基于網(wǎng)絡藥理學探究丹參對血小板聚集的機制

霍 蘇，崔鶴蓉，顧昱昊，戴子琦，王亞欣，婁邵巖，戚 蕊，項嘉偉，王鵬龍，馬 濤，雷海民

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488)

血小板聚集是指血小板具有相互黏附的特性，血小板膜上的糖蛋白黏附在纖維蛋白原，纖維蛋白原再黏附在另一側的血小板上，通過纖維蛋白原血小板就互相聚集在一起[1]。血小板聚集性增高，是由于血管內皮細胞受損，引起了血小板活化、黏附、聚集，血小板聚集率高會引起血液黏稠，導致血管堵塞，形成血栓，而血栓的形成是動脈粥樣硬化、急性心肌梗死、腦血栓等心血管疾病主要的發(fā)病機制。對于原發(fā)性血小板聚集率升高性疾病，臨床上常用抗血小板聚集藥物如環(huán)氧合酶抑制劑阿司匹林、糖蛋白Ⅱb/Ⅲa (GPⅡb/Ⅲa)抑制劑ReoPro和P2Y12抑制劑氯吡格雷，治療心血管疾病[2]效果顯著。然而，考慮到耐藥的高頻率和對患者的胃腸道不良反應，不建議長期使用這些藥物。此外，長期使用多種抗血小板藥物可能會增加毒性。在此基礎上，需要開發(fā)新的抗血小板藥物，以提高療效和減少不良反應。目前，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，天然來源的新的活性物質以及植物中的某些化學物質具有很強的抗血小板聚集作用。

丹參是我國傳統(tǒng)的活血化瘀中藥之一，療效顯著，不良反應報道較少[3-4]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，丹參具有增加冠狀動脈流量、改善微循環(huán)、抗血小板聚集等多種藥理作用[5-11]。臨床研究表明，對不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死、短暫性腦缺血發(fā)作、動脈粥樣硬化等心血管疾病的治療和預防具有重要意義。丹參含有多種化學成分，主要分為兩大類:一是二萜醌類的脂溶性成分，以丹參酮類二萜為主，如丹參酮類和隱丹參酮類；二是酚酸的水溶性成分，如丹參素、丹參酚酸類化合物。本文主要通過網(wǎng)絡藥理學研究丹參抑制血小板聚集的作用機制。

網(wǎng)絡藥理學[12-13]是基于系統(tǒng)生物學理論，結合藥理學和計算機技術，實現(xiàn)藥物作用的綜合網(wǎng)絡分析，特別適合對具有多組分、多靶點、多機制特征的中藥進行研究。據(jù)此，本研究擬通過網(wǎng)絡藥理學方法篩選出丹參抗血小板聚集的潛在有效成分及其作用靶點，對其機制進行分析，為丹參臨床應用提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1丹參活性成分篩選及其靶點的獲取 通過TCMSP(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)對中藥中化學成分的吸收、分布、代謝進行預測。在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索“丹參”，共收集到202種化合物，再通過口服生物利用度(OB)和藥物相似性(DL)對化合物的藥物動力學進行篩選，其中，OB是指藥物經(jīng)口服給藥后被機體吸收進入血液循環(huán)的相對量和速率；DL反映化合物中的特定功能基團與已知藥物的相似性，二者對中藥化學成分活性的評估具有重要意義。本研究根據(jù)以往研究，以OB≥30%，DL≥0.18作為篩選高活性關鍵化合物的閾值。

1.2丹參有效成分靶點規(guī)范 由于丹參有效成分靶點來源不統(tǒng)一造成丹參靶點名稱不規(guī)范，因此需要對篩選得到的靶蛋白和基因信息進行校正。將所有的靶點在Uniport(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫中進行搜索，將物種設置為人，獲得靶點標準的Uniport名稱。

1.3疾病靶點的獲取與交集靶點的篩選 在GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫輸入關鍵詞“Platelet aggregation”獲得血小板聚集的蛋白靶點基因并與1.1篩選出的藥物靶點進行韋恩分析，獲取交集靶點。

1.4“藥物-疾病-靶點”交互網(wǎng)路建立 為了闡述丹參治療血小板聚集的有效機制，將丹參與肝纖維化的共同靶點與關鍵化合物的關系使用Cytoscape 3.7.2 軟件進行繪制，在網(wǎng)絡圖中，關鍵化合物和靶點以節(jié)點表示，節(jié)點之間相互作用的關系以邊來表示。

1.5蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡建立 考慮到靶點之間的相互作用對關聯(lián)靶點進行相互作用分析，將丹參-肝纖維化共有的89個靶點基因導入String(https://string-db.org/cgi/input.pl) 數(shù)據(jù)庫平臺，研究物種選擇人類，獲取蛋白質相互作用關系，并篩選評分≥0.9 的蛋白關系，隱藏離散點，藍色連線表示基因共進化證據(jù)，紅色連線表示基因融合證據(jù)，黃色連線表示文本挖掘證據(jù)等，下載 PPI網(wǎng)絡圖，并篩選排名前30的PPI網(wǎng)絡核心基因。

1.6基因本體(GO)富集分析 將藥物疾病共有靶點進行GO的生物過程(BP)、分子功能(MF)、細胞組分(CC)富集，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正P≤0.05的項目進行篩選。使用R 3.6.3軟件，安裝并引用clusterProfiler，enrichplot，ggplot2包，繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.7京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正值P≤0.05的項目進行篩選。使用R 3.6.3，安裝并引用ClusterProfiler包后，繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.8分子對接 丹參中的潛在藥效成分和關鍵作用靶點的3D結構分別從Pubchem數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中下載。使用AutoDockTools1.5.6對潛在藥效成分和關鍵作用靶點的3D結構進行去水、加氫，轉換成Pdbqt格式。由Autodock Vina 1.1.2軟件完成分子對接分析。最后利用PyMol 1.8對蛋白與分子結合的結果進行可視化處理。

2 結果

2.1藥物化學成分及藥物靶點篩選 利用TCMSP對丹參中的202種已知成分進行篩選，通過OB≥30%和DL≥0.18篩選出丹參中65種高活性關鍵化合物，包括丹參酮、紫杉醇、丹參醛、丹酚等。見表1。其中65種有效成分對應935個相關靶點，有680個有效相關靶蛋白和109個靶基因。

表1 丹參的活性成分信息

2.2疾病靶點 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢上述65種關鍵化合物的靶點信息，通過Uniprot進行基因ID的注釋得到丹參中基因ID。在GeneCard中獲取血小板聚集相關靶點5 394個，將藥物與疾病的靶點基因導入 Excel，映射得到丹參-血小板聚集的共同靶點，見表2。并通過 R 語言繪制韋恩圖，藥物與疾病共有靶點84個，注釋基因82個。

表1(續(xù)) 丹參的活性成分信息

表2 丹參-血小板聚集共有靶點

2.3“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡關系 將上述篩選獲得的藥物活性成分、潛在治療靶點基因、藥物、疾病名稱導入Cytoscape 3.7.2軟件，設置節(jié)點與邊線將其相互關系繪制成可視化“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，見圖1。由圖1可知，網(wǎng)絡共涉及節(jié)點135個，其中網(wǎng)絡圖中黃色部分為中藥成分靶點，藍色菱形為中藥成分，紫色矩形為中藥即丹參，紅色為作用機制即血小板聚集。邊線表示化合物、靶點、藥物、疾病之間存在相關性。通過插件cytoNCA按照度和緊密度2種屬性分別取排序靠前的成分或靶點。成分有：二氫丹參內酯；異隱丹參酮；丹參醌新酮Ⅰ；1，2，5，6-四氫丹參酮和丹參螺縮酮內酯等。靶點有β2腎上腺素能受體(ADRB2)、人類重組蛋白(OPRM1)、前列腺素內過氧化物合成酶2(PTGS2)、前列腺素內過氧化物合成酶1 (PTGS1)、碳酸酐酶Ⅱ(CA2)、乙酰膽堿受體亞型3(CHRM3)和絲裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)等。

圖1 “中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖

2.4PPI網(wǎng)絡構建 將潛在治療靶點基因導入String數(shù)據(jù)庫平臺，研究物種選擇人類，篩選評分>0.9的蛋白關系，并完成PPI網(wǎng)絡圖，見圖2。由圖2可知，該網(wǎng)絡包含270條邊，71個節(jié)點。其中評分≥0.99的相互作用蛋白為：絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶-核內癌基因(AKT1-GSK3B)、重組蛋白-核蛋白轉錄因子(JUN-FOS)、內皮素 1(EDN1)、重組蛋白-內皮素受體A型基因(EDN1-EDNRA)、依賴蛋白激酶抑制劑1-細胞周期素D1(CDKN1A-CCND1)、依賴蛋白激酶抑制劑1-腫瘤抑制基因(CDKN1A-TP53)、依賴蛋白激酶抑制劑1-增殖細胞抗原(CDKN1A-PCNA)、腫瘤抑制基因-鼠雙微染色體2(TP53-MDM2)、依賴蛋白激酶抑制劑-細胞周期蛋白依賴激酶2(CDKN1A-CCNA2)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-內皮型一氧化氮合酶(AKT1-NOS3)、蛋白酪氨酸磷酸酶1-胰島素受體(PTPN1-INSR)、細胞周期蛋白依賴激酶2-細胞周期蛋白B1(CCNA2-CCNB1)、表皮生長因子受體-信號傳導與轉錄激活因子3(EGFR-STAT3)、白細胞介素6-信號傳導與轉錄激活因子-3(IL-6-STAT3)、白細胞介素10-腫瘤壞死因子(IL-10-TNF)、白細胞介素10-白細胞介素6(IL-10-IL-6)、核蛋白類調控基因-細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1C(MYC-CDKN1A)、白細胞介素6-白細胞介素4(IL-6-IL-4)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1A(AKT1-CDKN1A)、重組蛋白-絲裂原活化蛋白激酶14(JUN-MAPK14)、白細胞介素10-信號傳導與轉錄激活因子-3(IL-10-STAT3)、酪氨酸激酶受體-信號傳導與轉錄激活因子-3(VEGFA-STAT3)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-信號傳導與轉錄激活因子-3(AKT1-STAT3)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-胱天蛋白酶9(AKT1-CASP9)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-腫瘤抑制基因(AKT1-TP53)、細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1A-細胞周期蛋白B1(CDKN1A-CCNB1)、酪氨酸激酶受體-內皮型一氧化氮合酶(VEGFA-NOS3)、信號傳導與轉錄激活因子(STAT3-CCND1)、腫瘤壞死因子-核因子κB抑制蛋白α抗體(TNF-NFKBIA)、核蛋白類調控基因-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(MYC-AKT1)、核蛋白類調控基因-重組蛋白(MYC-JUN)、腫瘤壞死因子-白細胞介素4(TNF-IL-4)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-鼠雙微染色體(AKT1-MDM2)、腫瘤抑制基因(JUN-TP53)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1-雌激素受體1(AKT1-ESR1)、細胞周期蛋白A2-腫瘤抑制基因(CCNA2-TP53)、絲氨酸/蘇氨酸激酶-細胞周期蛋白D1(GSK3B-CCND1)、核內癌基因-信號傳導與轉錄激活因子-3(MYC-STAT3)、雌激素受體1-細胞周期蛋白D1 (ESR1-CCND1)、腫瘤抑制基因-絲裂原活化蛋白激酶14(TP53-MAPK14)。這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡中非常重要。通過計算每個基因的連接節(jié)點數(shù)量，找出前25個PPI核心，即：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、信號傳導與轉錄激活因子-3(STAT3)、腫瘤抑制基因(TP53)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、腫瘤壞死因子(TNF)、人內皮素1(EDN1)、白細胞介素6(IL-6)、細胞周期蛋白D1 (CCND1)、表皮生長因子受體(EGFR)、雌激素受體(ESR1)、酪氨酸激酶受體(VEGFA)、細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1A(CDKN1A)、白細胞介素4(IL-4)、糖皮質激素受體(NR3C1)、毒蕈堿型乙酰膽堿受體M2(CHRM2)、內皮素受體A型基因(EDNRA)、白細胞介素2(IL-2)、雄激素受體(AR)、半胱天冬蛋白酶(CASP3)、5羥色胺受體2A(HTR2A)、阿片樣物質受體(OPRD1)、阿片受體(OPRM1)、α1A腎上腺素能受體(ADRA1A)和α1D腎上腺素能受體(ADRA1D)、腎上腺素能受體基因(ADRA2A)。

圖2 丹參潛在治療靶點的PPI網(wǎng)絡

2.5GO富集分析結果 將藥物疾病共有靶點進行GO 的BP、MF、CC富集，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正P≤0.05的項目進行篩選，共富集到1 789條BP，113項分子功能相關，61項細胞組成相關。根據(jù)P值由小到大篩選排名前10的結果。富集得到的BP包括對氧水平的反應，肌肉細胞增殖與血管管徑調節(jié)等，見表3。富集共有靶點最多的MF為G蛋白偶聯(lián)胺受體活性，見表4。CC富集分析發(fā)現(xiàn)，靶蛋白主要分布在細胞膜和突觸等，其中以細胞膜膜筏、膜微結構域、膜區(qū)域上的靶蛋白數(shù)量最多，見表5。

表3 藥物疾病共有靶點的BP分析

2.6KEGG通路富集 將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，共富集到129條信號通路，根據(jù)P值由小到大篩選排名前20的通路繪制見表6。由表6可知，經(jīng)分析得到血管收縮、循環(huán)系統(tǒng)血管功能、血管大小調節(jié)、血管直徑調節(jié)和平滑肌細胞增殖這5條信號通路是血小板聚集作用機制的主要通路。

表6 藥物疾病共有靶點的生物信號通路

2.7分子對接分析 在分子對接中，配體與受體結合能的構象越穩(wěn)定能量越低，自發(fā)結合作用的可能性越大。對丹參抗血小板聚集的潛在藥效成分丹參酮ⅡA和關鍵作用靶點G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)進行分子對接分析。首先從Pubchem數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫獲取丹參酮ⅡA和丹參素的3D結構和GPCRs的晶體結構。GPCRs的晶體結構PDB號為2Y01，配體為Y01；PDB號為2Y03，配體為5fw。將潛在藥效成分丹參酮ⅡA和關鍵作用靶點GPCRs的3D結構加氫去水去配體，再由Autodock Vina 1.1.2軟件對其進行批量分子對接分析，分子對接結果顯示，丹參酮ⅡA和丹參素對GPCRs有較好的親和力，其中丹參素與GPCRs有較明顯的氫鍵作用，結果見圖3。

圖3 分子對接圖

3 討論

血小板聚集性增加是血栓性疾病的主要病理機制，因此抑制血小板激活、抗血小板聚集，在血栓性疾病的防治過程中具有重要意義[1，7-9]。近年來研究表明，丹參具有改善微循環(huán)、抗血小板聚集、抗凝血、抗血小板活性等藥理活性，現(xiàn)已從丹參中分離出100余種成分，主要包括脂溶性成分、水溶性成分和黃酮類成分，如丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、異隱丹參酮、丹酚酸、木犀草素等。本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法，先通過OB和DL篩選得到丹參活性成分；再通過活性成分靶點與血小板聚集關聯(lián)度預測丹參的血小板聚集作用機制的有效成分；最后分析有效成分與疾病的共有靶點所影響的BP和涉及的信號通路。從信號通路角度探討丹參的血小板聚集作用的可能機制。

通過PPI篩選發(fā)現(xiàn)STAT3、IL-6、EGFR、ESR1、VEGFA、FOS、CDKN1A、IL-4、NR3C1、CHRM2、EDNRA、IL-2、AR、CASP3、HTR2A、HTR2C、OPRD1、OPRM1、ADRA1A、ADRA1D和ADRA2A等是丹參血小板聚集作用的關鍵靶點。絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)[14]是一組能被不同的細胞刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。臨床上發(fā)現(xiàn)抑制MAPK14激活可緩解缺血性心衰急性損傷，具有保護心肌的作用，從而抑制血小板聚集，抑制血栓的形成。因此推測丹參通過調節(jié)受損心肌細胞生長周期的作用，調節(jié)心肌細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA、隱丹參酮等可直接作用于該靶點發(fā)揮抑制血小板聚集的作用。IL-6是一種由單核巨噬細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞和輔助型T細胞2(Th2)產生的多功能的炎癥細胞因子，目前認為其參與血小板聚集機制可能有3種[15]:(1)能夠激活血小板，增加其促凝活性促進血小板聚集:(2)能夠誘導肝臟產生急性反應蛋白，增加凝血因子的數(shù)量，最終在血小板聚集過程中起促進作用；(3)可促進細胞表達細胞間黏附分子1(ICAM-1)，增強嗜中性粒細胞的黏附作用，促進嗜中性粒細胞釋放氧自由基，加重細胞損傷。因此推測出，丹參通過阻斷IL-6受體，抑制IL-6活性影響血小板與膠原受體相互作用，從而抑制血小板聚集。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參中的木犀草素可直接作用于IL-6靶點，發(fā)揮抑制血小板聚集的作用。IL-6刺激后STAT3激活，STAT3靶點是細胞內一條極其重要的信號轉導途徑，它與血小板生成和聚集密切相關，其在血小板生成中不僅參與血小板的形成和成熟，也參與血小板的活化和聚集。因此抑制STAT3靶點活性有助于抑制血小板活化和聚集[12]。血管內皮生長因子A(VEGF-A)是人類中由VEGFA基因編碼的蛋白質，該基因是血小板衍生生長因子(PDGF)/血管內皮生長因子(VEGF)家族的成員，并且編碼通常作為二硫鍵連接的同型二聚體發(fā)現(xiàn)的蛋白質。該蛋白質是糖基化的有絲分裂原，其特異性地作用于內皮細胞并具有多種作用[14]，包括介導增加的血管通透性，誘導血管生成、血管發(fā)生和內皮細胞生長，促進細胞遷移和抑制細胞凋亡，VEGF-A顯示出與血管內皮細胞的顯著活性。在體外，VEGF-A已被證明可刺激內皮細胞有絲分裂和細胞遷移。VEGF-A也是血管擴張劑，增加微血管通透性，最初被稱為血管通透因子。丹參中的活性成分可直接作用于VEGFA靶點抑制其活性，從而抑制血小板活性和血小板聚集。

依據(jù)GO富集分析結果可知，丹參對血小板聚集作用機制BP主要涉及血管收縮、循環(huán)系統(tǒng)血管功能、血管大小調節(jié)、血管直徑調節(jié)、平滑肌細胞增殖等。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參中的丹參酮和丹參酚酸類成分可能主要通過保護血管內皮、調節(jié)血管大小和直徑等多靶點發(fā)揮對血小板聚集的作用，可調節(jié)血管張力、松弛血管平滑肌、舒張血管、改善血管痙攣、抑制血小板黏附聚集。丹參通過調節(jié)GPCRs的分子功能，在血栓形成過程中，GPCRs信號在血小板活化中起著重要作用。病理因素引起的血小板異?；罨ǔＥc血管疾病和血栓形成有關。血小板激活和聚集影響可溶性受體激動劑，刺激細胞內信號通過GPCRs，丹參通過在GPCRs信號通路中多靶點作用于抗血小板而顯著抑制激動劑誘導的血小板活化。丹參抑制二磷酸腺苷(ADP)與血小板表面G蛋白偶聯(lián)受體與血小板ADP受體亞基(P2Y1和P2Y12)的結合，抑制血小板的激活和ADP的釋放。P2Y12與G蛋白偶聯(lián)提高其他血小板激動劑的活化效率，本研究發(fā)現(xiàn)，丹參中的脂溶性成分如丹參酮ⅡA是G蛋白偶聯(lián)P2Y12拮抗劑，可抑制血小板聚集。

依據(jù)KEGG富集分析結果可知，在治療過程中相關度較高的通路有白細胞介素17(IL-17)信號通路、血清低氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路、T細胞受體信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、癌癥蛋白聚糖、P2Y12-Gi信號通路等。炎癥是血小板活化和聚集的關鍵觸發(fā)因子，可誘導內皮損傷，從而導致生理抗凝劑的缺失及血管舒張功能減弱；炎癥還可增加促凝因子的釋放，抑制溶解纖維蛋白的活性，從而促進血小板聚集，IL-17信號通路在急性和慢性炎癥反應中都起著至關重要的作用，已有研究表明，丹參通過IL-17信號通路抑制血栓中中性粒細胞的浸潤及NETs的形成，還可下調內皮細胞中p38的表達，抑制內皮細胞的活化[15]，從而發(fā)揮抑制血小板聚集的作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是血小板活化過程中細胞內信號的關鍵傳遞素。PI3K/Akt信號通路是目前發(fā)現(xiàn)的血小板活化主要通路，為生物體內重要的生存信號通路。丹參介導PI3K/Akt信號通路阻斷鈣離子通道，抑制血管平滑肌收縮偶聯(lián)，舒張血管，發(fā)揮抗血小板活化的功能[16]。丹酚酸A(SAA)和丹酚酸B (SAB)是丹參的水溶性成分，增加血小板cAMP通路，SAB增加cAMP通過調節(jié)磷酸二酯酶的活性水平(PDE)[17]。SAA抑制PI3K/Akt信號通路中PI3K下游磷酸化和抗血小板聚集。SAB是一種P2Y12受體拮抗劑，通過原子力顯微鏡(AFM)直接降低ADP和P2Y12受體之間的作用力，并通過與膠原受體相互作用抑制血小板黏附。HIF-1信號通路參與紅細胞和血管生成、糖和氨基酸代謝調節(jié)等基因調控而發(fā)揮作用，丹參介導HIF-1信號通路降低缺血、缺氧腦組織的細胞凋亡，降低腦組織的損傷，降低HIF-1α水平[18]，抑制血小板的聚集。丹參中的活性化合物通過干預ADP誘導的P2Y12-Gi信號通路相關的多個靶點，協(xié)同作用使血小板聚集。ADP可刺激血小板與P2Y12受體結合，激活P2Y12-Gi信號通路。ADP介導的P2Y12受體活化通過高濃度的環(huán)腺苷酸單磷酸(cAMP)和部分通過PI3K依賴性通路來減輕對其他激動劑的抑制作用，從而促進對其他激動劑的反應[19-20]。P2Y12偶聯(lián)的Gi與cAMP水平的抑制有關，這會導致GPⅡb/Ⅲa等整合素的暴露，這些整合素通過與纖維連接蛋白或纖維蛋白原等適配器分子結合促進血小板聚集。磷酸二酯酶(PDE)是cAMP的抑制劑，控制cAMP[21]的降解。P2Y12偶聯(lián)的Gi也與PI3K活性有關，PI3K通過催化調控蛋白激酶B(Akt)和Ras相關蛋白1b(Rap1b)的活性與GPⅡb/Ⅲa的激活有關。已有文獻報道Rap1b活化對GPⅡb/Ⅲa的持續(xù)活化具有重要意義[22-23]。丹參調控的信號通路見圖4。

圖4 丹參調節(jié)血小板聚集的P2Y12-Gi蛋白偶聯(lián)受體信號

綜上所述，丹參不同成分通過抑制STAT3、IL-6、EGFR、ESR1、VEGFA、FOS、CDKN1A、IL-4、NR3C1、CHRM2、EDNRA、IL-2、AR、CASP3、HTR2A、HTR2C、OPRD1、OPRM1、ADRA1A、ADRA1D、ADRA2A等關鍵蛋白介導血管收縮、循環(huán)系統(tǒng)血管功能、血管大小調節(jié)、血管直徑調節(jié)、平滑肌細胞增殖等來調控血小板聚集，影響血小板活化的不同信號通路，尤其是P2Y12-Gi受體通路。丹參的抗血小板活性可能取決于多化合物和多靶點的共同干預作用。本研究揭示了丹參調控血小板聚集是多成分、多靶點、多通路的BP，體現(xiàn)了中醫(yī)中藥治療疾病的整體觀念，為后期的臨床應用奠定了理論基礎。但網(wǎng)絡藥理學對靶點和通路的預測尚存在局限性，有待后期臨床實驗的進一步證實。