QuEChERS提取-EMR凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定養(yǎng)殖魚中的乙氧基喹啉

陳琳珊 陳佩佩 何雯倩 陳茹

摘 要：建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對養(yǎng)殖魚中的乙氧基喹啉進(jìn)行快速測定?；赒uEChERS技術(shù)，樣品用乙腈和水提取，鹽析分層離心。經(jīng)增強(qiáng)型基質(zhì)去除固相吸附劑（Enhanced Matrix Removal，EMR）凈化后，通過電噴霧電離源（Electrospray Source Ionization，ESI）的正離子模式電離，結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Response Monitoring，MRM）進(jìn)行采集。乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.0～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r>0.999 6，平均回收率為82.9%～105.0%，方法檢出限為10.0 μg/kg，方法定量限為30.0 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDs為4.64%～5.96%。該方法簡單快捷，回收率良好、靈敏度高和重現(xiàn)性好，可應(yīng)用于實際養(yǎng)殖魚中乙氧基喹啉的快速測定。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;快速測定;水產(chǎn)品;乙氧基喹啉

乙氧基喹啉（Ethoxyquin，EQ）是一種經(jīng)化學(xué)合成的芳香胺，結(jié)構(gòu)如圖1所示，呈油狀液體，具有清除自由基從而防止脂質(zhì)氧化的作用，同時對蛋白質(zhì)、維生素等物質(zhì)也有很好的抗氧化效果[1]，因此在飼料產(chǎn)品市場中應(yīng)用廣泛。有研究表明，一定量的乙氧基喹啉對大黃魚、雛雞具有一定的促生長作用，但過量時會產(chǎn)生抑制生長的作用[2-3]，同時，過量的乙氧基喹啉會對動物機(jī)體產(chǎn)生一定的不良影響，如400 mg/kg

的飼料添加量會使大菱鲆降低食量[4]，而15 000 mg/kg的添加量也會使大西洋鮭產(chǎn)生拒食現(xiàn)象[5]。按照歐盟規(guī)定，2018年3月31日后不允許飼料產(chǎn)品中有乙氧基喹啉產(chǎn)品添加，可見乙氧基喹啉的安全性確實存在一定的爭議，而人類作為水產(chǎn)品的終端消費者，乙氧基喹啉在水產(chǎn)品中的殘留量也會對人體存在一定的隱患。目前，我國的相關(guān)法律法規(guī)仍然允許乙氧基喹啉在飼料中添加使用，由于其效果優(yōu)異，即使我國水產(chǎn)品行業(yè)禁用后，仍然有可能會存在一段時間的違法濫用。因此，建立水產(chǎn)品中乙氧基喹啉快速有效的檢測方法具有極其重要的意義。

圖1 乙氧基喹啉化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前，對水產(chǎn)品中乙氧基喹啉測定方法的相關(guān)報道較少，主要為毛細(xì)管電泳法[6]、高效液相色譜法[7-9]、氣相色譜法[10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12]和高分辨質(zhì)譜法[13]。毛細(xì)管電泳法靈敏度高、重現(xiàn)性差，高效液相色譜法和氣相色譜法則存在選擇性較低的問題，高分辨質(zhì)譜法價格昂貴，儀器維護(hù)成本高，難以普及，因此這些方法均難以應(yīng)用于實際的大批量檢測。而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法則具有靈敏度高，選擇性好，應(yīng)用廣泛的優(yōu)點，可用于實際的批量檢測。本文建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，基于QuEChERS方法提取，增強(qiáng)型基質(zhì)去除凈化劑EMR進(jìn)行凈化，通過二次優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，使目標(biāo)物達(dá)到實際測定的最佳響應(yīng)值，結(jié)合高效液相色譜，使目標(biāo)物在短時間內(nèi)出峰，且保持良好的峰型。同時方法學(xué)實驗數(shù)據(jù)表明，該方法可有效測定水產(chǎn)品中的乙氧基喹啉。

1 材料與試劑

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧電離源（ESI）（API 4000Q，AB SCIEX公司）;電子天平;4k-15離心機(jī)（北京卓明貿(mào)易有限公司）;IKA Vortex4渦旋混勻器（廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司）;Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

1.2 材料與試劑

養(yǎng)殖魚樣品，購于廣州市市場。

甲酸、乙腈（LC-MS級，美國Thermo Fisher公司）;乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.5%，SIGMA，購自安譜公司）;EMR凈化管（安捷倫，購自德祥公司）;石墨化炭黑鍵合硅膠（Graphitizing of Carbon Black，GCB）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺鍵合硅膠（Primary Secondary Amine，PSA）（購自廣州聯(lián)方公司）;無水硫酸鎂、氯化鈉（分析純，購自安譜公司）。

1.3 實驗條件

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并配成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4 ℃下避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈重新定容成1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L和200.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品處理

養(yǎng)殖魚產(chǎn)品先均質(zhì)處理。稱取均質(zhì)后樣品2.0 g（精確至0.01 g），精密稱定于50 mL離心管中，先加入水10 mL，再加入乙腈10 mL，渦旋混合2 min，然后加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋提取15 min，10 000 r/min離心5 min，離心后取2 mL上清液轉(zhuǎn)移至15 mL EMR脫脂凈化管（預(yù)先用1 mL水活化2 min）中，渦旋2 min后，4 500 r/min離心5 min，取1.5 mL上清液于裝有0.5 g無水硫酸鎂的2 mL離心管中脫水后過膜上機(jī)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent poroshell EC-C18 （150 mm×3.0 mm，2.7 μm）;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為10 μL;流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水（體積分?jǐn)?shù)）;采用等度洗脫方式洗脫分離：A∶B為80∶20;流速為0.40 mL/min;采集時間：7 min。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI）;電離模式：正離子模式;離子源溫度為500 ℃，離子源電壓為5 000 V。霧化氣（GAS1）：50 psi;加熱輔助氣（GAS2）：50 psi;碰撞氣（CAD）：medium;采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜分析條件的確定

建立養(yǎng)殖魚中乙氧基喹啉的儀器分析方法，通過流動注射的方式，將標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入ESI離子源，確定乙氧基喹啉的母離子質(zhì)荷比為m/z 218.3，子離子質(zhì)荷比分別為m/z 148.2和m/z 174.2，同時優(yōu)化其去簇電壓DP和碰撞能量CE，得到最佳的參數(shù)條件，見表1。通過優(yōu)化色譜條件，確定最佳洗脫流動相比例為乙腈∶0.1%甲酸水（80∶20），流速為0.40 mL/min。乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)品提取離子流色譜圖如圖2所示。

2.2 分散固相萃取劑類型的選擇

在實驗初期，探究了分散固相萃取劑類型對乙氧基喹啉回收率的影響。由于購買的EMR凈化管中包含了1.1 g的EMR凈化粉末，為了保證方法的簡便性，不再對用量進(jìn)行探究，同時，用同樣量的PSA、C18和GCB凈化粉末進(jìn)行回收率的對比。分別對每個用量水平重復(fù)測定6次，以平均回收率為考察依據(jù)。結(jié)果顯示，當(dāng)用EMR凈化時，乙氧基喹啉的回收率最高。而且水產(chǎn)品中含有較多的油脂，用EMR凈化能降低儀器分析時的基質(zhì)效應(yīng)。因此，最終選擇EMR為凈化劑。結(jié)果詳見圖3。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

養(yǎng)殖魚中基質(zhì)復(fù)雜，對目標(biāo)物可能存在基質(zhì)效應(yīng)，從而影響目標(biāo)物在質(zhì)譜中的離子化程度，因此對乙氧基喹啉的基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）進(jìn)行了考察。按照前處理方法對乙氧基喹啉呈陰性的羅非魚進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)液，用此空白基質(zhì)液配制50 μg/L的單標(biāo)溶液，按方法的儀器條件測試，測得值和原濃度比值即為ME，以ME作為判斷的依據(jù)。當(dāng)ME值在0.8～1.2時，基質(zhì)效應(yīng)不明顯;若ME值小于0.8，則說明基質(zhì)效應(yīng)為強(qiáng)負(fù)效應(yīng)明顯，大于1.2則為強(qiáng)正效應(yīng)。乙氧基喹啉的ME計算結(jié)果為0.92，說明基質(zhì)效應(yīng)不明顯，這可能是由于EMR凈化了樣品中大部分的油脂。因此，為了簡化實驗，最終采用溶劑曲線作為定量曲線。

2.4 線性關(guān)系和檢出限

在本方法所確定的實驗條件下，用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L和200.0 μg/L進(jìn)行測定，以峰面積（Y軸）對相應(yīng)的濃度（X軸）作圖，得到線性方程Y=1.76×104X-3.92×103。結(jié)果表明，待測化合物濃度與對應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999 6，具有較準(zhǔn)確定量能力。

同時，通過對羅非魚樣品進(jìn)行低濃度水平加標(biāo)，再分別按信噪比的3倍（S/N=3）和10倍（S/N=10），得出方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果表明，乙氧基喹啉的方法檢出限為10.0 μg/kg，定量限為30.0 μg/kg，表明方法具有較高的靈敏度。

2.5 回收率與精密度實驗

選取均質(zhì)后的樣品初步平均測定3次，確定其本底值，再進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見表3。最終選用乙氧基喹啉呈陰性的羅非魚和黃鱔作為加標(biāo)回收樣品，按照乙氧基喹啉定量限的1倍、2倍和5倍水平進(jìn)行添加，每一個水平均進(jìn)行日內(nèi)重復(fù)測定6次（n=6）。最終測得平均回收率在82.9%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為4.64%～5.96%。結(jié)果表明，方法回收率良好，精密度好，滿足實驗室的測定要求。

3 結(jié)論

本文基于QuEChERS技術(shù)對樣品進(jìn)行提取，選用增強(qiáng)型基質(zhì)去除EMR粉末進(jìn)行分散固相萃取凈化。建立的超高效液相色譜條件使目標(biāo)物在3 min內(nèi)出峰，且峰型良好。通過流動注射混合流動相的方式，二次優(yōu)化目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)，提高了目標(biāo)物的靈敏度。通過方法學(xué)實驗驗證了方法的可行性，結(jié)果表明，該方法回收率良好，靈敏度高，重復(fù)性好。在實際的樣品測定實驗中，能有效檢測出實際陽性樣品，因此，可應(yīng)用于日常實驗室的檢測中，同時也為后續(xù)的相關(guān)研究提供了參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Pryor W A， Strickland T， Church D F. Comparison of the efficiencies of several natural and synthetic antioxidants in aqueous SDS [sodium dodecylsulfate] micelle solutions[J]. Journal of the American Chemical Society， 1998，110（7）：2224-2229.

[2]Ohshima M， Layug D， Yokota H， et al. Effect of graded levels of ethoxyquin in alfalfa leaf extracts oncarotenoid and cholesterol concentrations in chicks[J]. Animal Feed Science & Technology， 1996，62（2/3/4）：141-150.

[3]王珺.乙氧基喹啉，氧化魚油和煙酸鉻對大黃魚與鱸魚生長性能的影響及其（或代謝物）在魚體組織中殘留的研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2010.

[4]Saxena T B， Zachariassen K E， Jorgensen L. Effects of ethoxyquin on the blood composition of turbot， Scophthalmus maximus L.[J]. Comp Biochem Phys C： Pharmacology， Toxicology and Endocrinology， 2000， 127（1）：1-9.

[5]Berdikova-Bohne V J， Lundebye A K， Hamre K. Accumulation and depuration of the synthetic antioxidant ethoxyquin in the muscle of Atlantic salmon （Salmo salar L.）[J]. Food Chem Toxicol， 2008，46（5）：1834-1843.

[6]龐軍，劉文紅，宋合興，等.高效毛細(xì)管電泳法同時檢測飼料中六種抗氧化劑[J].中國飼料，2013（8）：40-42.

[7]余曉琴，李澍才，唐昌云.高效液相色譜-熒光檢測法測定水果中乙氧基喹啉[J].分析測試學(xué)報，2019，38（10）：1260-1264.

[8]舒曉夢，趙素娟，王羚佳，等.高效液相熒光法測定豬肉中抗氧化劑乙氧基喹啉以及代謝產(chǎn)物二聚乙氧基喹啉[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2018，44（5）：244-248.

[9]Rodríguez-Gómez R， Vandeput M， Zafra-Gómez A， et al. Liquid chromatography-electrochemical detection for the determination of ethoxyquin and its dimer in pear skin and salmon samples[J]. Talanta， 2018， 177（1）：157-162.

[10]董茂鋒，白冰，饒欽雄，等.氣相色譜法測定飼料中BHT和EQ兩種抗氧化添加劑[J].中國飼料，2012（8）：40-42.

[11]Kranawetvogl A， Elsinghorst P W. Determination of the Synthetic Antioxidant Ethoxyquin and Its Metabolites in Fish and Fishery Products Using Liquid Chromatography–Fluorescence Detection and Stable-Isotope Dilution Analysis–Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry[J]. J Agr Food Chem， 2019，67（23）：6650-6657.

[12]Chen A D， Wu Z W， Yu Q， et al. Simultaneous determination of 31 preservatives and antioxidants in liquid preparation and healthcare dietetic liquid by GC/MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society， 2014，35（5）：438-446.

[13]郭思言，丁濤，殷耀，等.高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜對水產(chǎn)品中未知污染物的非定向快速篩查與測定[J].色譜，2019，37（1）：15-20.