不同煙草品種幼苗對(duì)干旱脅迫的生物學(xué)響應(yīng)

洪以群，胡海軍，吳亞男，景檸檬，王 麗,申 林

(遵義師范學(xué)院，貴州 遵義 563006)

1 引言

煙草(NicotianatabacumL.)，茄科煙草屬植物，是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。貴州省是我國(guó)煙草生產(chǎn)的第二大基地，其年產(chǎn)量約占全國(guó)比重的12%～15%[1]。干旱是由于長(zhǎng)期無(wú)雨或少雨，使得土壤相對(duì)含水量降低，作物水分平衡遭到破壞而減產(chǎn)的農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害。干旱是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的嚴(yán)重問(wèn)題之一。近年來(lái)，大面積周期性降雨量分布嚴(yán)重失衡，以及用水不當(dāng)?shù)染垢珊档某潭冗M(jìn)一步加劇。干旱條件下，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)損失超過(guò)其它逆境所造成損失的總和[2]。

干旱脅迫是指當(dāng)植物根系的吸水量小于植物體內(nèi)生理代謝活動(dòng)的耗水量時(shí)，植物細(xì)胞出現(xiàn)水分虧缺，細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，使得植株的生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝受到影響的現(xiàn)象。干旱脅迫對(duì)植物的危害主要體現(xiàn)在：細(xì)胞活性、器官和組織功能受損，植物體活性氧增加，細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)生變化，最終使得植物個(gè)體或植物群體的生長(zhǎng)受到抑制，形態(tài)發(fā)生變化，生物量和產(chǎn)量都受到了極其嚴(yán)重的負(fù)面影響[3]。陳貴等[4]研究表明，丙二醛是煙草受到干旱脅迫時(shí)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物之一，對(duì)于煙草葉片具有較大的細(xì)胞毒性，能夠引起煙草植株細(xì)胞功能上的紊亂，并且會(huì)對(duì)細(xì)胞中的核酸、蛋白質(zhì)、酶等造成一定程度的破壞；丙二醛含量高低能夠反映出煙草幼苗受到干旱脅迫時(shí)細(xì)胞質(zhì)膜受破壞程度的大小，煙草細(xì)胞膜脂發(fā)生過(guò)氧化作用的強(qiáng)弱。朱鳳榮等[5]研究認(rèn)為，丙二醛較高的煙草品種，其抗旱性相對(duì)較弱。羅占春等[6]研究結(jié)果表明，在干旱脅迫的條件下，煙草植株體內(nèi)的活性氧物質(zhì)不斷升高，且不同品種煙草植株間的變化趨勢(shì)相似，但不同品種煙草幼苗體內(nèi)的活性氧物質(zhì)的變化幅度有所不同。在干旱脅迫的條件下，煙草在抵御氧化脅迫的整個(gè)防御系統(tǒng)中，超氧化物歧化酶是煙草體內(nèi)第一個(gè)清除活性氧的關(guān)鍵酶。覃鵬等[7]研究結(jié)果表明，超氧化物歧化酶相對(duì)活性越高，干旱脅迫對(duì)煙草完成正常生理活動(dòng)的影響越小，該煙草的抗旱性越好。過(guò)氧化氫酶主要存在于植物微體中，與過(guò)氧化物酶同是H2O2的解毒劑，能夠有效控制植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累[8]。此外，過(guò)氧化氫酶還與生長(zhǎng)素、NADH、DADPH等的氧化作用有關(guān)，在植物的代謝過(guò)程中起著非常重要的作用，其活性的高低與植物的代謝強(qiáng)度以及抗性有著極其密切的關(guān)系。由佳輝等[9]研究結(jié)果表明，相對(duì)電導(dǎo)率是用來(lái)衡量植物抗逆性的一個(gè)重要指標(biāo)；相對(duì)電導(dǎo)率越高，細(xì)胞膜的透性越差，干旱脅迫對(duì)煙草細(xì)胞膜的傷害越嚴(yán)重，即植物受到的傷害程度越大，其抗旱性能越差。楊偉強(qiáng)等[10～12]研究認(rèn)為，不同煙草品種幼苗在同等干旱脅迫的環(huán)境中，可溶性糖含量越高，細(xì)胞失水的可能性越小，成活的可能性越大，抗性越高。綜上所述，在干旱脅迫的條件下，不同煙草品種對(duì)干旱脅迫的生物學(xué)響應(yīng)各有不同，但可在一定程度上反映出不同品種的抗逆性。

本試驗(yàn)以亞布力旱煙和云煙87為試驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)其丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、相對(duì)電導(dǎo)率、過(guò)氧化氫酶活性、可溶性糖含量等生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步明確不同煙草品種幼苗對(duì)干旱脅迫的生物學(xué)響應(yīng)，以減輕貴州地區(qū)因干旱脅迫造成煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的降低，充分發(fā)揮該地區(qū)煙草種植的生產(chǎn)潛力，實(shí)現(xiàn)干旱脅迫下農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及大力保障煙草作物經(jīng)濟(jì)安全，為篩選抗旱性能較強(qiáng)的品種提供參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

烤煙品種：云煙87，由云南省煙草科學(xué)研究所提供；亞布力旱煙，由黑龍江省哈爾濱市尚志市提供。

2.2 主要的試驗(yàn)藥品

0.1 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液、蛋氨酸、750 μmol/LNBT、EDTA、20 μmol/L核黃素、石英砂、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(100 μg/mL)、蒽酮試劑、丙酮、無(wú)水乙醇、5%三氯乙酸溶液、0.5%硫代巴比妥溶液、高錳酸鉀、草酸等。

2.3 主要儀器

FA1004型電子分析天平、SHP-150A數(shù)顯生化培養(yǎng)箱、HH-8雙列八孔恒溫水浴鍋、UV752N紫外分光光度計(jì)、DGG-9076A烘箱、TZS-1K-G型號(hào)水分測(cè)定儀。

2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

盆栽試驗(yàn)于2019年7～12月在遵義師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。每盆裝土10 kg，施復(fù)合肥20 g。每個(gè)品種種植12盆。煙草幼苗移栽后，正常澆水，待煙草幼苗生長(zhǎng)至對(duì)水分敏感期，開(kāi)始控制澆水。處理前10 d，使土壤中的含水量占田間最大持水量的50%，使煙草幼苗處于中等干旱程度的脅迫；處理10～20 d，土壤中的含水量占田間最大持水量的30%，使煙草幼苗處于重度干旱脅迫；處理25 d后，對(duì)丙二醛、過(guò)氧化氫酶活性，相對(duì)電導(dǎo)率等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。其他管理措施同大田。

2.5 試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定

2.5.1 丙二醛含量的測(cè)定

硫代巴比妥酸法[13]。取0.5 g葉片加1.0 mL 0.1 mol/L磷酸，少量石英砂，冰浴研磨，定至5.0 mL試管，轉(zhuǎn)移至離心管，并在轉(zhuǎn)速為13000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，取其上清液即為酶提取液。吸1.5 mL酶提取液于刻度試管中，加2.5 mL 0.5%硫代巴比妥酸、5%三氯乙酸溶液，沸水浴10～15 min，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至離心管，于轉(zhuǎn)速為1800 r/min的離心機(jī)中離心10 min，取其上清液于532 nm、600 nm測(cè)定其吸光值。以蒸餾水調(diào)零。

結(jié)果計(jì)算：

MDA含量(μmoL/g)=

(1)

式(1)中：A:反應(yīng)液總濃度(mL);V:提取液總量(mL);a:測(cè)定用提取液量(mL);W:材料重(g); 1.55×10-1:丙二醛微摩不消光系數(shù)。

2.5.2 超氧化物歧化酶活性

鄰苯三酚自氧化法[14]。取0.5 g葉片加1 mL 0.1 mol/L磷酸，少量石英砂，冰浴研磨，定至5.0 mL試管，轉(zhuǎn)移至離心管，并在轉(zhuǎn)速為13000 r/min 4 ℃條件下離心20 min，取其上清液即為酶提取液(表1)。

表1 超氧化物歧化酶活性反應(yīng)體系

結(jié)果計(jì)算：

(2)

式(2)中：A0：照光對(duì)照管的光吸收值(Abs);AS：樣品管的光吸收值(Abs);VT：樣液總體積(mL);V1：測(cè)定時(shí)樣品用量(mL);FW：樣品鮮重(g)。

2.5.3 可溶性糖含量的測(cè)定

蒽酮硫酸法[15]。剪切新鮮煙草葉片樣品0.5 g，放入50 mL的三角瓶中，再加25 mL蒸餾水，沸水浴20 min，冷卻，過(guò)濾入100 mL容量瓶中，用熱水沖洗殘?jiān)鼣?shù)次，定容至刻度。取樣品提取液0.5 mL加蒸餾水0.5 mL，再加蒽酮試劑5.0 mL于試管中搖勻，于620 nm處測(cè)定可溶性糖的吸光值。結(jié)果計(jì)算：

(3)

(4)

2.5.4 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定

電導(dǎo)率法[16]。取大小相當(dāng)?shù)闹参锶~片(盡量保證葉片的完整性，少含莖節(jié))，用自來(lái)水洗干凈后再用蒸餾水沖洗3次，用濾紙吸干表面水分，將葉片剪成適宜長(zhǎng)度的長(zhǎng)條(避開(kāi)主脈)，快速稱取鮮樣3份，每份0.1 g，分別置于10 mL去離子水的刻度試管中，蓋上玻璃塞，用ORIONTDS型電導(dǎo)儀測(cè)定葉片電導(dǎo)率。

結(jié)果計(jì)算：

(5)

式(6)中：R1：室溫下浸泡處理12 h后，浸提液電導(dǎo)率;R2：水浴鍋沸水浴30 min后，冷卻至室溫浸提液電導(dǎo)率。

2.5.5 過(guò)氧化氫酶的測(cè)定

高錳酸鉀滴定法[17]。 酶液提取:稱取剪碎混勻的新鮮煙草葉片1.0 g,置于研缽中，加0.2 g CaCO3和蒸餾水2.0 mL，仔細(xì)研磨成勻漿，移入100 mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度，振蕩片刻，靜止，取上清液10.0 mL移入100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻備用。酶活性測(cè)定: 取100 mL三角瓶6個(gè),編號(hào)。向各瓶準(zhǔn)確加入稀釋后的酶液10.0 mL，立即向4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)瓶中各加入3.6 mol/L H2SO4，5.0 mL以終止酶反應(yīng)，作為空白測(cè)定。然后將各瓶放在20 ℃水浴中保溫。待瓶?jī)?nèi)溫度達(dá)到20 ℃時(shí)，向各瓶準(zhǔn)確加入5.0 mL 0.1 mol/L H2O2搖勻，記錄時(shí)間。5 min后再依次向1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)瓶各加入3.6 mol/L H2SO45.0 mL終止酶反應(yīng)。然后向每瓶各加20%的KI 1.0 mL，3滴鉬酸銨及5滴淀粉指示劑。用0.02 mol/L Na2S2O3滴定至藍(lán)色消失。

結(jié)果計(jì)算：

(6)

式(6)中：A：滴定值(mL);B：樣品滴定值(mL);C：Na2S2O3濃度(mmol/L);a：測(cè)定時(shí)酶液用量(mL);V：酶液總體積(mL);W：樣品重(g);t：反應(yīng)時(shí)間(min); 17：1/2H2O2的毫摩爾質(zhì)量(mg)。 注意:所用K2MnO4溶液及H2O2溶液臨用前要經(jīng)過(guò)重新標(biāo)定。

2.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016對(duì)試驗(yàn)前期數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行整理與分析，利用SPSS24.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，使用Origin8.5進(jìn)行作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 干旱脅迫對(duì)不同煙草品種幼苗丙二醛含量的影響

丙二醛含量的高低可以間接反映出煙草植株膜系統(tǒng)受害程度，以及煙草植株的抗逆性強(qiáng)弱。從圖1可以看出，亞布力旱煙的丙二醛含量為65.43 μmol/g，云煙87的丙二醛含量是45.47 μmol/g，亞布力旱煙的丙二醛含量較云煙87高43.90% μmol/g，差異達(dá)顯著水平。這說(shuō)明，在干旱脅迫的條件下，亞布力旱煙細(xì)胞質(zhì)膜受到破壞的程度明顯高于云煙87，受干旱脅迫的危害程度較重。

圖1 干旱脅迫對(duì)不同煙草品種幼苗丙二醛含量的影響

3.2 干旱脅迫對(duì)不同煙草品種幼苗細(xì)胞膜透性的影響

相對(duì)電導(dǎo)率越高，干旱脅迫對(duì)煙草幼苗葉片細(xì)胞膜的傷害越嚴(yán)重，其抗旱性越差。由圖2可知，亞布力旱煙和云煙87在連續(xù)干旱脅迫的條件下，亞布力旱煙和云煙87的相對(duì)電導(dǎo)率分別為0.42 μs/cm和0.19 μs/cm，亞布力旱煙較云煙87高121.05%，差異達(dá)顯著水平。由此可以看出，云煙87較亞布力旱煙具有更強(qiáng)的抗旱能力。

圖2 干旱脅迫對(duì)不同煙草品種幼苗細(xì)胞膜透性的影響

3.3 干旱脅迫對(duì)不同煙草品種幼苗超氧化物歧化酶活性的影響

在干旱脅迫的逆境中，煙草可通過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)煙草體內(nèi)的活性氧進(jìn)行清除，為煙草完成正常的生理活動(dòng)代謝提供了一定的保障。從圖3可以看出，在干旱脅迫的條件下，云煙87的SOD活性明顯高于亞布力旱煙；其中，亞布力旱煙和云煙87的SOD活性分別為5.89 μ/g、13.13 μ/g，亞布力旱煙較云煙87的SOD活性降低了55.14%，差異達(dá)顯著水平。由此可知，在干旱脅迫的條件下，云煙87的SOD活性所作出的生理響應(yīng)更為顯著，從而提高了云煙87的抗旱性。

圖3 干旱脅迫對(duì)不同煙草品種幼苗超氧化物歧化酶活性的影響

3.4 干旱脅迫對(duì)不同煙草品種幼苗過(guò)氧化氫酶活性的影響

過(guò)氧化氫酶活性的高低與植物的代謝強(qiáng)度及其抗性有著密切的關(guān)系。由圖4可以看出，亞布力旱煙幼苗體內(nèi)的CAT酶活性為1.52 μmol/(g·min)，云煙87的過(guò)氧化氫酶活性為3.21 μmol/(g·min)，亞布力旱煙較云煙87低了52.65%，兩者差異達(dá)顯著水平。這說(shuō)明，在干旱脅迫條件下，云煙87過(guò)氧化氫酶的活性明顯高于亞布力旱煙，其能更好地清除過(guò)氧化氫對(duì)植物體本身造成的傷害，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗旱性。

圖4 干旱脅迫對(duì)不同煙草品種幼苗過(guò)氧化氫酶活性的影響

3.5 干旱脅迫對(duì)不同煙草品種幼苗可溶性糖含量的影響

在逆境中，植物的可溶性糖含量越高，細(xì)胞失水的可能性越小，成活的可能性越大，抗逆性越強(qiáng)。由圖5可以看出，在干旱脅迫的條件下，云煙87的可溶性糖含量明顯高于亞布力旱煙，其值分別為125.99 μg/mL、77.90 μg/mL，亞布力旱煙較云煙87低了38.17%。由此可知，與亞布力旱煙相比，受干旱脅迫的云煙87對(duì)可溶性糖含量具有較強(qiáng)的調(diào)控能力，從而降低了干旱脅迫的危害，這與SOD酶活性和CAT酶活性的變化規(guī)律相一致。

圖5 干旱脅迫對(duì)不同煙草品種幼苗可溶性糖含量的影響

4 結(jié)論與討論

中國(guó)大部分煙區(qū)多位于干旱、半干旱環(huán)境中。由于缺乏必要的灌溉條件，每年總有部分地區(qū)烤煙受旱災(zāi)危害嚴(yán)重。陸德彪等[18]研究表明，干旱脅迫條件下，相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量及抗氧化酶活性等均能夠很好地表征植物抗旱性的強(qiáng)弱。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在干旱脅迫的條件下，亞布力旱煙的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量相對(duì)較高，這可能是由于干旱脅迫使亞布力旱煙細(xì)胞膜受害較為嚴(yán)重，滲透勢(shì)增強(qiáng)，受害程度較重，表現(xiàn)出對(duì)干旱脅迫較弱的適應(yīng)性。

在逆境條件下，過(guò)氧化氫酶及超氧化物歧化酶等是植株體內(nèi)清除活性氧的重要保護(hù)酶。陸德彪等[18]研究表明，在逆境條件下，抗旱性較強(qiáng)的品種通過(guò)快速提高酶的活性，及時(shí)清除細(xì)胞中的過(guò)氧化氫、超氧陰離子自由基等有害物質(zhì)，以避免其對(duì)細(xì)胞造成的過(guò)度損傷。在干旱脅迫條件下，云煙87的CAT酶活性、SOD酶活性均明顯地高于亞布力旱煙，這說(shuō)明云煙87較亞布力旱煙更能夠有效地清除煙草體內(nèi)的活性氧物質(zhì)對(duì)植物體本身造成的傷害，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。此外，在干旱脅迫的條件下，植物體可以通過(guò)提高可溶性糖的含量來(lái)提高細(xì)胞液的濃度，降低其滲透勢(shì)，保持其體內(nèi)的水分，維持正常的生理代謝活動(dòng)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在干旱脅迫的條件下，云煙87的可溶性糖含量明顯高于亞布力旱煙，這與SOD酶活性和CAT酶活性的變化相一致，說(shuō)明云煙87較亞布力旱煙具有更強(qiáng)的自我調(diào)節(jié)能力，以減緩干旱脅迫造成的危害，對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗耐性。