郝 南，農(nóng)德勇，李 鉆，林俊浩，黃桂海，李錫明，李 偉

腫瘤是一種全球范圍內(nèi)威脅人類健康的疾病。一項(xiàng)發(fā)表在Lancet雜志上的研究報(bào)告指出，惡性腫瘤是中國城鄉(xiāng)居民第三大死亡原因[1]。腫瘤增殖失控、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因[2]。3-磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶-1(3-phosphoinositide dependent protein kinase-1,PDK1)是環(huán)磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和環(huán)磷鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)依賴的激酶和蛋白激酶c家族的重要成員，其可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化、成熟等參與胃癌、乳腺癌及卵巢癌的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的過程[3-5]。本課題組的前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，沉默PDK1可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，提示PDK1可能是前列腺癌治療的新靶標(biāo)。鑒此，本研究旨在構(gòu)建PDK1基因的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒載體并鑒定其干擾效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料 本研究實(shí)驗(yàn)所用主要材料見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)主要材料

1.2PDK1-shRNA干擾序列的設(shè)計(jì)與合成 在GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中檢索PDK1基因序列，根據(jù)shRNA引物序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成PDK1-shRNA序列。見表2。

表2 PDK1、PDK1-shRNA、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和重組質(zhì)粒序列

1.3LV3-PDK1-shRNA載體構(gòu)建

1.3.1 載體酶切和去磷酸化 應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I剪切載體質(zhì)粒LV3，加入50 μl蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)體系去磷酸化，切膠回收目的載體。

1.3.2 shRNA序列退火 將合成的shRNA序列用pH=8.0的TE緩沖液(Tris-EDTA buffer solution)溶解，濃度為100 μM。取相應(yīng)的正義鏈和反義鏈寡核苷酸(oligo)序列溶液進(jìn)行退火反應(yīng)。退火后，將模板溶液稀釋50倍，終濃度為200 nM，用于后續(xù)的連接反應(yīng)。

1.3.3 連接反應(yīng) 將載體LV3線性化的酶切產(chǎn)物與shRNA序列進(jìn)行定向連接。

1.3.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 使用制備感受態(tài)細(xì)胞試劑盒將293T細(xì)胞制備成感受態(tài)細(xì)胞并保存于-80 ℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)，將裝有感受態(tài)細(xì)胞的離心管置于冰上解凍，加入10 μl連接產(chǎn)物，復(fù)蘇感受態(tài)細(xì)胞，加入100 μl細(xì)胞懸液均勻涂布于含50 μg/ml氨芐青霉素的LB平板，培養(yǎng)16 h。從平板上挑取克隆菌落，小抽質(zhì)粒，將抽提好的質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I單酶切鑒定，1 h后通過電泳鑒定陽性克隆，將陽性克隆菌群置于裝有5 ml LB培養(yǎng)基(含50 μg/ml氨芐青霉素)的試管中培養(yǎng)16 h，取200 μl陽性克隆對(duì)應(yīng)的菌液送測(cè)序，測(cè)序由南寧維爾凱生物科技有限公司進(jìn)行。將測(cè)序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果符合后將甘油中保存菌種進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，進(jìn)行大量質(zhì)粒抽提以獲得足夠量的重組質(zhì)粒。

1.4LV3-PDK1基因干擾慢病毒的包裝和純化 本研究采用第3代四質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)。將293T細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(每個(gè)平皿接種細(xì)胞數(shù)約為2.0×106～2.5×106)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將慢病毒包裝質(zhì)粒和磷酸鈣混合，加入培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)6～8 h后棄去培養(yǎng)液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集含有病毒顆粒的培養(yǎng)液，離心，過濾沉淀。以25 000 r/min超速離心2 h獲得病毒沉淀。隨后使用預(yù)冷的DMEM重懸病毒沉淀。參考相關(guān)研究[7]，采用氯化銫(CsCl)密度梯度離心法進(jìn)行純化，保存于-80 ℃。

1.5慢病毒滴度測(cè)定 解凍病毒原液，將病毒原液按10倍稀釋三個(gè)梯度，使用逐孔稀釋滴度測(cè)定法對(duì)慢病毒滴度進(jìn)行測(cè)定。通過熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞。參考相關(guān)研究[8]采用如下公式進(jìn)行計(jì)算：病毒滴度(TU/ml)=(轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞數(shù)×熒光百分?jǐn)?shù)×稀釋因子)/(轉(zhuǎn)導(dǎo)體積(ml)，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。

1.6慢病毒感染PC-3細(xì)胞 (1)第1天，準(zhǔn)備細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長期PC-3細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔內(nèi)接種5×104個(gè)細(xì)胞，鋪板時(shí)細(xì)胞的融合率為50%左右，每孔R(shí)PMI 1640培養(yǎng)基體積為100 μl。進(jìn)行病毒感染時(shí)細(xì)胞的融合度約達(dá)70%。(2)第2天，感染細(xì)胞。取出4 ℃保存的慢病毒液，使用臺(tái)式離心機(jī)離心20 s。從培養(yǎng)箱中取出生長狀態(tài)良好的PC-3細(xì)胞，將LV3-PDK1基因干擾慢病毒以5×感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)感染PC-3細(xì)胞，加入濃度為8 μg/ml的凝聚胺(polybrene)以提高病毒的感染效率，混勻后放于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)孵育過夜。(3)第3天，更換培養(yǎng)液。將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換為普通完全培養(yǎng)液。觀察感染后細(xì)胞生長狀態(tài)良好，之后每8～12 h更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至第6天。(4)第6天，感染效率檢測(cè)。在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光，估計(jì)慢病毒感染目的細(xì)胞的效率。參考相關(guān)研究[9]報(bào)道的方法篩選、收集穩(wěn)定感染細(xì)胞，保存于-80 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7real-time RT-PCR法檢測(cè)慢病毒感染細(xì)胞PDK1-mRNA表達(dá)水平 采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA并檢測(cè)純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA 400 ng、5×PrimeScriptTMBuffer 2 μl，以RNase-Free的焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)-H2O補(bǔ)足體積至10 μl。實(shí)驗(yàn)采用的逆轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min。實(shí)驗(yàn)所用real-time RT-PCR反應(yīng)體系為2×Premix ExTaqTM12.5 μl，10 μmol/L PCR上游引物(序列：5′-TGAACTCACCTTCCCACAT-3′)1 μl，10 μmol/L，PCR下游引物(序列：5′-TGAAGCAGCACTGAACACC-3′)1 μl，cDNA 2 μl，以ddH2O補(bǔ)足體積至25 μl。real-time RT-PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，共35次循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后再72 ℃延伸10 min。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，通過2-△△Ct法分析mRNA的表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用單因素方差分析比較各處理組間PDK1 mRNA表達(dá)水平的差異，以LSD-t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1LV3-PDK1-shRNAs質(zhì)粒鑒定結(jié)果 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，挑選6個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR，凝膠電泳后在目的條帶大小的對(duì)應(yīng)區(qū)域有酶切得到的條帶。提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果顯示目的序列與預(yù)期序列一致，證實(shí)載體構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒目標(biāo)序列測(cè)序結(jié)果圖

2.2LV3-PDK1-shRNA慢病毒滴度檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)檢測(cè)，LV3-PDK1-shRNA慢病毒滴度為1×108TU/ml。見圖2。

?原液；?稀釋10倍；?稀釋100倍；?稀釋1 000倍圖2 LV3-PDK1-shRNA慢病毒感染293T細(xì)胞72 h熒光顯微鏡觀察所見(20×)

2.3慢病毒穩(wěn)定感染PC-3細(xì)胞 以MOI值為5的慢病毒感染PC-3細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光。LV3-NC、LV3-PDK1-shRNA慢病毒感染PC-3細(xì)胞的效率均超過85%。見圖3。

?LV3-NC慢病毒液感染細(xì)胞(未顯示熒光)；?LV3-NC慢病毒液感染細(xì)胞(顯示熒光)；?LV3-PDK1-shRNA慢病毒液感染細(xì)胞(未顯示熒光)；?LV3-PDK1-shRNA慢病毒液感染細(xì)胞(顯示熒光)圖3 LV3-NC、LV3-PDK1-shRNA慢病毒感染PC-3細(xì)胞熒光顯微鏡觀察所見

2.4LV3-PDK1-shRNA慢病毒感染PC-3細(xì)胞對(duì)PDK1 mRNA表達(dá)的抑制作用 real-time RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，LV3-NC慢病毒感染PC-3細(xì)胞對(duì)PDK1 mRNA表達(dá)影響不顯著(P>0.05)。LV3-PDK1-shRNA慢病毒感染PC-3細(xì)胞可顯著抑制PC-3細(xì)胞PDK1 mRNA的表達(dá)，其表達(dá)水平低于空白對(duì)照組和LV3-NC慢病毒感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同處理組PC-3細(xì)胞PDK1-mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較圖

3 討論

3.1RNA干擾(RNA interference,RNAi)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一種進(jìn)化保守且高度特異的基因沉默現(xiàn)象。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過特定方式將shRNA或小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并沉默靶基因已成為腫瘤等疾病領(lǐng)域常用的科學(xué)研究手段，也是一種有前景的臨床治療手段[10-12]。慢病毒載體是一類由人類免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)改造的病毒載體，具有低免疫原性、可攜帶拷貝數(shù)較大的目標(biāo)基因、可感染靜止或非靜止細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)外源基因等特性[13-15]。本研究采用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)穩(wěn)定沉默PC-3細(xì)胞PDK1基因。

3.2PDK1是一種由556個(gè)氨基酸組成的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有N端蛋白激酶A、蛋白激酶G、蛋白激酶C(AGC)結(jié)構(gòu)域和C端普列克底物蛋白同源(pleckstrin homology,PH)結(jié)構(gòu)域。其中N端的AGC結(jié)構(gòu)域可細(xì)分為較長的PDK1互作片段(PDK1-interacting fragment,PIF)口袋結(jié)構(gòu)域和較短的活化環(huán)結(jié)構(gòu)域。PDK1在真核細(xì)胞進(jìn)化中高度保守，并被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于哺乳動(dòng)物、果蠅、線蟲和部分植物細(xì)胞內(nèi)[16]自1997年Batty首次發(fā)現(xiàn)PDK1以來，越來越多的證據(jù)表明PDK1通過3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate,PIP3)依賴途徑改變AGC家族蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)等蛋白構(gòu)象并使其活化，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移，發(fā)揮調(diào)控胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答和腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)功能[17-20]。細(xì)胞遷移是胚胎發(fā)育、腫瘤進(jìn)展和血管生成的共同病理生理基礎(chǔ)。近年來，不少研究發(fā)現(xiàn)PDK1在多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。苯并吡干預(yù)肺上皮細(xì)胞可下調(diào)PTEN基因表達(dá)水平，激活PDK1/磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3 kinose,PI3K)通路，增強(qiáng)Akt活化程度，使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[21]。黑色素瘤組織高表達(dá)PDK1，敲除小鼠PTEN基因可顯著降低PDK1水平，黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力被顯著抑制；經(jīng)PDK1抑制劑(PDK1 inhibitor,PDK1i)干預(yù)的野生型小鼠黑色素瘤組織顯著縮小，證實(shí)PDK1在黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]。

3.3前列腺癌是西方國家男性最常見的惡性腫瘤，而我國男性的前列腺癌發(fā)病率和死亡率也呈逐年增加的趨勢(shì)[23]。細(xì)胞糖代謝異常在前列腺癌發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[24]。本課題組的前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，CD44過表達(dá)提高了LNCaP細(xì)胞、PC-3細(xì)胞PDK1的表達(dá)水平；而拮抗CD44可顯著降低PC-3細(xì)胞的葡萄糖代謝水平和氧化應(yīng)激水平，并增加PC-3細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性。這提示PDK1可能在前列腺癌細(xì)胞的能量代謝途徑中發(fā)揮重要作用，但是這種生物學(xué)機(jī)制仍未被完全闡明。

3.4為進(jìn)一步研究PDK1在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其與CD44相關(guān)通路分子表達(dá)水平的調(diào)控關(guān)系，本研究設(shè)計(jì)合成了PDK1干擾序列并連接到LV3載體，并獲得滴度為1×108TU/ml的PDK1 shRNA慢病毒載體，較以往研究具有更高的病毒活性[25-26]，這可能與本研究中用于慢病毒包裝的293T細(xì)胞傳代數(shù)、凍存和復(fù)蘇次數(shù)較少，以及使用了毒性較低的鈣磷轉(zhuǎn)染法等有關(guān)。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，本研究所構(gòu)建PDK1 shRNA慢病毒載體在體外可高效轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞，經(jīng)過為期72 h的持續(xù)觀察，轉(zhuǎn)染后的PC-3細(xì)胞生長、增殖良好，胞質(zhì)豐富，可見高亮綠色熒光。real-time RT-PCR結(jié)果顯示，LV3-shPDK1慢病毒載體干擾效率較高。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建PDK1基因RNAi慢病毒載體，獲得穩(wěn)定沉默PDK1基因的PC-3人前列腺癌細(xì)胞株，為深入研究PDK1在前列腺癌防治中的作用及進(jìn)一步闡明其具體的分子生物學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。