝夜節(jié)律參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成和吸收。

2.3 蛋白質(zhì)吸收代謝的節(jié)律性和調(diào)節(jié)機制

生物鐘基因已被證明可以調(diào)節(jié)腸道肽轉(zhuǎn)運蛋白的節(jié)律[53]。蛋白質(zhì)在消化道中被消化成氨基酸、二肽和三肽,其中,二肽和三肽由PEPT1轉(zhuǎn)運。PEPT1是質(zhì)子依賴的肽共轉(zhuǎn)運蛋白,能夠?qū)+和肽轉(zhuǎn)運到腸上皮細胞中,肽的轉(zhuǎn)運與H+濃度相關(guān),而與細胞內(nèi)肽的濃度無關(guān)。為了能夠有效進行肽的轉(zhuǎn)運,細胞內(nèi)的H+濃度被Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白3（Na+/H+exchanger 3,NHE3）維持在較低水平。該轉(zhuǎn)運蛋白將H+泵入腸細胞,并交換出Na+,使細胞內(nèi)Na+濃度保持較低水平,同時K+-ATP酶泵出Na+,輸入K+。機體通過這些轉(zhuǎn)運蛋白的共同作用促進腸上皮細胞對肽的攝取。所有的肽在腸上皮細胞的細胞質(zhì)中被水解為氨基酸,并通過氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白跨過基底外側(cè)轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)中[54～55]。

大鼠結(jié)腸中Nhe3的表達具有晝夜節(jié)律性[54]。研究報道,Cry1和Cry2敲除小鼠與Clock突變小鼠中Nhe3的mRNA表達均降低[54];Nhe3的啟動子含有一個E-box序列,該序列可被CLOCK:BMAL1異二聚體反式激活,提示Nhe3的這種有節(jié)奏的表達可能是由結(jié)腸生物鐘驅(qū)動的[5,54]。

PEPT1的表達在24 h內(nèi)也會發(fā)生節(jié)律性變化。Pan等[5]檢測了自由進食糖基肌氨酸并保持12 h︰12 h光暗周期的大鼠小腸中PEPT1的每日節(jié)律,發(fā)現(xiàn)PEPT1的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平在20:00時最高,在08:00時最低。但是,Saito等[55]發(fā)現(xiàn),決定Pept1表達的轉(zhuǎn)錄因子SP1和CDX2在24 h內(nèi)沒有表達變化;此外,調(diào)節(jié)Pept1的另一種轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα）的缺乏雖然會降低Pept1的基礎(chǔ)表達水平,但對其每日表達沒有顯著影響[56],這表明它們可能不參與Pept1的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)。Okamura等[56]發(fā)現(xiàn),Dbp（D site of albumin promoter binding protein）的mRNA水平的日常節(jié)律與Pept1的mRNA的節(jié)律相似。此外,該研究團隊確定了Pept1遠端啟動子區(qū)域中的DBP結(jié)合位點,并得出結(jié)論:DBP可能有助于Pept1表達的節(jié)律性變化。另外有研究發(fā)現(xiàn),小鼠胃蛋白酶原的分泌在24 h內(nèi)呈周期性變化,在休息期間達到高峰[57]。同樣,胰液的分泌在大鼠和豬中都有晝夜節(jié)律性[58～59]。

2.4 離子吸收代謝的節(jié)律性和調(diào)節(jié)機制

結(jié)腸介導的電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)受晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)[60]。結(jié)腸的主要功能是吸收水和電解質(zhì),Na+和Cl-的吸收主要反映了兩種轉(zhuǎn)運體的活性,一種是Na+/H+交換器（NHE）,另一種是Cl-/HCO3-交換劑（anion exchanger protein,AE）。研究表明,Nhe3和Ae1的表達具有晝夜節(jié)律,此外,參與NaCl吸收的其他關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白和通道蛋白也受生物鐘基因的調(diào)控,如大鼠結(jié)腸黏膜鈉鉀ATP酶蛋白A1（Atp1a1）、

上皮鈉離子通道蛋白γ（epithelial sodium channel gamma,γEnac）、下調(diào)式腺瘤載體（downregulated in adenoma,Dra）的mRNA表達均表現(xiàn)出晝夜節(jié)律變化[61]。研究報道,血漿醛固酮和γEnac轉(zhuǎn)錄本之間的峰值水平具有相關(guān)性[61],這表明醛固酮可能在γEnac的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。此外,參與NaCl吸收的轉(zhuǎn)運蛋白的表達可能直接受晝夜節(jié)律的控制,有研究發(fā)現(xiàn),CLOCK:BMAL1異二聚體調(diào)控Nhe3啟動子區(qū)域內(nèi)的E-box[54];小鼠中Cry1和Cry2的雙重敲除或Clock的突變均會使Nhe3的mRNA表達降低[54]?？偠灾?生物鐘參與腸道NaCl吸收,對腸道運輸具有重要作用。

3 小結(jié)與展望

營養(yǎng)素的吸收代謝與晝夜節(jié)律聯(lián)系密切,晝夜節(jié)律可調(diào)控消化道多種營養(yǎng)素的吸收及其相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的表達（圖1）。從目前研究結(jié)果來看,生物鐘與消化道營養(yǎng)代謝的互作調(diào)控機制沒有形成網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系,主要體現(xiàn)在以下幾個方面:1）影響機體生物鐘節(jié)律的營養(yǎng)水平、營養(yǎng)代謝產(chǎn)物及參與營養(yǎng)吸收代謝的酶還需進行探索;2）節(jié)律基因調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝相關(guān)因子的位點鑒定尚不能確定;3）生物鐘基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯等不同水平上對消化道的調(diào)控機制還不清楚;4）不同動物上的研究尚不系統(tǒng)。因此,未來應(yīng)從以上幾個方向著手進行深入研究,以了解更多營養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝過程中晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的分子機制。

圖1 調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)代謝的生物鐘機制CLOCK:BMAL1異二聚體與啟動子中的E-box元件結(jié)合激活Per和Cry基因的轉(zhuǎn)錄。PER蛋白和CRY蛋白形成復合物并抑制CLOCK:BMAL1異二聚體的活性,從而抑制其自身表達。CLOCK:BMAL1異二聚體也激活核受體REV-ERBα（reverse erythroblastosis virus α）和視黃素受體相關(guān)的孤兒受體 α （retinoid-related orphan nuclear receptor α,RORα）的轉(zhuǎn)錄,這些轉(zhuǎn)錄因子競爭性地結(jié)合Bmal1和核因子白細胞介素3（nuclear factor interleukin 3,Nfil3）啟動子中的RORE反應(yīng)元件（RORE激活BMAL1和NFIL3的表達,而REV-ERBα抑制BMAL1和NFIL3的表達）。NFIL3和DBP共同調(diào)節(jié)D-box啟動元件（NFIL3負向調(diào)節(jié),DBP正向調(diào)節(jié)）,這兩種因子協(xié)同D-box調(diào)控Per2基因的表達,也調(diào)節(jié)時鐘控制基因（clock-controlled genes,CCGs）,使CCGs的表達具有晝夜節(jié)律。此外,CLOCK:BMAL1異二聚體還調(diào)節(jié)參與營養(yǎng)物質(zhì)代謝的CCGs的晝夜節(jié)律表達。例如:BMAL1與己糖轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因Sglt1、Glut2和Glut5的啟動子結(jié)合,參與糖代謝;CLOCK:BMAL1異二聚體有節(jié)奏地激活SHP,從而使SHP抑制Mtp的表達,參與脂代謝;CLOCK:BMAL1異二聚體與Noc轉(zhuǎn)錄起始位點上游的E-box結(jié)合,參與脂代謝;CLOCK:BMAL1異二聚體反式激活Nhe3啟動子中的E-box序列,調(diào)節(jié)機體蛋白質(zhì)代謝。Fig.1 The biological clock in nutrient metabolism regulationCLOCK:BMAL1 heterodimer combines with the E-box element in the promoter to activate the transcription of Per and Cry genes.PER and CRY proteins form complexes and inhibit the activity of the CLOCK:BMAL1 heterodimer,thus inhibiting its own expression.CLOCK:BMAL1 heterodimer also activate transcription of the reverse erythroblastosis virus α （REV-ERBα）and retinoid-related orphan nuclear receptor α （RORα）,which competitively bind the RORE response elements in the promoters of Bmal1 and nuclear factor interleukin 3（Nfil3）.RORE activates the expression of BMAL1 and NFIL3,while REV-ERBα inhibits their expression.NFIL3 and DBP adjust the D-box element（NFIL3 negative adjustment,DBP positive adjustment）.These two factors cooperate with D-box to regulate the expression of Per2 gene,and also regulate clock-controlled genes（CCGs）,so that CCGs have the circadian rhythm of expression.Furthermore,CLOCK:BMAL1 heterodimer also regulates the expression of circadian rhythm of CCGs involved in nutrient metabolism.Here are some examples:BMAL1 binds to the promoters of Sglt1,Glut2,and Glut5,participating in glucose metabolism;CLOCK:BMAL1 heterodimer activates SHP rhythmically,making SHP inhibit Mtp expression and participating in lipid metabolism;the heterodimer binds to the upstream E-box of Noc transcription start site,participating in lipid metabolism;the heterodimer transactivates the E-box sequence in the Nhe3 promoter,regulating protein metabolism.