陸彩萍 楊 銳 駱其君 陳娟娟 張 鵬 王鐵桿 陳海敏

(1. 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院, 寧波 315211; 2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 浙江省海洋生物工程重點實驗室, 寧波 315211;3. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 溫州 325005)

壇紫菜(Neoporphyra haitanensis)作為我國特有的一種暖溫帶大型藻類, 主要在浙江和福建等南方沿海地區(qū)進行栽培, 其年產(chǎn)量約占全國紫菜總產(chǎn)量的75%, 具有非常重要的經(jīng)濟作用[1]。然而, 與其他人工栽培海藻的情況類似, 目前壇紫菜也面臨著抗病性差和種質(zhì)退化等問題[2]。因此, 研究者致力于通過品種選育, 尋找性狀更優(yōu)良、適應(yīng)性和抗病能力強的新品種。

壇紫菜生長經(jīng)歷絲狀體和葉狀體2個世代, 自由絲狀體處于營養(yǎng)生長階段, 在沒有環(huán)境改變的情況下, 其生長狀態(tài)和生化參數(shù)較為穩(wěn)定, 并且培養(yǎng)簡單, 擴增速度快, 常用作種質(zhì)保存的材料[2,3]。同時, 絲狀體也是重要的種質(zhì)材料, 其生長特性與抗逆性能決定了紫菜絲狀體育苗工作的成敗與效益。因此, 在絲狀體階段通過室內(nèi)條件的控制來開展品種/品系的生化指標(biāo)的對比研究, 不僅能準確反映出這些參數(shù)的差異, 開展性狀的關(guān)聯(lián), 還有利于縮短育種過程, 提高育種效率。

生化參數(shù)是體現(xiàn)生物性狀的內(nèi)在指標(biāo)。光合色素通過影響藻類的光合效率, 影響到藻類的生長[4], 與高產(chǎn)特性密切相關(guān); 紅藻糖苷是紅藻重要的滲透壓調(diào)節(jié)物和碳同化前體物質(zhì)[5], 在抗逆性能和同化作用中具有重要意義; 類菌胞素氨基酸(MAAs)在紅藻中起到減少紫外輻射傷害的作用[6],與紅藻糖苷一起關(guān)系到紫菜的耐高溫和干出等逆境適應(yīng); 而激素則是藻類生長發(fā)育和抗病抗逆的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物質(zhì)[7]。這些物質(zhì)是否可以作為種質(zhì)評價的標(biāo)準運用到育種選育評估當(dāng)中, 值得深入探討。

本研究對閔豐1號(MF1)、閔豐2號(MF2)、申福2號(SF2)、浙東1號(ZD1)和浙東2號(ZD2)幾個品種/品系的壇紫菜自由絲狀體的光合色素、光合生長參數(shù)及與抗逆、生長有關(guān)的幾種關(guān)鍵代謝物進行對比分析, 以評估各品種/品系之間的生產(chǎn)性能與這些參數(shù)間的關(guān)系, 為紫菜新品種選育的生化評價體系的提出提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜絲狀體ZD1和ZD2來自浙江省海洋生物工程實驗室; SF2由上海海洋大學(xué)嚴興洪教授贈送;MF1和MF2由集美大學(xué)謝潮添教授贈送; 激素標(biāo)準品, 美國Sigma Aldrich公司。

以添加適量的Ⅲ號營養(yǎng)母液(990 nmol/L KNO3,57 nmol/L K2HPO4, 9 nmol/L FeSO4·7H2O, 54 nmol/L Na2EDTA, 1 nmol/L MnSO4·H2O)的滅菌海水作為自由絲狀體的培養(yǎng)液, 在(20±0.5) ℃, 20 μmol/(m2·s)的光照強度, 25‰的鹽度, 在光照周期12L﹕12D的條件下?lián)u床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速200 r/min)。待生長密度達到0.8 g/L時收集, 進行指標(biāo)檢測。

1.2 儀器與設(shè)備

全波長掃描多功能酶標(biāo)儀, 上海ThermoFisher公司; 液相氧電極, 英國Hansatech公司; 冷凍干燥機(美國LABCONCO公司); TSQ Quantum Access液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng), 美國Thermo Fisher Scientific公司; Hypersil Gold C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 不同品種/品系壇紫菜絲狀體光合色素的檢測

參照Wellburn等[8]的方法提取并測到不同品種/品系壇紫菜自由絲狀體中的葉綠素a(Chl.a)和類胡蘿卜素(Car)含量。以酶標(biāo)儀測定樣品浸提液在750、665、652、510和480 nm處的吸光值, 以100%甲醇作為空白對照。根據(jù)公式計算Chl.a和Car的含量:

式中,A750、A665、A652、A510和A480表示樣品在各波長下的吸光值,V為提取液的體積(mL), FW為絲狀體鮮重(g)。

參照Hemlata等[9]的方法測定不同品種/品系壇紫菜自由絲狀體中藻紅蛋白(PE)和藻藍蛋白(PC)的含量。測定樣品上清液在455、564、592、618和645 nm處吸光值, 以磷酸緩沖液作為空白對照。PE和PC含量的計算公式如下:

式中,A455、A564、A592、A618和A645表示樣品在各波長下的吸光值。

1.4 壇紫菜絲狀體凈光合放氧速率檢測

利用液相氧電極對樣品進行凈光合放氧速率的測定, LED燈提供光源, 光照強度為20 μmol/(m2·s)。稱取絲狀體鮮重約10 mg, 放入2 mL的新鮮培養(yǎng)液中, 培養(yǎng)溫度20℃。方法見參考文獻[10], 通過計算獲得絲狀體的凈光合放氧速率。

1.5 壇紫菜絲狀體生長曲線檢測

將不同品種/品系絲狀體放在100 mL錐形瓶中培養(yǎng), 每隔5天將絲狀體濾出, 稱取絲狀體的濕重, 記為Wt, 計算不同品種/品系壇紫菜絲狀體的相對生長速率(Relative growth rate,RGR, %/d)。RGR的計算公式為:

式中,W0表示初始重量(mg),t表示培養(yǎng)時間(d)。

1.6 壇紫菜絲狀體紅藻糖苷含量檢測

取各品種/品系絲狀體鮮重100 mg, 具體操作參照賴曉娟[11]的方法。根據(jù)不同濃度的紅藻糖苷和異紅藻糖苷繪制標(biāo)準曲線, 計算含量。

1.7 壇紫菜絲狀體MAAs含量檢測

取各品種/品系絲狀體凍干樣品200 mg, 具體操作方法參照文獻[12]。以MAAs標(biāo)準品繪制標(biāo)準曲線, 并計算各樣品中MAAs含量。

1.8 壇紫菜絲狀體激素含量檢測

取各品種/品系絲狀體凍干樣品1 g, 液氮研磨,以10 mL甲醇﹕水﹕甲酸(V﹕V﹕V=15﹕4﹕1)溶液超聲浸提10 min, 再于-20℃避光提取16h。上清液旋蒸并凍干, 以甲醇復(fù)溶, LC-MS檢測參照宋悅等[10]的方法。根據(jù)不同濃度激素標(biāo)準品繪制標(biāo)準曲線, 并計算樣品中植物激素含量。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Pearson相關(guān)性分析各品種/品系絲狀體間相對生長速率與光合色素、凈光合放氧速率、紅藻糖苷及激素的相關(guān)性。

每個實驗設(shè)3個平行(n=3), 采用SPSS 23.0軟件的最小顯著性差異法進行單因素方差分析, 差異顯著水平設(shè)置為P＜0.05, 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準差表示。

2 結(jié)果

2.1 不同品種/品系壇紫菜絲狀體的光合色素

在不同品種/品系的壇紫菜絲狀體中, 光合色素的含量皆以藻紅蛋白和藻藍蛋白為主(表 1)。對比5種絲狀體發(fā)現(xiàn), ZD2及MF1的藻紅蛋白含量較為豐富, 均高于6 mg/g, 而ZD1和MF2中的含量則均低于4 mg/g。對比藻藍蛋白含量, MF2中的含量僅為0.63 mg/g, 而其余4種絲狀體中的藻藍蛋白含量均高于1 mg/g, 且以MF1含量最高。在5種絲狀體中, ZD2的葉綠素a含量最高, 但類胡蘿卜素含量最低; ZD1和MF2中的葉綠素a含量較低但類胡蘿卜素較高。

表1 不同品種/品系壇紫菜絲狀體光合色素含量Tab. 1 The photosynthetic pigments contents of different varieties/strains of conchocelis of N. haitanensis (n=3)

2.2 不同品種/品系壇紫菜絲狀體的凈光合放氧速率

對壇紫菜絲狀體中的凈光合放氧速率進行檢測, 發(fā)現(xiàn)不同品種/品系絲狀體之間差異較大(圖 1)。其中ZD2的凈光合放氧速率相對其他品種/品系顯著較高(P＜0.05), 達到30.96 μmol O2/(g·h), ZD1和SF2相比ZD2顯著較低(P＜0.05), MF1和SF2之間差異不顯著(P＞0.05), 但MF2的凈光合放氧速率和其余4種絲狀體中相比, 顯著較低(P＜0.05), 只有23.07 μmol O2/(g·h)。由此可知, ZD1和ZD2尤其是ZD2的凈光合放氧能力較強, MF2最弱。

圖1 不同品種/品系壇紫菜絲狀體凈光合放氧速率測定Fig. 1 The net photosynthetic oxygen release rate in conchocelis of different varieties/strains of N. haitanensis

2.3 不同品種/品系壇紫菜絲狀體的生長曲線

在最適生長條件下對5種壇紫菜絲狀體進行培養(yǎng), 不同時間取樣檢測其生長情況。圖 2顯示, ZD2和SF2的增長較為迅速, 相對生長速率分別達到0.93和0.81%/d, 最終重量是初始值的1.37倍和1.42倍。ZD2的相對生長速率顯著高于其他幾種(P＜0.05),SF2、MF1及MF2絲狀體之間差異不顯著(P＞0.05),ZD1相對生長速率為0.69%/d, 重量只是初始值的1.3倍, 為5種絲狀體中最低。由此可知, 生長方面ZD2和SF2較占優(yōu)勢, ZD1的生長最為緩慢。

圖2 不同品種/品系壇紫菜絲狀體生長曲線及相對生長速率Fig. 2 Growth curves and relative growth rates of conchocelis of different varieties/strains of N. haitanensis

2.4 不同品種/品系壇紫菜絲狀體中紅藻糖苷含量差異

5個品種/品系絲狀體的紅藻糖苷含量差異較為明顯(圖 3)。在5個品種/品系中, ZD1和ZD2的總紅藻糖苷含量較高, 分別為5.23 mg/g FW和5.82 mg/g。ZD1、ZD2和SF2中以異紅藻糖苷含量為主, 且ZD2中的異紅藻糖苷含量顯著較高(P＜0.05), 為5.38 mg/g含量極低。MF1和MF2中以紅藻糖苷為主, 明顯高于另外3種絲狀體(P＜0.05), 但異紅藻糖苷含量極低。其中MF2的紅藻糖苷顯著高于MF1, 達到2.43 mg/g(P＜0.05)。SF2絲狀體紅藻糖苷含量僅0.31 mg/g。

圖3 不同品種/品系壇紫菜絲狀體中紅藻糖苷含量Fig. 3 The content of floridosides in conchocelis of different varieties/strains of N. haitanensis

2.5 不同品種/品系壇紫菜絲狀體中MAAs含量差異

從圖 4可知, MF2絲狀體中Shinorine和Porphyra-334的含量顯著高于另外4個品種/品系, 分別為4.27 μg/g DW(干重)和18.67 μg/g(P＜0.05)。對比Shinorine含量, 可以看出ZD1和ZD2中含量顯著低于其余3種(P＜0.05), ZD2和SF2的差異不顯著(P＞0.05), MF1含量相對其余3種絲狀體略高(P＜0.05)。對比Porphyra-334含量, 只有MF2中的含量顯著較高(P＜0.05), 其余4種則無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 不同品種/品系壇紫菜自由絲狀體MAAs含量Fig. 4 The content of MAAs of different varieties/strains of conchocelis of N. haitanensis

2.6 不同品種/品系壇紫菜絲狀體的激素含量差異

在5種絲狀體中只檢測到異戊烯腺嘌呤、異戊烯腺苷、反式玉米素核苷和蕓苔素內(nèi)酯四種激素,且以反式玉米素核苷及蕓苔素內(nèi)酯含量最為豐富,其余2種激素含量均小于1 ng/g DW(表 2)。MF1和MF2中的反式玉米素核苷含量顯著低于其余3種絲狀體(P＜0.05), 而ZD2中含量最豐富, 為662.52 ng/g。在5種絲狀體中只有SF2的蕓苔素內(nèi)酯含量低于100 ng/g, 其次是ZD2和ZD1, 而MF1和MF2中的含量顯著高于其余3種(P＜0.05), 分別達到2325.09和6927.66 ng/g。可以看出, ZD和SF的壇紫菜絲狀體含有的反式玉米素核苷較多, 蕓苔素內(nèi)酯較少, 并且ZD的異戊烯腺嘌呤含量相對較少, 而MF含有的主要是蕓苔素內(nèi)酯。

表2 不同品種/品系壇紫菜自由絲狀體中植物激素含量Tab. 2 The content of plant hormones of different varieties/strains of conchocelis of N. haitanensis

2.7 不同品種/品系壇紫菜絲狀體生理指標(biāo)的相關(guān)性

對5個品種/品系絲狀體部分生理指標(biāo)進行相關(guān)性分析, 由圖 5可見, 色素中的藻膽蛋白和葉綠素a與凈光合放氧速率呈低至中度正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r為0.44—0.61,P＜0.01), 藻紅蛋白與相對生長速率呈中度正相關(guān)(r=0.66,P＜0.01), 葉綠素a與相對生長速率高度正相關(guān)(r=0.98,P＜0.01), 然而, 類胡蘿卜素與光合放氧速率及相對生長速率不呈正相關(guān)關(guān)系(r=-0.41和-0.97,P＜0.01); 此外, 壇紫菜絲狀體的凈光合放氧速率與相對生長速率也呈中度正相關(guān)(r=0.54,P＜0.01)。紅藻糖苷和異紅藻糖苷與相對生長速率均無明顯相關(guān)性(r=-0.16和0.26,P＞0.05), 4種檢出的激素中只有反式玉米素核苷與相對生長速率呈中度相關(guān)(r=0.55,P＜0.01), 其余3種激素均無顯著的正相關(guān)性。綜上, 除了類胡蘿卜素外的3種色素, 尤其是葉綠素a, 是影響相對生長速率的關(guān)鍵, 個別激素則存在一定的相關(guān)性, 而紅藻糖苷與生長速率基本不存在相關(guān)性。

圖5 壇紫菜絲狀體不同品種/品系間生理指標(biāo)相關(guān)性分析Fig. 5 Correlation analysis of physiological indexes among conchocelis of different varieties/strains of N. haitanensis

3 討論

壇紫菜的種質(zhì)評價多以產(chǎn)量、抗逆、表型及營養(yǎng)成分指標(biāo)為主。比如SF2表現(xiàn)出明顯的耐高溫、生長快和成熟晚等特性; MF1和MF2具有耐高溫和高產(chǎn)特性; 而ZD1則有葉片厚、產(chǎn)量高和殼孢子放散量高的特性等[13—15]。但這些指標(biāo)偏重于生產(chǎn)性狀的描述, 影響它們內(nèi)在關(guān)聯(lián)的生化指標(biāo)并不明確。有文獻指出, 光合色素與藻類的生長密切相關(guān)[16]; 紅藻糖苷和MAAs是紅藻耐高溫和抗紫外的重要物質(zhì)[17,18]; 而激素對植物的生長發(fā)育和抗逆關(guān)系密切[19,20]。因此, 這些指標(biāo)是否可以用于表征品種/品系間的差異, 需要通過對性狀明確的品種/品系進行比較來獲取信息。

3.1 色素含量對壇紫菜生長的影響

壇紫菜生長及高產(chǎn)的特性與色素的含量和組成有關(guān)。藻膽蛋白是紅藻中的重要捕光色素, 對短波長的藍、綠光有較強吸收[21]。在本研究中, 壇紫菜絲狀體中藻膽蛋白含量高于葉綠素a, 相關(guān)性分析顯示出藻膽蛋白和葉綠素a與凈光合放氧速率和相對生長速率顯著相關(guān), 而凈光合速率也與相對生長速率正相關(guān), 證實藻膽蛋白和葉綠素a的含量與絲狀體的生長密切相關(guān)。這與鐘晨輝等[4]和李映霞等[22]研究發(fā)現(xiàn)的絲狀體光合效率受葉綠素a決定,并受藻膽蛋白影響的結(jié)論相符合。對比5個品種/品系絲狀體中, ZD2、SF2和MF1的藻紅蛋白含量均高于另外2個品種, 且葉綠素a在這3種絲狀體中的含量也較高, 這有利于它們捕獲光能用于光合作用。而ZD2、SF2和MF1相對其他2個品種的相對生長速率也更高。這表明, 同SF2和MF1這2個高產(chǎn)品種[1,14,15,23], 壇紫菜ZD2在絲狀體階段具有明顯的生長優(yōu)勢。

3.2 紅藻糖苷和MAAs在壇紫菜抵御逆境中的影響

紅藻糖苷是大部分紅藻的碳同化前體物質(zhì), 主要調(diào)節(jié)機體的滲透壓、抗氧化及作為細胞壁多糖的合成前體起作用, 并且可以修復(fù)因高溫受損的細胞壁, 紅藻糖苷的合成和積累對壇紫菜應(yīng)對高溫脅迫產(chǎn)生的氧化損傷具有重要意義[5]。在紫菜中, 紅藻糖苷由同分異構(gòu)體紅藻糖苷和異紅藻糖苷組成,ZD1、ZD2和SF2壇紫菜絲狀體中以異紅藻糖苷居多, 而在MF1和MF2中以紅藻糖苷含量居多。已有研究表明, 紅藻糖苷及異紅藻糖苷均能有效清除自由基, 且紅藻糖苷的清除效率更高, 并且在遭受脅迫時紅藻糖苷在代謝上比異紅藻糖苷更為活躍[24],這使得壇紫菜在應(yīng)對熱脅迫時能更快作出響應(yīng)來適應(yīng)高溫, MF品種含有更豐富的紅藻糖苷, 說明其對熱環(huán)境的耐受力更強。MAAs在紅藻中起到吸收紫外線, 減少紫外輻射的作用[6]。在壇紫菜中以Porphyra-334和Shinorine兩種形式為主。研究發(fā)現(xiàn), 除了MF1是以Shinorine為主, 其余幾種都以Porphyra-334為主, 而MF2的MAAs含量高于其他品種/品系。結(jié)合紅藻糖苷的含量差異, 推測MAAS與紅藻糖苷可能共同參與了壇紫菜的干出和高溫的應(yīng)激及耐受反應(yīng)。而MF作為耐高溫和抗紫外輻射的福建品種, 可能與這2個指標(biāo)的高水平有關(guān)。

3.3 激素在壇紫菜生長發(fā)育中的影響

在壇紫菜絲狀體中只檢測到異戊烯腺嘌呤、異戊烯腺苷、反式玉米素核苷和蕓苔素內(nèi)酯4種植物激素, 而在葉狀體中可測到吲哚乙酸、水楊酸、茉莉酸、茉莉酸甲酯、反式玉米素核苷、異戊烯腺苷和異戊烯腺苷7種植物激素[10]。異戊烯腺嘌呤、異戊烯腺苷和反式玉米素核苷都屬于細胞分裂素, 在植物中是促進細胞分裂的激素, 參與植物的生長發(fā)育[25]。蕓苔素內(nèi)酯是植物內(nèi)源生長激素,具有促進細胞的分裂和伸長, 提高植物的生長、產(chǎn)量等作用[26]。絲狀體中缺乏水楊酸、茉莉酸等與抗逆、抗病害相關(guān)的激素, 說明絲狀體的生長環(huán)境相對穩(wěn)定, 主要需要調(diào)節(jié)生長和發(fā)育相關(guān)的激素。5個壇紫菜品種/品系的絲狀體中4種激素含量各有差異, 反式玉米素核苷與生長有一定相關(guān)性, 在ZD2和SF2中含量較高, 而MF1和MF2的蕓苔素內(nèi)酯顯著高于其他品種/品系, 由于幾個品種/品系的選育都有高產(chǎn)的特性, 所以激素與生長的關(guān)系尚不明確。

4 總結(jié)

通過對比5個品種/品系的壇紫菜自由絲狀體的光合色素、凈光合放氧速率和相對生長速率, 以及幾種關(guān)鍵的抗逆相關(guān)化合物, 發(fā)現(xiàn)光合色素中的藻紅蛋白和葉綠素a與生長性狀呈正相關(guān)性, 可以作為高產(chǎn)性狀的評價指標(biāo), 其中含藻紅蛋白豐富的品種/品系能更有效地捕捉深水中的藍、綠光, 更適合深池培養(yǎng); 而葉綠素a含量高的品種可以有效地捕捉紅光, 適合淺池培養(yǎng)。紅藻糖苷和MAAs與壇紫菜的耐高溫和干出時的抗紫外能力有關(guān), 因此這2種物質(zhì)含量較高的品種/品系適合于較高溫的南方水域或淺池培養(yǎng)。蕓苔素內(nèi)酯和反式玉米素核苷可能都具有調(diào)節(jié)生長的作用, 需進一步研究?？傊? 本研究為新品種絲狀體的優(yōu)選和人工培育提出了選育生化指標(biāo)的可行性。