牡丹葉的質(zhì)量標準研究

肖會敏，張 妍，楊 旭，李 捷，林 奮，羅定強，王四旺

(1.陜西鳳丹正元生物科技有限公司研發(fā)部，西安 710077；2.陜西中醫(yī)藥大學，咸陽 712046；3.空軍軍醫(yī)大學中藥與天然藥物教研室，西安 710032；4.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，西安 710061；5.西北大學生命科學與醫(yī)學部，西安 710069)

牡丹葉為毛茛科植物牡丹PaeoniaAndr.的干燥葉，其在歷代本草和現(xiàn)代醫(yī)藥著作中均未記載，民間常用于治療痢疾，主產(chǎn)于陜西、山東、安徽、河南等地，秋季采收[1]。牡丹葉中含有苷類、多酚類、黃酮類、多糖類等成分，苷類如芍藥苷、羥基芍藥苷等，多酚類如沒食子酸、鞣花酸、沒食子酸甲酯等[2-6]。現(xiàn)代藥理研究表明，牡丹具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖、降尿酸、抑菌、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗腫瘤、清除自由基、抗氧化、緩解痛風性關(guān)節(jié)炎等多種藥理作用[7-13]。牡丹葉中芍藥苷對輻射損傷內(nèi)皮細胞有保護作用，可改善認知功能障礙及抑郁焦慮等[14-16]。牡丹葉中的鞣花酸可改善阿爾茨海默病引起的學習和記憶障礙與腎缺血再灌注引起的大鼠腎損傷[17-18]?，F(xiàn)行山東省牡丹葉質(zhì)量標準缺乏含量檢測項，同時藥材薄層色譜法 (TLC) 鑒別項目在不同產(chǎn)地實驗中難以重現(xiàn)，陜西省是牡丹種植大省，資源豐富。因此，亟需建立一種更加全面、科學的牡丹葉質(zhì)量標準來評價其質(zhì)量。本文通過不同產(chǎn)地藥材建立定量指標(芍藥苷與鞣花酸)與定性指標(芍藥苷TLC鑒別)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 UFLC-20AD-PDA型高效液相色譜儀，日本島津公司；Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，瑞典NOBEL公司；XPE105型電子分析天平，梅特勒-托利多公司；KQ-5200D型數(shù)控超聲波發(fā)生器，昆山超聲儀器有限公司；HWT-6B型恒溫水浴箱，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.2試藥 甲醇、乙腈(HPLC級)，美國Fisher公司；超純水，自制；香草醛和硫酸(分析純)，均購自天津恒興化學試劑制造有限公司。對照品：芍藥苷(批號110736-202044，質(zhì)量分數(shù)為96.8%);鞣花酸(批號111959-201903，質(zhì)量分數(shù)為88.8%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。牡丹葉對照藥材(批號202105-001)，由陜西省食品藥品監(jiān)督研究院提供；牡丹葉(山東菏澤、陜西合陽、陜西蒲城、陜西西安)，均由陜西鳳丹正元生物科技有限公司提供，經(jīng)羅定強主任藥師鑒定為毛茛科植物牡丹PaeoniaAndr.的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1牡丹葉中芍藥苷的TLC鑒別 取牡丹葉樣品粉末1 g，加石油醚(30～60 ℃)50 mL，超聲處理30 min，濾過，棄濾液，收集藥渣，揮干石油醚，加丙酮50 mL，超聲(功率300 W，頻率50 kHz)處理30 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加丙酮制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品溶液。依據(jù)文獻方法[1，19-20]，吸取上述2種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以體積分數(shù)為5%的香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同藍紫色斑點。見圖1。

圖1 牡丹葉中芍藥苷的TLC鑒別

2.2牡丹葉的TLC鑒別 取牡丹葉樣品粉末，加石油醚(30～60 ℃)20 mL，超聲處理10 min，濾過，棄去濾液，藥渣揮去石油醚，加丙酮25 mL，超聲處理10 min，濾過，將濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。另取牡丹葉對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。按照TLC法(《中國藥典》2020年版四部通則0502)進行實驗，吸取上述2種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，用碘蒸氣熏蒸2 min。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點[1]。結(jié)果見圖2。

圖2 牡丹葉TLC鑒別

2.3芍藥苷與鞣花酸的含量測定

2.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈(A)-0.85 g·L-1磷酸 (B)為流動相進行梯度洗脫，見表1。檢測波長為234 nm；柱溫為30 ℃；流速為0.8 mL·min-1；理論塔板數(shù)按照芍藥苷峰計算應不低于4 000。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2混合對照品溶液的制備 分別精密稱取芍藥苷、鞣花酸對照品2.61、4.02 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3供試品溶液的制備 取牡丹葉樣品粉碎，過4號篩，精密稱取1 g，置于具塞錐形瓶中，加入體積分數(shù)為70%的甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分數(shù)為70%的甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置于10 mL量瓶中，加體積分數(shù)為70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.4標準曲線及線性范圍 分別精密量取2.3.2項下制備的混合對照品溶液0.01、0.05、0.10、0.25、0.50 mL，分別置于2 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得系列混合對照品溶液1～5。進樣測定，記錄峰面積，考察對照品質(zhì)量濃度(x)與峰面積(y)的線性關(guān)系，結(jié)果芍藥苷、鞣花酸的線性方程分別為y1=9 837.2x1-5 905.7(r1=0.999 8)，y2=20 532x2+7 336.2(r2=0.999 8)；質(zhì)量濃度分別在2.53～126.32、3.57～178.49 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5精密度實驗 取2.3.4項下制備的混合對照品溶液3，連續(xù)測定6次，進樣測定峰面積并計算RSD值。結(jié)果芍藥苷、鞣花酸峰面積的RSD值分別為1.42%、1.09%，表明儀器精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性實驗 取2.3.4項下制備的混合對照品溶液3，分別于0、0.5、1、2、4、8、12、24 h進樣測定峰面積，計算RSD值。結(jié)果芍藥苷與鞣花酸的RSD值分別為1.12%、0.99%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7重復性實驗 精密稱取牡丹葉樣品(陜西合陽)1 g，按照2.3.3項下方法制備6份供試品溶液，按照2.3.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果見表2，結(jié)果表明實驗重復性良好。

表2 重復性實驗結(jié)果

2.3.8回收率實驗 精密稱取含量已知的樣品(陜西合陽)9份，每份1 g，分別添加混合對照品溶液2.5、5.0、7.5 mL(取芍藥苷、鞣花酸對照品77.48、52.93 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即得2種成分質(zhì)量濃度分別為1.50、0.94 mg·mL-1的混合對照溶液)，按照2.3.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果見表3，結(jié)果表明該方法回收率良好。

表3 回收率實驗結(jié)果 (n=9)

2.3.9樣品含量測定 測定4個不同產(chǎn)地藥材中芍藥苷與鞣花酸的含量，按照2.3.3項下方法制備供試品溶液，按照2.3.1項下色譜條件進樣測定，結(jié)果見表4、圖3和圖4。

圖3 HPLC圖

表4 4個不同產(chǎn)地藥材中芍藥苷與鞣花酸的含量

圖4 目標物光譜圖

3 討論

3.1TLC鑒別 牡丹為毛茛科芍藥屬多年生落葉灌木，牡丹葉化學成分復雜，主要成分為苷類、酚類和黃酮類等[3]。本實驗參照文獻[1]中牡丹葉的TLC鑒別的制樣方法、展開方法及顯色方法，結(jié)果(見圖2)與文獻結(jié)果不一致，即TLC中間斑點未顯示或不清晰或不同產(chǎn)地不一致，表明該方法重復性不理想，因此未列入質(zhì)量標準；再依據(jù)文獻[19]中白芍的TLC展開系統(tǒng)與顯色方法，對制樣方法進行改進，結(jié)果(見圖1)不同產(chǎn)地供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的藍紫色斑點，斑點清晰明顯，操作簡便，靈敏度高，重復性較好，故將其列入質(zhì)量標準。

3.2含量測定 對檢測條件進行摸索，比較了不同柱溫(40、35、30、25、20 ℃)、不同流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)、不同色譜洗脫系統(tǒng)[不同質(zhì)量濃度的磷酸(0、0.85、1.70、3.40、6.80、8.50 g·L-1)-甲醇或乙腈酸]、不同進樣量(20、10 μL)、不同制樣方法如超聲(15、30、45、60 min)、加熱回流(15、30、45、60 min)以及不同體積分數(shù)的甲醇或乙醇(40%、50%、60%、70%、80%、100%)，最終建立了制樣簡單、靈敏可靠、操作方便、重復性與穩(wěn)定性良好的HPLC法測定牡丹葉中芍藥苷與鞣花酸的含量，可列入標準。

綜上所述，把具有良好重復性與穩(wěn)定性的含量測定項(即芍藥苷與鞣花酸的含量測定)以及專屬性強、重復性好、操作簡便的TLC鑒別項(即芍藥苷的鑒別)列入質(zhì)量標準，可以很好地評價與控制牡丹葉的質(zhì)量。