王向英，武欣，張杰，孟會(huì)生，洪堅(jiān)平*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西太谷 030801）

采煤引起地表沉陷給礦區(qū)生態(tài)環(huán)境造成重大影響[1]，土地復(fù)墾是改善礦區(qū)生態(tài)環(huán)境、保護(hù)耕地面積、緩解人地矛盾的重要措施[2]。但工程復(fù)墾后的重構(gòu)土壤，壓實(shí)嚴(yán)重、結(jié)構(gòu)不良、土壤養(yǎng)分和酶活性低、微生物種類少，嚴(yán)重制約礦區(qū)植被生長和生態(tài)恢復(fù)[3-4]。相比傳統(tǒng)復(fù)墾方式投資大、周期長、生態(tài)效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，微生物復(fù)墾中許多微生物具有解磷、解鉀、固氮等功能，可改善植物營養(yǎng)環(huán)境，促進(jìn)復(fù)墾土壤微生物體系恢復(fù)，加快復(fù)墾土壤向農(nóng)業(yè)土壤轉(zhuǎn)變，縮短復(fù)墾周期[5-6]，是目前礦區(qū)土地復(fù)墾新熱點(diǎn)。

山西是煤炭大省，大量采煤沉陷地亟待復(fù)墾。同時(shí)，由于山西石灰性土質(zhì)，磷在土壤中固定能力強(qiáng)，生物有效性低[7-8]，礦區(qū)土壤常因缺磷導(dǎo)致低固氮率，磷素養(yǎng)分成為提升復(fù)墾土壤質(zhì)量的限制因素。解磷微生物可參與土壤中難溶磷的釋放與利用[9]，提高土壤有效磷含量，促進(jìn)植物生長發(fā)育，是維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展重要手段[10]。目前，關(guān)于解磷微生物研究主要集中在解磷菌分離、篩選、解磷能力和解磷機(jī)理方面[11-12]，以及解磷菌劑施用后對(duì)土壤磷素活化和促生作用的評(píng)價(jià)[13-14]，對(duì)解磷菌在土壤中生存和定殖狀況不夠了解，有關(guān)解磷菌在復(fù)墾土壤中定殖情況鮮有報(bào)道。因此，有必要對(duì)解磷菌在復(fù)墾土壤中生態(tài)學(xué)特征深入研究，掌握定殖狀況，為充分發(fā)揮解磷作用，提升復(fù)墾土壤肥力提供理論依據(jù)。

熒光假單胞菌是一種重要根際促生菌[15]，具有抑制病原菌、解磷、固氮能力，可產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）、鐵載體等促進(jìn)植物生長[16-17]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)多有應(yīng)用，但其在復(fù)墾土壤中定殖能力和促生作用尚不清楚。本文以綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記解磷假單胞菌w134和w137，通過盆栽試驗(yàn)，研究w134GFP和w137GFP在玉米根際和非根際土壤中定殖以及對(duì)復(fù)墾土壤磷素活化和玉米生長的影響，以期為山西采煤塌陷區(qū)復(fù)墾土壤生物修復(fù)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤為石灰性褐土，取自山西省襄垣縣采煤塌陷區(qū)的復(fù)墾土壤，pH 8.18，有機(jī)質(zhì)8.4 g·kg-1，全氮0.32 g·kg-1，全磷0.35 g·kg-1，全鉀15.6 g·kg-1，堿解氮12.5 mg·kg-1，有效磷3.28 mg·kg-1，速效鉀84.7 mg·kg-1，取回土壤風(fēng)干后過2 mm篩，混勻備用。

供試肥料：無機(jī)肥為尿素（N，46.6%），過磷酸鈣（P2O5，16%），硫酸鉀（K2O，45%）；有機(jī)肥為腐熟雞糞，其中含有機(jī)質(zhì)27.8%，N 1.68%，P2O51.54%，K2O 0.82%。

供試作物為玉米，品種為大豐。

供試菌株為課題組從山西石灰性土壤中篩選的兩株解磷菌w134和w137，經(jīng)16S鑒定，兩株菌均為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。質(zhì)粒pRTGFP由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)（南農(nóng)）鐘增濤教授惠贈(zèng)，具有氨芐青霉素（Amp）和四環(huán)素（Tet）抗性[18]。采用電擊轉(zhuǎn)化法將pRTGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入w134和w137中，記作w134GFP和w137GFP。

標(biāo)記菌定殖檢測：LB固體培養(yǎng)基滅菌后加入抗生素，制成50μg·mL-1氨芐青霉素和50μg·mL-1四環(huán)素的雙抗平板，平板計(jì)數(shù)法檢測標(biāo)記菌在復(fù)墾土壤中定殖能力。

解磷細(xì)菌選擇性固體培養(yǎng)基（PVK培養(yǎng)基）[18]，用于計(jì)數(shù)復(fù)墾土壤中解磷菌群數(shù)量。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用電擊轉(zhuǎn)化法進(jìn)行w134和w137的GFP標(biāo)記，隨后利用玉米盆栽試驗(yàn)作定殖能力檢測。試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院實(shí)驗(yàn)站大棚中完成，將取回的復(fù)墾土壤風(fēng)干過篩后裝盆，每盆10 kg。試驗(yàn)為雙因素設(shè)計(jì)，4個(gè)施肥處理：不施肥、化肥（CF）、有機(jī)肥（M）、化肥+有機(jī)肥（CFM）；3個(gè)接菌處理：不接菌、w134GFP、w137GFP，共12個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)。按等量氮磷鉀原則施肥，化肥組：每盆施加尿素6.52 g，過磷酸鈣12.5 g，硫酸鉀6.66 g。有機(jī)肥組：每盆施加雞糞148 g?；?有機(jī)肥組：每盆施加肥料為化肥和有機(jī)肥各半。種植前將肥料作為底肥一次性施入。每盆接菌液50 mL，菌體濃度109cfu·mL-1，接菌后土壤中初始菌量0.5×107cfu·g-1土。澆水至土壤最大持水量，待水分平衡1 d后播種。玉米出苗7 d間苗，每盆留長勢一致的3株。出苗35d采集土樣和玉米植株測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

復(fù)墾土壤中標(biāo)記菌和解磷菌數(shù)量檢測：①根際土：采用抖根法收集根際土，取1 g根際土與9 mL無菌水混勻，逐級(jí)稀釋，取10-5、10-6、10-7稀釋度土壤懸濁液100μL涂LB雙抗平板；另取100μL涂PVK平板。30℃培養(yǎng)48 h，觀察根際土壤中標(biāo)記菌和解磷菌群數(shù)量。②非根際土壤：取10 g非根際土與90 mL無菌水混勻，逐級(jí)稀釋，涂布方法同根際土，觀察非根際土壤中標(biāo)記菌和解磷菌數(shù)量。

土壤速效磷采用NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法[19]，土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法[20]。

玉米植株一次性采集，測定玉米株高、株粗和干鮮重。植株全氮采用硫酸—過氧化氫消煮，凱氏定氮法測定；植株全磷采用硫酸—過氧化氫消煮，釩鉬黃比色法測定[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)Excel 2016整理；利用SAS 9.4軟件作雙因素方差分析；并在雙因素方差分析基礎(chǔ)上采用Duncan多重比較法比較所有試驗(yàn)處理間差異[21]，P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)墾土壤中標(biāo)記菌定殖能力和解磷菌群數(shù)量

試驗(yàn)采用電擊轉(zhuǎn)化法將GFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入w134和w137中，熒光顯微鏡可觀察到轉(zhuǎn)化菌體帶有強(qiáng)烈綠色熒光（見圖1），說明GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入w134和w137菌株中且GFP基因成功表達(dá)。w134GFP和w137GFP提質(zhì)粒酶切后電泳見圖2，與南農(nóng)惠贈(zèng)GFP質(zhì)粒酶切后條帶相同。再次證明GFP質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入w134和w137中，可作定殖能力相關(guān)研究。

圖1 w134GFP和w137GFP熒光照片（40×）Fig.1 Fluorescent photos of w134GFP and w137GFP(40×)

圖2 w134GFP和w137GFP質(zhì)粒酶切電泳Fig.2 Enzyme digestion electrophoresis of plasmids w134GFP and w137 GFP

標(biāo)記菌在玉米根際土壤中定殖數(shù)量在104cfu·g-1（見表1）。3個(gè)施肥組中標(biāo)記菌定殖數(shù)量均大于不施肥組，定殖數(shù)量依次為：有機(jī)肥組>化肥組≈有機(jī)+化肥組>不施肥組。其中有機(jī)肥組中標(biāo)記菌定殖數(shù)量最多，M+w137GFP定殖數(shù)量最高，約5.97×104cfu·g-1；M+w134GFP定殖數(shù)量次之，約3.94×104cfu·g-1，分別是單施w137GFP和w134GFP時(shí)定殖數(shù)量5.28倍和3.28倍。在非根際土壤中，除有機(jī)肥組標(biāo)記菌定殖數(shù)量在104cfu·g-1外，其他處理中標(biāo)記菌數(shù)量均在103cfu·g-1左右，比根際土中低一個(gè)數(shù)量級(jí)。

表1 玉米根際和非根際土壤中標(biāo)記菌和解磷菌數(shù)量Table 1 Populations of w134GFP,w137GFP and phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere and non-rhizosphere soil of maize

解磷菌群數(shù)量在根際土中約107cfu·g-1，非根際土中約106cfu·g-1，根際土數(shù)量高于非根際土。與標(biāo)記菌分布狀態(tài)一致，可見根際是微生物活動(dòng)主要場所。不論施肥與否，有無標(biāo)記菌接入，各處理間解磷菌群數(shù)量無數(shù)量級(jí)差異。

2.2 接種解磷菌對(duì)復(fù)墾土壤中有效磷含量、磷酸酶活性的影響

不同處理對(duì)土壤有效磷含量影響見圖3。接種解磷菌對(duì)復(fù)墾土壤有效磷含量影響顯著（P=0.02）。相同施肥條件下，接菌土壤比單施肥土壤有效磷含量高：CF+w134GFP比CF有效磷含量提高11.65%；M+w137GFP比M提高8.89%；CFM+w137GFP比CFM提高10.22%。12個(gè)處理中，土壤有效磷增幅最大是w134GFP和w137GFP，分別比CK中有效磷含量提高32.89%和16.44%?？梢?，解磷菌在4種施肥處理中均表現(xiàn)解磷功能，提高土壤有效磷含量。

圖3 不同處理?xiàng)l件下復(fù)墾土壤中有效磷含量Fig.3 Content of available phosphorus in reclaimed soil under different treatments

圖4為不同處理對(duì)土壤磷酸酶活性影響。盡管接種解磷菌對(duì)土壤磷酸酶影響不顯著（P=0.22），但接菌和施肥兩者交互作用對(duì)土壤磷酸酶影響顯著（P<0.05）。化肥+解磷菌處理的磷酸酶活性顯著低于單施解磷菌，有機(jī)肥+解磷菌處理的磷酸酶活性則高于單施解磷菌。所有處理中，CF+w137GFP處理的磷酸酶活性最低，而M+w134GFP處理的磷酸酶活性最高?？梢姡蕦?duì)接種解磷菌分泌磷酸酶有抑制作用，有機(jī)肥表現(xiàn)促進(jìn)作用。

圖4 不同處理?xiàng)l件下復(fù)墾土壤中磷酸酶活性Fig.4 Phosphatase activity in reclaimed soil under different treatments

2.3 接種解磷菌對(duì)苗期玉米生長的影響

從表2可知，接種解磷菌對(duì)玉米株高影響顯著（P<0.01），在相同施肥處理?xiàng)l件下，接種解磷菌處理比對(duì)應(yīng)單施肥處理效果更佳：w134GFP和w137GFP處理的玉米株高比CK高5.5%~6.7%；CF+w134GFP和CF+w137GFP處理的玉米株高比CF高12.7%~15.8%；CFM+w134GFP和CFM+w137GFP處理的玉米株高比CFM高11.6%~18.4%。類似結(jié)果在玉米株粗、干鮮重上也有體現(xiàn)，表明四種施肥條件下，接種解磷菌均促進(jìn)復(fù)墾土壤中玉米植株生長。

表2 不同處理?xiàng)l件下苗期玉米株高、株粗、干鮮重Table 2 Plant height,plant diameter,dry and fresh weight of maize under different treatments

2.4 接種解磷菌對(duì)玉米植株氮、磷含量的影響

玉米植株含氮量見圖5。接種解磷菌對(duì)玉米含氮量影響顯著（P=0.038），相同施肥條件下，w134GFP和w137GFP處理分別比CK含氮量提高32.05%和37.18%，差異顯著（P<0.05）。3個(gè)施肥組中，解磷菌+施肥處理比對(duì)應(yīng)施肥處理玉米含氮高，其中M+w134GFP處理玉米含氮量最高，為3.07%，比M處理高18.1%。

圖5 不同處理?xiàng)l件下苗期玉米植株含氮量Fig.5 Nitrogen content of maize plant at seedling stage under different treatments

續(xù)表

不同處理?xiàng)l件下玉米植株含磷量見圖6。盡管接種解磷菌對(duì)玉米含磷量影響不顯著（P=0.08），但相同施肥條件下，接菌+施肥處理比對(duì)應(yīng)單施肥處理的玉米含磷含量高。

圖6 不同處理?xiàng)l件下苗期玉米植株含磷量Fig.6 Phosphorus content of maize plant at seedling stage under different treatments

W134GFP和w137GFP處理分別比CK玉米含磷量提高27.96%和12.83%；CF+w134GFP和CF+w137GFP處理分別比CF提高14.28%和16.76%；M+w134GFP和M+w137GFP處 理 分 別 比M提 高54.9%和27.1%；CFM+w137GFP處理比CFM提高4.32%。

3 討論

3.1 標(biāo)記菌在復(fù)墾土壤中的定殖

微生物定殖是指在有土著微生物參與競爭情況下，外來菌株在植物根表或土壤中生長并維持其種群數(shù)量的能力[22]。試驗(yàn)借助GFP標(biāo)記研究解磷假單胞菌w134和w137在復(fù)墾土壤中定殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種35 d，w134GFP和w137GFP在玉米根際和非根際土壤中定殖數(shù)量基本在約103~104cfu·g-1（見表1），這與課題組前期僅在復(fù)墾土壤中35 d定殖數(shù)量一致，再次印證標(biāo)記菌在復(fù)墾土壤中定殖能力。

本文所用解磷菌為熒光假單胞菌，作為一種重要根際促生菌[15]，其主要定殖在根際土壤中。夏楓耿等用luxAB發(fā)光酶基因標(biāo)記熒光假單胞菌PF20001，發(fā)現(xiàn)其主要定殖在以菜心主根為中心，半徑3~4 cm土壤中[23]。張亮等研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌PEF-5#18可定殖于番茄根際，其定殖數(shù)量為根際土壤>根>莖[24]。劉方春等對(duì)假單胞菌YT3作綠色熒光蛋白標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，YT3-gfp主要定殖于櫻桃根際土壤中，根際土壤定殖數(shù)量是非根際土壤8.75~28.77倍[25]。本試驗(yàn)得到相近結(jié)果，w134GFP和w137GFP在根際土壤中定殖數(shù)量高于非根際土?？梢姡瑥?fù)墾土壤的根際環(huán)境更利于菌株定殖，是熒光假單胞菌發(fā)揮其解磷、促生等功能主要場所。

外來微生物引入導(dǎo)致土壤原有微生物群落結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生正向或負(fù)向影響[26]，因此，功能菌株安全性備受關(guān)注。Glandorf等將基因修飾和未經(jīng)修飾的假單胞菌引入田間栽培的小麥根部，發(fā)現(xiàn)接種的熒光假單胞菌對(duì)土壤微生物種群代謝能力、土壤硝化潛能和纖維素分解能力無影響，說明引入熒光假單胞菌對(duì)土壤微生物生態(tài)無顯著影響[27]。張亮等發(fā)現(xiàn)對(duì)接種熒光假單胞菌PEF-5#18對(duì)番茄根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)無顯著影響[24]。試驗(yàn)證明，接入熒光假單胞菌（w134和w137）對(duì)土壤中解磷菌群數(shù)量無顯著影響（見表1），可見w134和w137是相對(duì)安全的功能菌，將在復(fù)墾區(qū)大田試驗(yàn)中繼續(xù)探討未來其對(duì)復(fù)墾土壤微生物多樣性影響。

3.2 解磷菌對(duì)復(fù)墾土壤磷素活化和對(duì)苗期玉米生長的影響

研究報(bào)道添加解磷菌提高土壤速效磷含量，增加植株磷素積累量，增加產(chǎn)量或提高果實(shí)品質(zhì)等。孟會(huì)生等研究發(fā)現(xiàn)解磷菌肥可提高復(fù)墾土壤中磷素有效性，提高玉米產(chǎn)量[7]。喬策策等將高效解磷菌NJAU-B8作盆栽和大田試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌有效促進(jìn)苗期玉米生長，增加玉米產(chǎn)量[12]。Chen等從山西復(fù)墾土壤中篩選得到解磷菌S32，該菌株對(duì)難溶的有機(jī)磷和無機(jī)磷均表現(xiàn)較高溶解能力，可明顯提高復(fù)墾土壤中有效磷含量，顯著提高水稻植株生長量和吸磷量[13]。栗麗等研究發(fā)現(xiàn)，與未接種解磷菌處理相比，解磷菌劑促進(jìn)磷礦粉和磷酸鈣在復(fù)墾土壤中磷的生物有效性，提高盆栽油菜磷素吸收[14]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，單施解磷菌可促進(jìn)玉米生長，增加玉米植株氮磷含量和土壤有效磷含量。而解磷菌+肥料大幅度增加標(biāo)記菌定殖數(shù)量、玉米生長量和土壤有效磷含量。說明在復(fù)墾土壤中單施解磷菌效果有限，需提供相應(yīng)營養(yǎng)，助其有效定殖。Ninwe等研究也證實(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)是影響熒光假單胞定殖首要因素[28]。復(fù)墾土壤養(yǎng)分貧瘠，添加肥料可為解磷菌提供良好載體以及碳、氮等營養(yǎng)物質(zhì)，這些為解磷菌在土壤中有效定殖提供必要條件。因此，從定殖角度講，肥料有助于菌株定殖。僅定殖成功解磷菌才可持續(xù)發(fā)揮解磷作用，促進(jìn)植物生長，實(shí)現(xiàn)復(fù)墾土壤向農(nóng)業(yè)土壤轉(zhuǎn)變，縮短復(fù)墾周期。

4 結(jié)論

a.在玉米生長35 d后采集土壤，可從土壤中檢測到標(biāo)記菌w134GFP和w137GFP，根際土壤中兩株標(biāo)記菌數(shù)量約104cfu·g-1，非根際土壤中兩株標(biāo)記菌數(shù)量約103cfu·g-1，說明解磷假單胞菌w134和w137可在復(fù)墾土壤中有效定殖。

b.接種w134GFP和w137GFP可提高復(fù)墾土壤中有效磷含量和磷酸酶活性，增加苗期玉米的株高、株粗、干鮮重以及玉米植株氮、磷含量，這兩株解磷菌可在復(fù)墾土壤中起到解磷與促生作用。

c.添加有機(jī)肥可為w134GFP和w137GFP提供良好營養(yǎng)條件，促進(jìn)其在土壤中有效定殖和功能發(fā)揮。