高利，賈麗娜，馬天文，王新宇，呂良鈺，于躍，趙明超，劉琳，陳鴻

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江省動(dòng)物疾病發(fā)生機(jī)制與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種普遍發(fā)生于動(dòng)物關(guān)節(jié)的慢性炎癥性疾病，病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退化，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）合成和降解平衡被打破，軟骨下硬化，骨贅形成等一系列變化。臨床癥狀主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛，肌肉萎縮，跛行以及功能障礙等，該病發(fā)生機(jī)制尚不清楚。疾病早期，傳統(tǒng)影像學(xué)檢查變化不明顯，此時(shí)關(guān)節(jié)軟骨ECM已發(fā)生降解，代謝產(chǎn)物出現(xiàn)變化，例如硫酸軟骨素846（Chondroitin sulfate 846，CS846）和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（Cartilage oligomertic matrix protein，COMP）等。因此，尋找一種準(zhǔn)確、便捷的手段確診早期OA至關(guān)重要。

研究表明，促炎細(xì)胞因子白介素1β（IL-1β）在OA發(fā)病機(jī)制中尤為重要，常用于體外試驗(yàn)中模擬其病理環(huán)境[1-3]?；|(zhì)金屬蛋白酶-血小板反應(yīng)蛋白基序（Recombinant a disintegrin and metalloprotein?ase with thrombospondin，ADAMTS）為調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ECM的主要蛋白水解酶，ADAMTS-4分泌增多顯示出對(duì)蛋白多糖合成具有顯著破壞作用。COX-2為合成前列腺素關(guān)鍵酶，在OA軟骨中環(huán)氧合酶（Cyclooxygenase-2，COX-2）顯著表達(dá)，在關(guān)節(jié)破壞中起重要作用[4]，通過(guò)促進(jìn)前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）合成參與炎癥反應(yīng)，COX-2表達(dá)不僅影響正常細(xì)胞功能，還促進(jìn)炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)蛋白多糖代謝失衡和OA發(fā)生[5]。成熟軟骨中只有一種細(xì)胞類(lèi)型即軟骨細(xì)胞，在正常生理?xiàng)l件下可分泌以Ⅱ型膠原、蛋白多糖為主要成分的ECM，使整體關(guān)節(jié)具有穩(wěn)定、固化和抗壓等功能。蛋白多糖覆蓋在Ⅱ型膠原表面，保護(hù)Ⅱ型膠原結(jié)構(gòu)完整和穩(wěn)定。研究表明，ECM發(fā)生降解時(shí)，蛋白多糖降解早于Ⅱ型膠原[6-7]。CS為蛋白多糖主要成分之一，CS846可作為ECM中蛋白多糖降解的生物標(biāo)志物。COMP為凝血栓蛋白家族中一種以分泌型五聚體形式存在的非膠原糖蛋白，發(fā)揮結(jié)合II型膠原纖維和穩(wěn)定纖維網(wǎng)絡(luò)或促進(jìn)纖維原形成作用。

近期研究發(fā)現(xiàn)，由分子介導(dǎo)的基質(zhì)降解反應(yīng)主要涉及的酶MMPs和ADAMTSs在OA患者軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[8-9]。且Luo等研究發(fā)現(xiàn)在大鼠軟骨細(xì)胞中，10 ng·mL-1IL-1β刺激可顯著提高PGE2、COX-2、ADAMTS-5和MMP-13在mRNA及蛋白水平表達(dá)[10]。此外，在大鼠體內(nèi)經(jīng)碘乙酸鈉注射關(guān)節(jié)腔建立的OA模型中，IL-1β可提高血清中軟骨降解產(chǎn)物Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽（Cross-linked Carboxy-terminal telopeptide of type 1 collagen，CTX-I）、II型膠原交聯(lián)羧基末端肽（Cross linked C-telopeptide of type 2 collagen，CTXII）和COMP水平，或通過(guò)前交叉韌帶切除術(shù)（Ante?rior cruciate ligament transection，ACLT）方法建立大鼠OA模型10周后，與對(duì)照組比較，血清中COMP和CS846水平顯著增加[11-12]。Frisbie等研究發(fā)現(xiàn)與單純運(yùn)動(dòng)關(guān)節(jié)相比，OA關(guān)節(jié)滑液CS846和PGE2濃度顯著升高[13]。

上述研究中，大多采用單一時(shí)間和濃度刺激軟骨細(xì)胞，未能說(shuō)明刺激時(shí)間或濃度不同對(duì)炎癥因子和軟骨降解蛋白的影響。本試驗(yàn)采用10 ng·mL-1IL-1β體外培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞，分析IL-1β刺激0、12、24和48 h后對(duì)炎癥因子COX-2和PGE2、軟骨降解酶ADAMTS-4以及ECM降解蛋白CS846和COMP濃度變化，為深入研究OA發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)，也為評(píng)估OA病情并制定合理有效治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)

于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心（哈爾濱，中國(guó)）購(gòu)買(mǎi)14~21日齡Sprague-Dawley大鼠脫頸處死后，于75%酒精燒杯中，浸泡時(shí)間20 min充分消毒。無(wú)菌室生物安全柜內(nèi)獲取大鼠軟骨組織，加入0.25%胰蛋白酶消化，時(shí)間30 min，棄去胰蛋白酶，PBS沖洗3次后剪碎軟骨，加入0.2%Ⅱ型膠原酶搖床振蕩4 h，加入與0.2%Ⅱ型膠原酶等量的DMEM/F12（含10%FBS和1%青+鏈霉素）培養(yǎng)液，終止消化。離心7 min后去除上清，獲取軟骨細(xì)胞，將其加入到DMEM/F12培養(yǎng)液（含10%FBS和1%青+鏈霉素）后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱（設(shè)定條件：37℃，5%CO2）加濕培養(yǎng)。本試驗(yàn)所用試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)均符合東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)倫理審查相關(guān)規(guī)定。

1.2 試驗(yàn)分組

取培養(yǎng)后第2代軟骨細(xì)胞開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。為使試驗(yàn)細(xì)胞處于同一周期時(shí)相，用含0.05%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液饑餓處理并過(guò)夜，將其分為對(duì)照組和模型組。對(duì)照組（10 ng·mL-1IL-1β處理0 h）饑餓處理后直接提取總蛋白和細(xì)胞上清液，模型組則分別用10 ng·mL-1IL-1β進(jìn)行刺激，刺激12、24和48 h后提取總蛋白和細(xì)胞上清液，Western Blot方法檢測(cè)12、24和48 h時(shí)軟骨細(xì)胞ADAMTS-4和COX-2蛋 白 表 達(dá)變 化，ELISA方法檢測(cè)PGE2和細(xì)胞上清液中CS846和COMP水平變化。

1.3 軟骨細(xì)胞鑒定

1.3.1 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖

將原代、1代和2代軟骨細(xì)胞數(shù)目稀釋為2×104·mL-1后接種于六孔板中，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)每孔面積70%~80%時(shí)使用。先將培養(yǎng)液棄去后加入PBS充分沖洗3次，用4%多聚甲醛固定30 min。固定后自來(lái)水沖洗15 min。沖洗結(jié)束后加入甲苯胺藍(lán)工作液在室溫下染色45 min，再次置于蒸餾水中沖洗，中性樹(shù)脂封片，倒置顯微鏡觀察。

1.3.2 免疫熒光檢測(cè)Ⅱ型膠原

將2代軟骨細(xì)胞數(shù)目稀釋為2×104·mL-1后接種于六孔板中，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)每孔面積70%~80%時(shí)使用，將培養(yǎng)液棄去后加入PBS充分沖洗3次，加入4%多聚甲醛固定30 min后棄去，PBS充分沖洗3次，使用0.5%Triton X-100通透20 min。加入3% BSA封閉30 min。再加入200μLⅡ型膠原一抗，置于4℃過(guò)夜。過(guò)夜后加入PBS充分沖洗3次。加入200μL熒光二抗，30 min，37℃避光。然后加入DAPI染劑染細(xì)胞核，避光10 min。PBS沖洗3次，加入抗熒光淬滅封片液，在熒光顯微鏡下觀察。

1.4 軟骨細(xì)胞蛋白提取和濃度測(cè)定

各組軟骨細(xì)胞取出棄去培養(yǎng)液后，加入PBS充分清洗3次，細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)入離心管中，在400 RCF離心5 min，棄上清液。加入RI?PA與PMSF混合液（99∶1），充分混勻后4℃裂解30 min。12 000 RCF離心5 min，離心后保存上清液。取適量蛋白樣本，加入200μL BCA工作液，37℃靜置30 min。用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm處OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣本濃度。

1.5 IL-1β刺激軟骨細(xì)胞后ADAMTS-4和COX-2蛋白表達(dá)

嚴(yán)格按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說(shuō)明書(shū)，配置分離膠和濃縮膠。每個(gè)孔加10μL蛋白樣品進(jìn)行電泳。濃縮膠80 V，分離膠120 V，電泳50 min。將凝膠、NC膜和濾紙按順序放置在轉(zhuǎn)膜夾上轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜取出，轉(zhuǎn)移到含有5%脫脂奶粉中封閉，結(jié)束后用TBST溶液漂洗。漂洗后取出膜分別加入GAPDH、ADAMTS-4和COX-2一抗孵育，4℃過(guò)夜。使用TBST漂洗3次。漂洗結(jié)束后加入至二抗孵育，室溫60 min，再次使用TBST進(jìn)行漂洗3次。最后在膜上滴加ECL顯色液后曝光，即可顯示目的條帶。

1.6 IL-1β刺 激 軟 骨 細(xì) 胞 后PGE2、COMP和CS846表達(dá)

收集10 ng·mL-1IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞0、12、24和48 h后細(xì)胞上清液。具體操作步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒，試劑盒均購(gòu)自廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司。每組樣本檢測(cè)設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，OD值取平均值。用ELISA calc根據(jù)濃度和OD值算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程，擬合模型選用四參數(shù)Logis?tic曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各組PGE2、CS846和COMP濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

GraphPad Prism 8軟件用于統(tǒng)計(jì)分析。各組值表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟骨細(xì)胞鑒定

2.1.1 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖

在軟骨細(xì)胞中，甲苯胺藍(lán)可特異性與軟骨ECM中具有陽(yáng)離子的蛋白多糖結(jié)合呈藍(lán)色或深藍(lán)色。如圖1所示。大鼠原代軟骨細(xì)胞（見(jiàn)圖1A）、1代軟骨細(xì)胞（見(jiàn)圖1B）和2代軟骨細(xì)胞（見(jiàn)圖1C）均被甲苯胺藍(lán)所染色。

圖1 大鼠軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色圖像（×100）Fig.1 Toluidine blue staining image of rat chondrocytes(×100)

2.1.2 免疫熒光檢測(cè)Ⅱ型膠原

如圖2所示，大鼠第2代軟骨細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Ⅱ型膠原圖像。DAPI將細(xì)胞核染成藍(lán)色（見(jiàn)圖2A），Ⅱ型膠原被染成綠色（見(jiàn)圖2B），圖2C表明軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原表達(dá)較多，也證明大鼠軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)成功。

圖2 大鼠軟骨細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Ⅱ型膠原圖像（×200）Fig.2 Immunofluorescence detection of typeⅡcollagen in rat chondrocytes(×200)

2.2 IL-1β刺激軟骨細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)ADAMTS-4和COX-2表達(dá)影響

Western Blot方法檢測(cè)經(jīng)IL-1β處理0、12、24和48 h后軟骨細(xì)胞中ADAMTS-4和COX-2表達(dá)。如圖3所示，與對(duì)照組（0 h）比較，IL-1β刺激大鼠軟骨細(xì)胞12、24和48 h后ADAMTS-4和COX-2蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.05）。其中，IL-1β刺激軟骨細(xì)胞24 h后ADAMTS-4表達(dá)顯著升高（P<0.05），而ADAMTS-4在12和48 h均極顯著升高（P<0.01）。COX-2在IL-1β刺激軟骨細(xì)胞12 h顯著增加（P<0.05），24和48 h均呈極顯著升高（P<0.01），濃度以時(shí)間依賴(lài)性方式增加。

圖3 Western blot檢測(cè)軟骨細(xì)胞內(nèi)ADAMTS-4和COX-2Fig.3 Western blot detection of ADAMTS-4 and COX-2 in chondrocytes

2.3 IL-1β刺激大鼠軟骨細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)PGE2、CS846和COMP表達(dá)影響

與對(duì)照組（0 h）比較，IL-1β刺激大鼠軟骨細(xì)胞12、24和48 h后PGE2表達(dá)隨時(shí)間呈極顯著增加（P<0.01，見(jiàn)圖4A）。與對(duì)照組（0 h）比較，IL-1β刺激大鼠軟骨細(xì)胞12、24和48 h后，細(xì)胞上清中CS846和COMP濃度顯著增加（P<0.05，見(jiàn)圖4B、C），PGE2、CS846和COMP濃度以時(shí)間依賴(lài)方式增加。

圖4 ELISA檢測(cè)軟骨細(xì)胞上清液中PGE2、CS846和COMP濃度Fig.4 Detection of GAG,CS846 and COMP in chondrocyte supernatant by ELISA

3 討論

動(dòng)物OA作為一種不可逆轉(zhuǎn)的慢性疾病，在病理生理學(xué)上有兩個(gè)主要特點(diǎn)，一是關(guān)節(jié)軟骨損傷，二是軟骨下骨硬化[14]。關(guān)節(jié)軟骨是維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定性關(guān)鍵，正常生理?xiàng)l件下，軟骨細(xì)胞可清除壞死退變ECM，不斷分泌大量蛋白多糖和Ⅱ型膠原從而發(fā)揮維持ECM合成和降解平衡的功能，當(dāng)發(fā)生OA時(shí)，關(guān)節(jié)功能遭受?chē)?yán)重破壞，軟骨細(xì)胞代償性活性增加后，因持續(xù)遭受炎癥刺激，釋放膠原酶和聚蛋白多糖酶，進(jìn)一步破壞基質(zhì)，ECM由膠原蛋白構(gòu)成的支架斷裂，蛋白多糖流失，繼發(fā)骨質(zhì)增生。

研究表明IL-1β用于體外刺激軟骨細(xì)胞，可用于模擬軟骨炎癥環(huán)境，但大部分研究?jī)H僅使用IL-1β單一濃度和時(shí)間。梁小弟等在正常人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（NHAC-kn）研究中選用不同濃度IL-1β（1、5、10、15 ng·mL-1）處理24 h以模擬OA體外模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10和15 ng·mL-1IL-1β處理軟骨細(xì)胞后，細(xì)胞活性顯著下降[15]。連俊江等在研究時(shí)采用10 ng·mL-1IL-1β刺激SW982細(xì)胞24 h后建立OA炎癥模型[16]。李安琪等在試驗(yàn)研究中選用10 mg·L-1IL-1β誘導(dǎo)原代軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)3 d模擬OA軟骨細(xì)胞炎癥內(nèi)壞境[17]。呂欣榮等在試驗(yàn)中采用10 ng·mL-1的IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞24 h，制備軟骨細(xì)胞損傷模型[18]?；诖耍狙芯恳?0 ng·mL-1IL-1β刺激軟骨細(xì)胞，觀察誘導(dǎo)0、12、24和48 h后ECM降解相關(guān)蛋白以及軟骨ECM降解蛋白表達(dá)情況。

研究表明炎癥因子IL-1β可上調(diào)MMP-3和MMP-13等ECM降解酶表達(dá)[19-20]，IL-1β可通過(guò)促進(jìn)軟骨降解酶表達(dá)從而對(duì)軟骨基質(zhì)造成嚴(yán)重?fù)p害，加重疾病進(jìn)程。Sawaji等研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-5表達(dá)受到炎癥因子影響，IL-1β可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞中ADAMTS-5和MMPs mRNA及蛋白的表達(dá)，促進(jìn)軟骨損傷[21]。此外，在大鼠軟骨細(xì)胞中IL-1β處理后可顯著提高炎癥細(xì)胞因子NO、PGE2、TNF-α、IL-6、COX-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平，并提高軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解酶MMP-13和ADAMTS-5 mRNA及蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明隨著IL-1β刺激，COX-2表達(dá)持續(xù)上調(diào)，對(duì)OA炎性反應(yīng)作用持續(xù)加重，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能障礙[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β刺激大鼠軟骨細(xì)胞48 h內(nèi)可顯著提高軟骨細(xì)胞中AD?AMTS-4和COX-2表達(dá)，與上述結(jié)論一致。另外，石婷等采用膠原酶注射關(guān)節(jié)腔方法制成兔OA動(dòng)物模型后，每隔兩周檢測(cè)兔血清中PGE2和COX-2時(shí)發(fā)現(xiàn)，造模組2、4、6、8、10和12周PGE2和COX-2水平均高于對(duì)照組，且COX-2含量整體呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明血清中PGE2和COX-2含量可反應(yīng)OA病情發(fā)展[25]。本研究中，經(jīng)10 ng·mL-1IL-1β處理0、12、24和48 h軟骨細(xì)胞中ADAMTS-4、PGE2和COX-2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ADAMTS-4、COX-2和PGE2表達(dá)顯著增多，并且COX-2和PGE2表達(dá)增多呈時(shí)間依賴(lài)性，提示OA炎癥隨時(shí)間變化愈發(fā)加劇。

COMP為構(gòu)成ECM的非膠原糖蛋白，從軟骨中分離出來(lái)并在多種組織中表達(dá)，如肌腱、韌帶、滑膜、肌成纖維細(xì)胞和活化血小板等[26]，通過(guò)結(jié)合Ⅰ、Ⅱ和Ⅸ型膠原從而發(fā)揮穩(wěn)定的ECM作用。研究表明在OA患者關(guān)節(jié)液和血清中，COMP含量增加且顯著高于對(duì)照組[27]。陳志偉等通過(guò)隴中骨刺膏治療OA患者后發(fā)現(xiàn)，2、4周兩組血清COMP較治療前顯著降低，說(shuō)明COMP可作為藥物治療OA判斷指標(biāo)，用于了解OA病情程度[28]。仍有研究顯示，在常規(guī)X線(xiàn)未能檢測(cè)到膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的OA早期，血清中COMP水平已經(jīng)升高[29]，表明體液中COMP水平變化發(fā)生于臨床影像學(xué)診斷之前，在早期診斷方面具有一定參考價(jià)值。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在瑞典溫血馬患病關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)液中，COMP含量呈上升趨勢(shì)[30]。說(shuō)明OA與COMP含量具有相關(guān)性，并呈正比例關(guān)系。此外，在馬OA腕關(guān)節(jié)滑膜中，CS846含量顯著高于對(duì)照組，并且在血清中CS846水平顯著升高[31]，說(shuō)明CS846可以預(yù)示OA的發(fā)生發(fā)展情況。本次試驗(yàn)研究中，相比對(duì)照組，10 ng·mL-1IL-1β刺激軟骨細(xì)胞48 h內(nèi)，ECM降解蛋白COMP和CS846表達(dá)顯著增多，并呈時(shí)間依賴(lài)性。與上述研究結(jié)果相符，說(shuō)明IL-1β加速軟骨退變，ECM中蛋白多糖和膠原發(fā)生降解，并且膠原蛋白和蛋白多糖相互構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)遭到破壞，導(dǎo)致軟骨損傷加劇。

綜上所述，本文通過(guò)IL-1β刺激大鼠軟骨細(xì)胞模擬OA體外炎癥環(huán)境，結(jié)果顯示10 ng·mL-1的IL-1β刺激0、12、24和48 h后炎癥細(xì)胞因子COX-2和PGE2、ECM降解產(chǎn)物CS846和COMP濃度以時(shí)間依賴(lài)性升高，ADAMTS-4表達(dá)顯著增加。