王朝江,王世清,李 慧,信艷杰,高春燕

（河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所,中國河北 石家莊 050051）

太歲是一種在中國古籍有記載[1],現(xiàn)代不斷發(fā)現(xiàn)[2],科學(xué)歸屬正在探索的神秘物體[3～4]。1992年發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)代首例太歲被鑒定為“以黏菌為主體的特大型黏菌復(fù)合體”[5],但該結(jié)論又于2010年被作者自我否定[6]。于是,研究者不得不轉(zhuǎn)向探索太歲中存在的其他菌類作為主體菌的可能性。

采用培養(yǎng)方法,研究者在太歲中分離出了絲狀真菌、酵母、細菌[7～9];采用非培養(yǎng)方法,特別是高通量測序技術(shù),研究人員獲知了太歲細菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu),不僅證明太歲中細菌種群多樣性豐富[10],還發(fā)現(xiàn)有11個屬的古菌存在[11],但在不同太歲間檢測到的細菌和古菌的優(yōu)勢屬差別巨大。細菌中檢出的優(yōu)勢屬有Edaphobacter、梭菌屬（Clostridium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）[10]、鹽單胞菌屬（Halomonas）[12],其間沒有相同的屬,即使在兩個形態(tài)近似、產(chǎn)地相同的太歲間也是如此。古菌有相同的優(yōu)勢屬,分別是甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和甲烷球菌屬（Methanosphaera）,但它們在不同太歲間的相對豐度差別很大。這種差異化的結(jié)果不能在不同形態(tài)太歲間建立起以共有菌群為紐帶的聯(lián)系,也不能為分離太歲的主體菌準(zhǔn)確提供目標(biāo)信息。

高通量菌群測定結(jié)果的差別,無疑由所用DNA間的差別決定,而DNA又受其提取方法的影響,對此,已不乏研究報道[13]。本文作者用熱溶解膜過濾方法提取的DNA,重測同一太歲的細菌菌群結(jié)構(gòu),結(jié)果證明:之前采用的常規(guī)材料處理方法,未考慮太歲質(zhì)地如膠、不溶于冷水并含有大量多糖類物質(zhì)（包括聚乙烯醇）的特性,所提取的DNA包含的細菌信息片面,導(dǎo)致測知的菌群結(jié)構(gòu)嚴重失真,真正優(yōu)勢菌群的相對豐度降低或漏檢,非優(yōu)勢菌群則以優(yōu)勢菌群面目出現(xiàn);同時,本文作者還通過設(shè)置不同取樣位置和重復(fù)的方法,從極富多樣性的細菌群落中確定出了優(yōu)勢菌群[14]。目前,尚未有該方法在太歲古菌菌群結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)用的報道。

古菌通常存在于高溫、高鹽、缺氧、強酸、強堿等極端環(huán)境,分離培養(yǎng)的條件苛刻,且生長慢不易觀察[15]。因此,古菌優(yōu)勢菌的分離較細菌更加依賴于高通量測序技術(shù),只有通過多次測定,特別是建立在適合太歲材料特性的DNA提取方法基礎(chǔ)上的測定,才能獲知太歲準(zhǔn)確的古菌優(yōu)勢菌群信息,同時也可進一步證實熱溶解膜過濾方法對已有結(jié)果偏差的修正效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

太歲樣本發(fā)現(xiàn)于河南省三門峽市黃河流域,呈紅褐色和尖圓柱體狀,質(zhì)感如低彈性橡膠,2007年由筆者購回收藏。

1.2 試劑和儀器

十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）（分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠）;2×Taq Master Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）;DNA檢測試劑盒（Qubit 2.0,美國Life公司）。PCR儀（T100,美國Bio-Rad公司）;MiSeq高通量測序平臺（2×300,美國Illumina公司）。

1.3 方法

1.3.1 取樣與DNA提取

在太歲的表里層不同部位做兩次重復(fù)取樣。表層取樣部位位于表皮,深約0.8 cm,取樣前用無菌水和濾紙對外表做清潔處理,樣品編號為SAO2和SAO3;里層取樣部位位于表皮下2～3 cm處,樣品分別編號為SAI2和SAI3。每份樣品濕重0.20 g,切碎后加水水浴溶化,用針頭濾器過濾溶化液,即熱溶解膜過濾法[16],之后切取濾膜用作DNA提取。DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后,送生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.3.2 高通量測序

采用DNA檢測試劑盒測定DNA含量后,使用融合有MiSeq平臺接頭序列和標(biāo)簽（barcode）序列的古菌特異性引物349F和806R,擴增16S rDNA的V3～V4區(qū)。擴增體系和程序見文獻[11]?；厥?個樣品DNA的擴增產(chǎn)物,用DNA檢測試劑盒精確定量,各取10 ng混合后測序。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)處理與深度驗證

用Cutadapt軟件去除測序原始數(shù)據(jù)的接頭,用Pear軟件[17]完成序列拼接,然后按照barcode識別得到各樣本的原始序列（raw reads）。原始序列經(jīng)Prinseq軟件[18]質(zhì)控,去除嵌合體、非擴增區(qū)域序列、低于閾值的BLASTn比對序列[19],得到優(yōu)質(zhì)序列（seq reads）。使用Usearch（version 5.2.236）軟件[20]在97%的相似度水平下將優(yōu)質(zhì)序列聚類為不同的操作分類單元（operational taxonomic unit,OTU）。

利用覆蓋率（Coverage）和香農(nóng)（Shannon）指數(shù)稀疏曲線評價測序數(shù)據(jù)量的合理性。覆蓋率計算公式:C=1-n1/N,式中:n1為只含有1條序列的OTU數(shù)目,N為序列總數(shù)。

1.3.4 古菌多樣性及OTU分布分析

采用α多樣性評價古菌的多樣性及豐度。其中,香農(nóng)指數(shù)、辛普森（Simpson）指數(shù)反映群落物種多樣性,前者數(shù)值越高,或后者數(shù)值越低,則多樣性越高;ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)反映物種豐度,值越大,則豐富度越高。

使用R的韋恩（Venn）圖軟件統(tǒng)計樣品中共有的和獨有的OTU數(shù)目,分析其在樣品間的重疊情況[14,16]。

1.3.5 古菌物種分類及優(yōu)勢菌群構(gòu)成分析

選擇OTU中豐度最高的序列作為代表性序列,用 Na?ve Bayesian assignment算法,對其進行門、綱、目、科、屬等不同水平的分類[21]。相對豐度是各個類群的序列數(shù)占總序列數(shù)的百分比[22]。相對豐度高且樣品間共有的類群被初步確定為優(yōu)勢菌群。為準(zhǔn)確反映物種間的相對豐度差別,該類數(shù)值保留4位小數(shù)。

1.3.6 OTU對優(yōu)勢屬的支撐分析

分析優(yōu)勢屬中OTU的數(shù)目構(gòu)成及其相對豐度,并根據(jù)不同樣品間是否存在共有且占比高的OTU,判定優(yōu)勢屬是否是太歲中古菌的真正優(yōu)勢菌群[14,16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA的提取和擴增

SAO2、SAO3、SAI2、SAI3 等4 個樣品中提取的DNA 的質(zhì)量濃度分別是 7.20 ng/μL、10.36 ng/μL、0.27 ng/μL、2.20 ng/μL,均高于高通量測序需要的最低質(zhì)量濃度（0.05 ng/μL）。樣品DNA及其擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。

圖1 4個樣品中提取的DNA及其擴增產(chǎn)物電泳圖M1:λDNA/HindⅢ單切DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);M2:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000;1～4:SAO2、SAO3、SAI2、SAI3樣品中提取的DNA;5～8:SAO2、SAO3、SAI2、SAI3 的 DNA 擴增產(chǎn)物。Fig.1 Electrophoresis of sample DNAs and amplification productsM1:λDNA/Hind Ⅲ DNA marker;M2:DL2000 DNA marker;1～4:Extracted DNAs from four samples;5～8:DNA amplification products of four samples.

2.2 測序數(shù)據(jù)及深度驗證

高通量測序后獲得的4個樣品的原始序列、質(zhì)控序列（clean reads）和優(yōu)質(zhì)序列的數(shù)目,以及優(yōu)質(zhì)序列聚類為OTU的數(shù)目與文庫覆蓋率見表1。從表1可以看出,里層樣品所含OTU數(shù)目明顯低于表層樣品。如此,若假定太歲為表層生長,可推知其由表至里存在種群消失現(xiàn)象;若為里層生長,則外部的多數(shù)菌對太歲生長非必需,為環(huán)境黏附冗余。覆蓋率指數(shù)均接近1,表明樣本中所有的序列基本被測出,測序結(jié)果能夠代表樣本的真實情況。

表1 4個樣品的序列及OTU數(shù)目信息Table 1 Sequence and OTU numbers of 4 samples

另外,4個樣品的香農(nóng)稀疏曲線趨于平穩(wěn),這也說明測序數(shù)據(jù)量合理,更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量的新物種（圖2）。

圖2 4個樣品的香農(nóng)指數(shù)稀疏曲線Fig.2 The Shannon rarefaction plot of 4 samples

2.3 古菌α多樣性及OTU分布

4個樣品的α多樣性指數(shù)見表2。從表中可以看出,多樣性指數(shù)在樣品間的變化幅度很大,說明各樣品在物種多樣性和豐度上存在巨大差異,多個重復(fù)樣品對獲得正確菌群結(jié)構(gòu)是必需的。此外,SAO2和SAO3的香農(nóng)指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均高于SAI2和SAI3,SAI3的香農(nóng)指數(shù)最低,說明表層樣品的物種多樣性遠高于里層樣品,同時也說明太歲里層的古菌種類單一,且分布極不均衡。

表2 4個樣品的α多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes of 4 samples

OTU在樣本間的重疊和獨有情況見圖3。從圖中可以直觀看出,4個樣品共有OTU只占每個樣品OTU的很少一部分,說明其共有種類少且分布極不均衡。通過核對相對豐度數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)共有的 3 個 OTU（OTU2、OTU63、OTU107）存在超高占比,其占比之和在SAO2、SAO3、SAI2和SAI3樣品中依次為89.950 3%、94.561 7%、71.842 6%、99.588 5%,特別是OTU2,在SAI3中獨占96.811 0%,提示供試太歲中雖然菌群種類多但優(yōu)勢種類突出。

圖3 4個樣品的OTU分布韋恩圖Fig.3 The OTU Venn diagram of 4 samples

2.4 太歲古菌的物種分類及優(yōu)勢類群解析

4個樣品在各分類水平上所含分類單元總數(shù)和百分占比≥0.01%的數(shù)目情況見表3。從表3中可以看出,樣品在各分類水平上的古菌總數(shù),在表里層位置間是表層多于內(nèi)部,重復(fù)間亦有差異;百分占比≥0.01%的古菌數(shù)目在各樣品間的差別,遠小于總數(shù)間的差別,說明供試太歲中有大量極低相對豐度的古菌菌群存在。

表3 4個樣品在門、綱、目、屬分類水平上的古菌數(shù)目分析Table 3 The archaea number in 4 samples at different taxonomy levels

門分類水平上,共檢出16個門。低于0.01%占比的門數(shù)在樣品間相差1～7個,差別最大的是SAO2樣品。SAO2和SAO3共檢出16個門,SAO2中全含,SAO3中僅有8個,存在差異的8個門在SAO2中的占比為0.073 5%,二者共有的8個門在SAO2和SAO3中的占比分別為99.926 5%和100.000 0%。SAI2和SAI3共檢出9個門,表面相差2個,但由于SAI2獨有4個,SAI3獨有2個,所以兩個樣品實際相差6個門;二者共有的3個門在SAI2和SAI3中的占比分別為99.951 9%和99.993 7%。

相對豐度大于1%的門共檢出4個,分別是廣古菌門（Euryarchaeota）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和烏斯古菌門（Woesearchaeota）。SAO2、SAO3、SAI2 和 SAI3 所涉及的數(shù)目分別為4、3、2、2。廣古菌門和奇古菌門為共有門,它們在 SAO2、SAO3、SAI2和 SAI3中的占比之和依次為95.216 9%、97.684 0%、99.935 3%、99.971 5%。廣古菌門在表層中的占比基本與奇古菌門持平,但在里層SAI2和SAI3中的占比分別為72.229 1%、97.181 3%,優(yōu)勢突出。以上信息說明,樣品間共有門的占比具絕對優(yōu)勢,且里層更加突出。

綱水平上共檢出27個綱,低于0.01%占比的綱在SAO2中最多,占總數(shù)的一半。SAO2和SAO3共檢出27個綱,相差17個,均為SAO2獨有,占比之和為0.205 8%;二者共有的10個綱在各自的占比分別為99.794 2%和100.000 0%。SAI2和SAI3共檢出10個綱,表面相差4個綱,但由于SAI2獨有6個,SAI3獨有2個,所以兩個樣品實際相差8個綱;二者共有的4個綱在各自的占比分別為99.927 1%和99.993 7%。

相對豐度大于1%的綱共檢出5個,分別是甲烷桿菌綱（Methanobacteria）、甲烷微菌綱（Methanomicrobia）、奇古菌門未分類綱、未分類綱（unclassified）和烏斯古菌門未分類綱。SAO2、SAO3、SAI2和SAI3所涉及的數(shù)目分別為5、3、3、2,其中,甲烷桿菌綱和奇古菌門未分類綱為共有綱,二者占比之和依次為93.585 0%、97.315 4%、98.500 3%、99.949 4%。另外,甲烷桿菌綱在SAI3中的占比高達97.159 1%,同樣是內(nèi)部占比高于外部。

目分類水平上,共檢出39個目。低于0.01%占比的目在SAO2樣品中最多,為24個。SAO2和SAO3共檢出39個目,表面相差25個目,但由于SAO2獨有26個,SAO3獨有1個,所以兩個樣品實際相差27個目;二者共有的12個目在各自的占比分別為99.790 9%和99.995 2%。SAI2和SAI3共檢出15個目,表面相差7個目,但由于SAI2獨有8個,SAI3獨有1個,所以兩個樣品實際相差9個目;二者共有的6個目在各自的占比分別為99.877 2%和99.996 8%。

相對豐度大于1%的目有6個,分別是甲烷桿菌目（Methanobacteriales）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）、Nitrosopumilales、Nitrososphaerales、未分類目（unclassified）和烏斯古菌綱未分類目。SAO2、SAO3、SAI2 和 SAI3 所包含的數(shù)目分別為 5、3、3、2,其中,甲烷桿菌目和Nitrososphaerales為共有目,二者占比之和依次為91.835 5%、96.346 6%、98.490 4%、99.949 4%。SAO2樣品中共有目占比較低的原因是其單獨含有占比之和為5.668 5%的烏斯古菌綱未分類目等3個目。

屬分類水平上,共檢出64個屬。低于0.01%占比的屬在SAO3和SAI2樣品中占近半,在SAO2中占2/3。SAO2和SAO3共檢出62個屬,表面相差43個屬,但由于SAO2獨有44個,SAO3獨有1個,所以兩個樣品實際相差45個屬;二者共有的17個屬在各自的占比分別為99.683 1%和99.998 4%。SAI2和SAI3共檢出19個屬,表面相差13個屬,但因SAI2獨有14個,SAI3獨有1個,所以兩個樣品實際相差15個屬;二者共有的4個屬在各自的占比分別為99.865 6%和99.998 4%。以上數(shù)據(jù)說明表層和里層中非共有屬的占比極低。

相對豐度大于1%的屬共檢出5個,分別是甲烷桿菌屬、甲烷絲菌屬（Methanothrix）、Nitrosopumilus、亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）和未分類屬（unclassified）,SAO2、SAO3、SAI2 和 SAI3 所涉及的數(shù)目分別為4、3、3、2。5個屬占比之和最低的仍有98.279 9%,其中,甲烷桿菌屬和亞硝化球菌屬為共有屬,二者在SAO2、SAO3、SAI2和SAI3中的占比之和依次為91.654 1%、96.312 8%、98.480 4%、99.944 6%,占絕對優(yōu)勢。此外,甲烷桿菌屬和亞硝化球菌屬的占比在表里層不均衡。前者在SAO2、SAO3、SAI2、SAI3 樣品中的占比分別為44.504 7%、55.526 1%、70.784 2%、97.154 4%,里層明顯高于表層;后者則是表層高于里層（圖4）。

圖4 4個樣品中相對豐度大于1%的屬結(jié)構(gòu)分布圖Fig.4 The column chart of 5 dominant genera with relative abundance higher than 1%

2.5 OTU對優(yōu)勢屬的支撐能力

4個樣品中甲烷桿菌屬和亞硝化球菌屬所包含的OTU數(shù)目、相對豐度位于前兩位的OTU及其占比情況見表4。從表中可以看出,兩個屬均含有眾多OTU,其數(shù)目均是表層多于里層;在每個屬中第一、二位OTU的相對豐度差別極大,第一位OTU的占比近乎等于其所在屬的占比;OTU2在4個樣品的甲烷桿菌屬中的占比均位列第一,同時也是4個樣品的共有OTU;在亞硝化球菌屬中,占比高的OTU63分布在表層,內(nèi)部極少且不共有。上述結(jié)果說明,僅甲烷桿菌屬是有高豐度OTU支撐的真正優(yōu)勢屬,其中優(yōu)勢種明顯,可代表太歲所含古菌的優(yōu)勢菌群。

表4 甲烷桿菌屬和亞硝化球菌屬的OTU分析Table 4 OTU analysis of Methanobacterium and Nitrososphaera in 4 samples

3 結(jié)論

供試太歲所含古菌分屬16個門、27個綱、39個目、64個屬。優(yōu)勢菌群是甲烷桿菌屬,相對豐度在43.859 5%～96.811 0%。

太歲所含古菌的多樣性是表層高于里層,而優(yōu)勢菌群的相對豐度是里層顯著高于表層。

各樣品的菌群在種類和數(shù)量上均存在差別,有大量非共有菌群,其可判定為機會性進入太歲組織中的雜菌。

4 討論

采用熱溶解膜過濾法提取DNA所測得的種群結(jié)構(gòu),較之前的測定結(jié)果[11]變化巨大。大于1%的屬,本次內(nèi)部樣品測得4個,而之前的內(nèi)部樣品測得10個,其中僅甲烷桿菌屬相同,但本次所測的豐度大幅升高。甲烷桿菌屬占比在SAI2和SAI3樣品中分別為70.784 2%、97.154 4%,比之前結(jié)果分別上升39.554 2%和65.924 4%。對于之前測定的占比最高和第三的兩個屬——甲烷球菌屬（34.15%）與甲烷短桿菌屬（17.25%）,前者在本次僅測得1條序列（read）,占比0.001 6%,后者卻未檢測到。此外,和之前結(jié)果相比,本次測定的豐度次高的亞硝化球菌屬的占比也大幅上升,其在SAI2和SAI3樣品中的占比分別為27.696 2%和2.790 2%,而之前的結(jié)果則為0.28%[11]。以上數(shù)據(jù)說明,采用熱溶解膜過濾法提取的DNA,含有太歲中古菌主體菌群的更多信息。主體菌群信息的增加,相對擠占和壓減了非優(yōu)勢菌群的占比,凸顯了正確的菌群結(jié)構(gòu)。另外,本次研究中設(shè)置重復(fù)樣品和著重分析其間共有菌群的方法,非常有助于排除機會性菌的干擾,從而解析出真正的優(yōu)勢菌群。

甲烷桿菌屬作為兩次測定的古菌優(yōu)勢菌群,結(jié)果可信度高,其在形態(tài)和代謝特性上均具有助于太歲形成的可能性。形態(tài)上,甲烷桿菌屬菌體彎曲、鉤形到長桿狀,可以形成長的絲狀體到類球狀體,具備結(jié)團能力[23～25];代謝上,其能產(chǎn)生很多胞外聚合物,電鏡下可觀察到該聚合物從一個細胞的外表面延伸黏附至另一細胞,具備使菌體團塊不易散開的物質(zhì)基礎(chǔ)[26],可以形成絮狀沉淀[24,27]。另外,剖開剛采自池塘污泥的其他柱狀太歲,能觀察到類似氣腔和呈膜片狀的結(jié)構(gòu)（圖5）,說明太歲中有厭氧產(chǎn)氣的菌類存在。

圖5 一柱狀太歲切面出現(xiàn)的氣腔和膜片結(jié)構(gòu)Fig.5 Air cavities and membranes in the section of a columnar Taisui

甲烷桿菌屬和亞硝化球菌屬在太歲中并存,且豐度占比在表里層樣品中呈相反的趨勢,這至少反映二者對氧氣的生理需求有差異。資料顯示,甲烷桿菌屬是嚴格厭氧的,亞硝化球菌屬在低氧環(huán)境下則具有一定耐受能力[28～29],這可使表層組織中亞硝化球菌屬占比較高獲得合理解釋,同時也提示從太歲的表層到內(nèi)部,氧氣濃度呈現(xiàn)出從低氧到無氧的變化。另外,亞硝化球菌還是無泡曝氣生物反應(yīng)器生物膜的組成成分之一[29],而生物膜是一種菌膠團,一定程度上具有太歲狀物質(zhì)的特征。