姚玉昌，趙多維，肖十雨，盧暢，亓美玉

（1.黑龍江普通高等學(xué)校動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086）

脂肪酸（Fatty acid，F(xiàn)A）是由偶數(shù)個碳原子組成的直鏈脂肪族羧酸，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信使傳遞[1]、影響部分關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄[2]，對細(xì)胞代謝存在直接調(diào)控作用。脂肪酸按其碳鏈長度可分為短鏈（2-4 C）、中鏈（6-10 C）及長鏈（12-26 C）脂肪酸，按其飽和度又可分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。研究表明，高濃度長鏈飽和脂肪酸具有一定細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)炎性因子過量表達(dá)[3]、ROS產(chǎn)生、細(xì)胞自噬和凋亡通路的激活[4]；而長鏈n-3多不飽和脂肪酸則具有一定程度緩解作用[5]。棕櫚酸（Palmitic acid，PA）作為一種典型長鏈飽和脂肪酸，具有較強(qiáng)的脂毒性作用，可引起細(xì)胞內(nèi)過度炎癥反應(yīng)[6]和氧化應(yīng)激[7]。亞麻酸（Linoleic acid,LNA）作為一種n-3類多不飽和脂肪酸，可緩解過度炎癥反應(yīng)[8]，改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)[9]。

Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）作為一種模式識別受體，可特異性識別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖（LPS）成分，激活MyD88依賴和非依賴信號通路，在多種細(xì)胞中誘發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激、自噬和凋亡等生物學(xué)反應(yīng)[10-12]。TLR4基因除可被LPS激活外，其還可被長鏈飽和脂肪酸激活，進(jìn)一步活化其下游信號通路[13]，誘發(fā)細(xì)胞中過度炎癥和氧化應(yīng)激產(chǎn)生[14]。前期研究結(jié)果表明，在活體水平上高濃度PA可誘發(fā)綿羊單核巨噬細(xì)胞和脂肪組織中炎性因子表達(dá)上調(diào)，激活TLR4基因下游MyD88依賴信號通路，但TLR4基因確切介導(dǎo)作用仍不明確[15]。

因此，本研究分離培養(yǎng)綿羊單核巨噬細(xì)胞，揭示PA處理后細(xì)胞中炎性因子表達(dá)和氧化應(yīng)激水平變化趨勢，探討TLR4基因在此過程中介導(dǎo)作用，分析LNA可能存在的緩解效應(yīng)，為闡明長鏈飽和脂肪酸調(diào)控免疫細(xì)胞代謝相關(guān)機(jī)制提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及樣品收集

選擇健康、體況良好18~21月齡德國肉用美利奴公羊6只，飼養(yǎng)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)綿羊新品種培育基地，每日提供全價(jià)精飼料0.5 kg，自由采食羊草，自由飲水。頸靜脈采集全血50 mL，置于含有肝素的抗凝管中，用于單核巨噬細(xì)胞分離。

1.2 脂肪酸：BSA絡(luò)合物制備

將0.2 g PA加入至1 mL無水乙醇中溶解，作為儲存液；利用預(yù)熱槍頭取10μL儲存液加入至1 mL 10%無脂肪酸的BSA（A6003，Sigma）中，震蕩30 min，42℃加熱30 min，重復(fù)此過程至完全溶解。37℃水浴過夜絡(luò)合后，0.22μm濾器過濾，-20℃保存待用。

將0.1 g LNA加入至2 mL無水乙醇中溶解，環(huán)境中充入氮?dú)馀叛?，避免LNA被氧化，作為儲存液；取40μL儲存液加入至1 mL 10%無脂肪酸的BSA（A6003，Sigma）中，震蕩30 min，42℃加熱30 min，重復(fù)此過程至完全溶解。37℃水浴過夜絡(luò)合后，0.22μm濾器過濾，-20℃保存待用。

1.3 單核巨噬細(xì)胞分離及培養(yǎng)

采集的抗凝血用HBSS按1∶1稀釋，小心加至等體積淋巴細(xì)胞分離液（購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆┮好嫔希? 500 r·min-1（×500 g）離心20 min，此時離心管中由上至下細(xì)胞分4層，收集第2層絮狀乳白色淋巴細(xì)胞至離心管中，2 300 r·min-1（×500 g）離心7 min，棄上清。將所得沉淀細(xì)胞利用PBS吹打重懸2次，再用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后，以每個孔1×105個細(xì)胞密度接種于12孔板中，待單核巨噬細(xì)胞貼壁生長后，再用含0.2% FBS的低血清RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]和課題組前期研究，本試驗(yàn)中給予1 mmol·L-1的PA和LNA處理細(xì)胞。設(shè)置對照組（含有等濃度BSA，相同體積的培養(yǎng)液）、LPS（100 ng·mL-1）處理組（L4391，Sigma）、PA（1 mmol·L-1）處 理 組（P5585，Sigma）、LNA（1 mmol·L-1）處理組（L1012，Sigma）、PA（1 mmol·L-1）+TAK242（3μmol·L-1）共處理組和PA（1 mmol·L-1）+LNA（1 mmol·L-1）共處理組。其中TAK-242提前預(yù)處理6 h，LNA預(yù)處理1 h。每組設(shè)置3個重復(fù)孔，于處理后4 h收集樣品用于后續(xù)分析。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR

收取單核巨噬細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒（RE-03113，F(xiàn)ORE GENE）說明書提取總RNA。取1μL RNA樣品在1.5%瓊脂糖凝膠上120 V電壓電泳10 min，檢測RNA完整度。利用超微量分光光度計(jì)（61010-1，DeNovix）檢測RNA樣品純度和濃度，調(diào)整RNA濃度至同一水平。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037Q，TaKaRa）說明書，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。利用ABI7300實(shí)時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)和FastStart Universal SYBR Green Master（S2024，Roche）試劑盒，檢測TLR4、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、SOD、iNOS、CAT等基因表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參基因，采用相對定量法測定基因表達(dá)水平。所用的引物信息見表1，由南京金唯智生物技術(shù)公司合成。擴(kuò)增體系為10μL反應(yīng)混合體系，含有5μL SYBR Green Master，上、下游引物各0.4μL，3.2μL ddH2O和1μL cDNA模板；反應(yīng)條件為：50℃2 min，95℃10 min；95℃15 s，退火1 min，40個循環(huán)；每孔設(shè)置3個重復(fù)。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.5 Western blot

收集PA和LNA處理4 h后單核巨噬細(xì)胞，利用含有蛋白酶抑制劑（SCP0110，Roche）和PMSF（329-98-6，Roche）的RIPA緩沖液（P0013B，Bey?otime）裂解。隨后，使用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒（P0012S，Beyotime）對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。將等量蛋白質(zhì)在12%SDS-PAGE上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜（DVPP00010，Millipore）上，與抗TLR4（1∶1 000；AF7017，Affinity）的一抗孵育后，和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶1 000；A0208，Beyotime）孵育，通過化學(xué)發(fā)光使膜可視化（Thermo Fisher Scientific），利用ImageJ軟件分析蛋白質(zhì)條帶。

1.6 ROS染色

在各組處理結(jié)束前40 min時，于37℃條件下將10μmol·L-1DCFH-DA（E004，南京建成）加入至細(xì)胞培養(yǎng)液中，利用熒光顯微鏡（Olympus，X71）觀察細(xì)胞內(nèi)氧化DCF引起的熒光值，綠色熒光信號代表ROS水平。

1.7 氧化和抗氧化指標(biāo)檢測

于PA和LNA處理4 h后，刮取培養(yǎng)皿上單核巨噬細(xì)胞并離心收集沉淀，超聲波破碎。利用總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒（A015-1，南京建成）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（A001-3，南京建成）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（A007，南京建成）、一氧化氮合酶（NOS）測定試劑盒（A014-1，南京建成）檢測細(xì)胞中氧化和抗氧化指標(biāo)水平，具體操作步驟和判定標(biāo)準(zhǔn)參照說明書執(zhí)行。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)作單因素方差分析（ANOVA）分析和Duncan多重比較?！?”代表P<0.05，表示差異顯著；“**”代表P<0.01，表示差異極顯著。所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單核巨噬細(xì)胞中TLR4基因表達(dá)變化

利用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot檢測各處理組中TLR4基因表達(dá)水平，結(jié)果見圖1。在1 mmol·L-1PA處理4 h后，TLR4基因表達(dá)水平上調(diào)，與LPS刺激后趨勢相似，均顯著高于對照組（P<0.05）；利用TAK242抑制TLR4基因后，其表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05），與對照組間差異不顯著（P>0.05）；PA與LNA共處理后，TLR4基因的表達(dá)水平也顯著下調(diào)（P<0.05），與對照組間差異不顯著（P>0.05）；而LNA單獨(dú)處理對TLR4基因表達(dá)水平無顯著影響（P>0.05）。

圖1 不同處理?xiàng)l件下綿羊單核巨噬細(xì)胞中TLR4基因表達(dá)水平Fig.1 Expression of TLR4 gene in sheep mononuclear macrophages under different treatment

2.2 單核巨噬細(xì)胞中炎性因子表達(dá)變化

利用實(shí)時熒光定量PCR檢測各處理組中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子表達(dá)水平，結(jié)果見圖2。在1 mmol·L-1PA處理4 h后，IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6基因表達(dá)上調(diào)，其中IFN-γ和IL-1β基因表達(dá)水平顯著高于對照組（P<0.05），TNF-α和IL-6基因表達(dá)水平極顯著高于對照組（P<0.01），整體上各炎性因子表達(dá)變化與LPS刺激后趨勢相似；利用TAK242抑制TLR4基因后，TNF-α和IL-6基因表達(dá)水平極顯著下調(diào)（P<0.01），4種炎性因子表達(dá)水平與對照組間均差異不顯著（P>0.05）；PA與LNA共處理后，TNF-α和IL-6基因表達(dá)水平也極顯著下調(diào)（P<0.01），4種炎性因子表達(dá)水平與對照組間均差異不顯著（P>0.05）；而LNA單獨(dú)處理對以上4種炎性因子表達(dá)無顯著影響（P>0.05）。

圖2 不同處理?xiàng)l件下綿羊單核巨噬細(xì)胞中各炎性因子表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of inflammatory factors in sheep mononuclear macrophages under different treatment

2.3 單核巨噬細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化

利用實(shí)時熒光定量PCR檢測各處理組中iNOS、SOD、CAT等氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平，結(jié)果見圖3。在1 mmol·L-1PA處理4 h后，iNOS基因表達(dá)水平顯著高于對照組（P<0.05），SOD和CAT基因表達(dá)水平顯著低于對照組（P<0.05），整體上與LPS刺激后趨勢相似；利用TAK242抑制TLR4基因后，iNOS基因表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05），3個氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平與對照組間均差異不顯著（P>0.05）；PA與LNA共處理后，對3個氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)無顯著影響（P>0.05）；而LNA單獨(dú)處理對以上3種氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)也無顯著影響（P>0.05）。

圖3 不同處理?xiàng)l件下綿羊單核巨噬細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of oxidative stress related genes in sheep mononuclear macrophages under different treatment

利用氧化應(yīng)激試劑盒檢測各處理組中iNOS、CAT、SOD、T-AOC等氧化和抗氧化指標(biāo)變化結(jié)果見圖4。在1 mmol·L-1PA處理4 h后，iNOS水平顯著升高（P<0.05），SOD、CAT、T-AOC水平顯著降低（P<0.05），整體上與LPS刺激后趨勢相似；利用TAK242抑制TLR4基因后，iNOS水平顯著下降（P<0.05），T-AOC水平顯著升高（P<0.05），4個氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平與對照組間均差異不顯著（P>0.05）；PA與LNA共處理后，iNOS水平也顯著下降（P<0.05），T-AOC水平顯著升高（P<0.05），4種氧化和抗氧化指標(biāo)水平與對照組間均差異不顯著（P>0.05）；而LNA單獨(dú)處理對以上4種氧化和抗氧化指標(biāo)水平無顯著影響（P>0.05）。

圖4 不同處理?xiàng)l件下綿羊單核巨噬細(xì)胞中氧化和抗氧化指標(biāo)水平Fig.4 Expression levels of oxidation and antioxidant indices in sheep mononuclear macrophages under different treatments

2.4 單核巨噬細(xì)胞中ROS水平變化

DCFH-DA染色結(jié)果表明見圖5。在1 mmol·L-1PA處理4 h后，ROS的水平顯著升高（P<0.05），與LPS刺激后趨勢相似；利用TAK242抑制TLR4基因后，ROS水平顯著下降（P<0.05），與對照組間差異不顯著（P>0.05）；PA與LNA共處理后，ROS水平也顯著下降（P<0.05），與對照組間差異不顯著（P>0.05）；而LNA單獨(dú)處理對ROS水平無顯著影響（P>0.05）。

圖5 不同處理?xiàng)l件下綿羊單核巨噬細(xì)胞中ROS水平Fig.5 ROS levels in sheep mononuclear macrophages under different treatments

3 討論

脂肪酸對細(xì)胞代謝調(diào)控作用與其碳鏈長度、雙鍵數(shù)量及位置密切相關(guān)。目前，研究表明長鏈飽和脂肪酸具有明顯脂毒性，過量累積導(dǎo)致免疫細(xì)胞中炎癥激活，促炎因子分泌增加[3]。飽和脂肪酸脂毒性與碳鏈長度呈正比，PA作為含有16個碳的長鏈飽和脂肪酸，可增加巨噬細(xì)胞中IL-1β和TNF-α分泌[18]。本研究結(jié)果表明，PA處理綿羊單核巨噬細(xì)胞后，IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子表達(dá)水平顯著上調(diào)，與陽性對照LPS處理組表現(xiàn)相近趨勢。除LPS以外，脂肪酸也可作為配體激活TLR4基因[13]，其中，PA可被TLR4胞膜外區(qū)結(jié)構(gòu)識別，并活化其下游信號通路[19]。Suganami等發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸處理TLR4基因突變的小鼠巨噬細(xì)胞后，TNF-α合成量顯著減少[20]。Sunita等在神經(jīng)細(xì)胞中研究結(jié)果也顯示，PA可能通過TLR4引起TNF-α和IL-6釋放，誘發(fā)炎癥產(chǎn)生[21]。本研究結(jié)果表明，PA處理綿羊單核巨噬細(xì)胞后，導(dǎo)致TLR4基因表達(dá)上調(diào)，炎性因子表達(dá)水平升高，而抑制TLR4基因后炎性因子的表達(dá)水平顯著下降，進(jìn)一步證明TLR4基因在介導(dǎo)PA誘發(fā)的炎性反應(yīng)過程中扮演重要角色。部分不飽和脂肪酸可起到一定抗炎作用，亞油酸可以在肝癌細(xì)胞系中逆轉(zhuǎn)PA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，顯著抑制IL-8產(chǎn)生[22]；鼠單核細(xì)胞研究也表明，n-3類二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸可降低IL-1、IL-2、TNF-α等炎性因子表達(dá)水平[23]。本研究表明，LNA作為一種n-3類多不飽和脂肪酸，對綿羊單核巨噬細(xì)胞中TLR4基因和炎性因子表達(dá)無顯著影響，但可在一定程度上緩解PA促炎作用。

一般認(rèn)為過度氧化應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致免疫細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯異常，影響細(xì)胞正常代謝過程。PA可通過損傷線粒體氧化呼吸鏈正常功能，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]。PA可在牛輸卵管上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)ROS水平升高[18]。Liu等在大鼠心臟細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)PA可通過TLR4下游MAPK通路增強(qiáng)ROS產(chǎn)生，進(jìn)一步說明ROS產(chǎn)生可能與TLR4激活有關(guān)[25]。本研究結(jié)果表明，PA處理綿羊單核巨噬細(xì)胞后，ROS水平顯著升高，而抑制TLR4基因后ROS水平顯著下降。PA刺激炎癥并分泌產(chǎn)生ROS[26]，ROS可通過TLR4信號通路激活iNOS，導(dǎo)致NO釋放，NO通過產(chǎn)生過氧化物酶和超氧化物幫助消滅氧化應(yīng)激源頭[27]。Juntian等發(fā)現(xiàn)，PA可以顯著提高iNOS表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激水平提高[28]。

本研究結(jié)果表明，PA處理綿羊單核巨噬細(xì)胞后，氧化指標(biāo)水平提高、抗氧化指標(biāo)水平降低，導(dǎo)致細(xì)胞中整體氧化應(yīng)激水平提高。而抑制TLR4基因后，iNOS等細(xì)胞氧化指標(biāo)顯著下降，降低氧化應(yīng)激水平。多不飽和脂肪酸可抑制飽和脂肪酸誘導(dǎo)的TLR4基因表達(dá)[29]，緩解細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。n-3類多不飽和脂肪酸可以抑制巨噬細(xì)胞中iNOS表達(dá)[30]；攝入n-3類多不飽和脂肪酸后，血液中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量增加，誘發(fā)抗氧化指標(biāo)SOD水平升高，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)[31]。本研究表明，LNA對綿羊單核巨噬細(xì)胞中TLR4基因表達(dá)和抗氧化指標(biāo)無顯著影響，但可在一定程度上通過降低氧化水平緩解PA誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

4 結(jié)論

PA處理后導(dǎo)致綿羊單核巨噬細(xì)胞炎性因子和氧化應(yīng)激水平升高，TLR4基因在此過程中起重要介導(dǎo)作用，LNA可能在一定程度上緩解PA誘發(fā)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。