張 迪，鄧 甜，羅 震，朱安棣，楊 勃，鐘惠蘭，李少萍，楊曉喻

1南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院種植科，廣東 廣州 510280；2中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院口腔科，廣東 深圳518107

鈦（Ti）及其合金被廣泛用作牙科和矯形領(lǐng)域的植入物，其成功植入取決于它們?cè)诠δ苌系某跏脊钦虾烷L(zhǎng)期持久性，目前各種表面修飾，如激光照射，酸蝕刻等均是為了實(shí)現(xiàn)該目的［1-3］。近十年來(lái)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）家族的生長(zhǎng)因子的被用于表面修飾，而且取得了較為良好的效果［4,5］。在這些BMP家族中，BMP-2因顯著增強(qiáng)骨整合和骨形成受到了研究者的重點(diǎn)關(guān)注［6］。與BMP-2相比，人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）較少被認(rèn)為是增強(qiáng)骨形成的生長(zhǎng)因子［7］。然而，有研究表明，IGF-1能通過(guò)促進(jìn)骨祖細(xì)胞的增殖和分化，刺激骨基質(zhì)形成和成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)新生小鼠顱骨的RNA和膠原合成［8］。hBMP-2與hIGF-1兩者都具有間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力，都可以促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖和骨細(xì)胞的形成［9］。單獨(dú)將hIGF-1或hBMP-2作為種植體的表面修飾物，均能有效提高種植體植入受體后的成骨作用［10,11］。不管是BMP-2還是IGF-1，當(dāng)這些生物分子單獨(dú)存在于生物體內(nèi)時(shí)，由于生物體內(nèi)的酶降解作用，半衰期均較短，而導(dǎo)致骨形成不足［12］。此外，這些生物分子的局部過(guò)量表達(dá)，往往還可能誘導(dǎo)惡性腫瘤。為了克服這些缺點(diǎn)，研究者必須對(duì)這些生物分子進(jìn)行表面修飾，例如殼聚糖、透明質(zhì)酸、肝素等［13,14］。

肝素是高度硫酸化的糖胺聚糖和線性天然多糖，它與各種生長(zhǎng)因子（包括BMP-2和IGF-1）具有結(jié)合親和力［15,16］。肝素的Ti表面改性，能夠增加這些生長(zhǎng)因子的半衰期［17］。已有部分文獻(xiàn)通過(guò)在Ti表面涂覆IGF-1、BMP-2來(lái)增強(qiáng)骨形成和骨整合的研究［18-20］，但關(guān)于IGF-1，BMP-2二者聯(lián)用對(duì)增強(qiáng)骨形成和骨整合的組合效應(yīng)研究目前國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道。因此，本研究設(shè)計(jì)并制備了一種雙層hBMP-2/hIGF-1涂層，檢測(cè)其對(duì)增強(qiáng)骨形成和骨整合的功效，通過(guò)體外檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）活性、鈣沉積以及骨鈣素與骨調(diào)素的表達(dá)，驗(yàn)證本研究設(shè)計(jì)的Ti表面修飾方法在臨床應(yīng)用中的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品

醋酸地塞米松（DEX），β-甘油磷酸二鈉鹽水合物，抗壞血酸（Sigma）；肝素12 000～15 000 g/mol（Thermo Fisher）；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）、青霉素-鏈霉素（PS）溶液（Sigma）；4-（4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉氯化物（DMT-MM）（Sigma）；人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（hBMP-2）、人類生長(zhǎng)和分化因子-2（hIGF-1）及其ELISA試劑盒（廣州賽業(yè)生物）。

1.2 制備hBMP-2/hIGF-1涂層的Ti表面

制備hBMP-2/Ti、hIGF-1/Ti和hBMP-2/hIGF-1/Ti（圖1）。將原始Ti 片加入到2.5 mol/L NaOH 水溶液（500 mL）中，在80 ℃下連續(xù)攪拌48 h。在蒸餾水中超聲處理5 min后，將Ti片用蒸餾水洗滌3次，并用氮?dú)飧稍?，得到Ti-COOH。Ti-COOH在室溫下用DMT-MM（1 mmol，27 mg）活化1 h。將肝素（1 mmol，10 mg）加入蒸餾水中與活化的Ti-COOH的混合后，在室溫下反應(yīng)3 d。用蒸餾水洗滌3次后，用氮?dú)飧稍颰i片，儲(chǔ)存在充滿氮?dú)獾母稍锲髦?。將hBMP-2（50 ng），肝素（10 mg）和hIGF-1（50 ng）按順序包被在PBS（40 mL，pH7.4）中的Ti片上，在4 ℃下反應(yīng)24 h。用蒸餾水清洗Ti片3次后，用氮?dú)鈱⑺肨i片干燥，并儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中待用。

圖1 hBMP-2/Ti，hIGF-1/Ti和hBMP-2/hIGF-1/Ti的制備技術(shù)路線Fig.1 Roadmap for preparing hBMP-2/Ti,hIGF-1/Ti and hBMP-2/hIGF-1/Ti materials.

1.3 掃描電鏡觀察Ti片表面形態(tài)

使用離子濺射涂布機(jī)（Eiko IB-3，Eiko Engineering Co.，Ltd，日本）對(duì)Ti 片包被金粉，通過(guò)SEM（S-2300，Hitachi，Japan）在15 kV下檢查表面形態(tài)。

1.4 接觸角測(cè)量

將水滴滴在樣品膜上60 s后照相，通過(guò)軟件測(cè)定照片中水滴的高度和水滴與膜接觸面的直徑，得到靜態(tài)接觸角，即膜的親水性。每個(gè)樣本重復(fù)檢查3次，結(jié)果取均值。

1.5 MG63細(xì)胞系培養(yǎng)

將MG63細(xì)胞（國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)）在含有10%FBS和1%PS的200 μLDMEM的48孔板中在保持在37 ℃的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并補(bǔ)充5%CO2。每3 d更換培養(yǎng)基。

1.6 體外細(xì)胞增殖率

將MG63細(xì)胞接種在Ti片上（5×103/孔），放置在培養(yǎng)板中，加入含有10% FBS 和1% PS 的DMEM，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，之后加入10 μL/孔CCK8（碧云天），培養(yǎng)細(xì)胞4 h，充分顯色后，收集樣品，并根據(jù)制造商提供的試劑使用說(shuō)明，在450 nm分光光度計(jì)下測(cè)定吸光度A450nm。每個(gè)樣本重復(fù)檢查3次，結(jié)果取均值。

1.7 ALP活性測(cè)定

將MG63細(xì)胞（1×105/孔）在具有成骨培養(yǎng)基（含有10%FBS，1%PS，10 mmol/Lβ-磷酸甘油磷酸二鈉鹽水合物，300 μmol/L抗壞血酸和0.1 μmol/L地塞米松）的培養(yǎng)板中接種在Ti片上，孵育3周后，用PBS（pH7.4）和放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)緩沖液（RIPA緩沖液，50 mmol/L三氯化氫pH7.4,150 mmol/L NaCl，0.25%脫氧膽酸，1%Nonidet P-40 清洗Ti片，并加入含有蛋白酶抑制劑混合物（Roche）的1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），將細(xì)胞在冰浴RIPA緩沖液中裂解20 min，將裂解物在4 ℃離心10 min去除細(xì)胞碎片。將上清液與對(duì)硝基苯基磷酸鹽（PNPP）溫育，通過(guò)加入50 μL的1 mol/L NaOH終止與PNPP的反應(yīng)。采用酶標(biāo)儀，通過(guò)在410 nm處測(cè)量PNPP向?qū)ο趸椒拥霓D(zhuǎn)化率來(lái)確定ALP活性。每個(gè)樣本重復(fù)檢查3次，結(jié)果取均值。

1.8 茜素紅S染色

將MG63細(xì)胞接種于Ti片上（1×105/孔），培養(yǎng)3周。用蒸餾水沖洗Ti片，將沖洗后的Ti片用3.7%甲醛固定20 min，再次沖洗。對(duì)于茜素S染色，根據(jù)試劑使用說(shuō)明書，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，之后，置于顯微鏡下觀察并進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本重復(fù)檢查3次，結(jié)果取均值。

1.9 Western blot 檢測(cè)Ti片表面MG63細(xì)胞蛋白表達(dá)

采用膠原酶消化Ti片表面MG63細(xì)胞，將消化收集到的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 液，沖洗沉淀2 次。加入20 μL RIPA裂解液到EP管中（含有0.2 μL PMSF），冰上裂解30 min，細(xì)胞裂解充分后離心取上清并按照說(shuō)明書操作進(jìn)行總蛋白定量。SDS-PAGE電泳后PVDF膜轉(zhuǎn)膜和孵育抗體，5%脫脂奶粉-TBS封閉，一抗1∶1500，室溫，反應(yīng)2 h。TBS洗滌PVDF膜5 min×5次，二抗1∶5000，室溫，反應(yīng)1 hTBS洗PVDF膜5 min×5次，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。每個(gè)樣本重復(fù)檢查3次，結(jié)果取均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ti片表面形態(tài)

制備經(jīng)修飾后的Ti片后，采用掃描電鏡觀察Ti片表面形態(tài)顯示，與hBMP-2/Ti、hIGF-1/Ti 和hBMP-2/hIGF-1/Ti 相比，在原始Ti 上觀察到光滑的表面形態(tài)（圖2）。而Ti片表面無(wú)論是經(jīng)過(guò)hBMP-2、hIGF-1、或hBMP-2與hIGF-1組合處理，均能導(dǎo)致形成粗糙的Ti表面。然而三者之間表面形態(tài)并無(wú)明顯區(qū)別。

圖2 hBMP-2/Ti、hIGF-1/Ti和hBMP-2/HIGF-1/Ti形態(tài)Fig.2 Surface morphology of hBMP-2/Ti,hIGF-1/Ti and hBMP-2/hIGF-1/Ti samples under scanning electron microscope(Original magnification:×2000).A:Non-coated Ti sample.B:hBMP-2/Ti sample.C:hIGF-1/Ti sample.D:hBMP-2/hIGF-1/Ti sample.

2.3 水接觸角

Ti樣品的親水性檢測(cè)結(jié)果顯示，與原始Ti相比，表面改性Ti 樣品顯示出較低的接觸角，即用hBMP-2、hIGF-1和hBMP-2/hIGF-1實(shí)現(xiàn)了表面改性。原始Ti與hBMP-2/Ti（P=0.032）、hIGF-1/Ti（P=0.029）和hBMP-2/hIGF-1/Ti（P=0.028）的接觸角差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖3 原始Ti、hBMP-2/Ti、hIGF-1/Ti和hBMP-2/hIGF-1/Ti樣品上的水接觸角Fig.3 Contact angle of hBMP-2/Ti,hIGF-1/Ti and hBMP-2/hIGF-1/Ti samples.*P＜0.05 vs original Ti.

2.4 修飾物對(duì)MG63細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)hBMP-2/Ti、hIGF-1/Ti的MG63細(xì)胞，其增殖率相對(duì)于原始Ti沒(méi)有顯著差別（圖4A），培養(yǎng)在hBMP-2/hIGF-1/Ti上的MG63細(xì)胞的細(xì)胞增殖率高于原始Ti。細(xì)胞ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)在hIGF-1/Ti 和hBMP-2/hIGF-1/Ti 表面的細(xì)胞，相對(duì)于培養(yǎng)在原始Ti上的細(xì)胞，能分泌更多的ALP（P=0.021，P=0.014，圖4B）。

圖4 修飾物對(duì)MG63細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of hBMP-2/Ti,hIGF-1/Ti and hBMP-2/hIGF-1/Ti on proliferation of MG63 cells.A:Growth curve;B:ALP activity.*P＜0.05 vs original Ti.

2.5 修飾物對(duì)MG63細(xì)胞鈣沉積的影響

與原始Ti 相比，培養(yǎng)在hBMP-2/Ti 和hBMP-2/hIGF-1/Ti 上的MG63 細(xì)胞產(chǎn)生了大量的鈣沉積（P=0.006，P=0.002，圖5A，B）。

圖5 hBMP-2/Ti,hIGF-1/Ti 和hBMP-2/hIGF-1/Ti對(duì)MG63細(xì)胞鈣沉積的影響Fig.5 Effects of hBMP-2/Ti,hIGF-1/Ti and hBMP-2/hIGF-1/Ti on calcium deposition of MG63 cells.A:Original Ti.B:hBMP-2/Ti.C:hIGF-1/Ti.D:hBMP-2/hIGF-1/Ti (Alizarin Red S staining,×100);the red substance was calcified sediment.E:Calcified nodule count.*P＜0.05 vs original Ti.

2.6 hBMP-2與hIGF-1能誘導(dǎo)MG63細(xì)胞骨鈣素與骨調(diào)素的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與培養(yǎng)在原始Ti上的細(xì)胞相比，培養(yǎng)在hBMP-2/Ti 和hBMP-2/hIGF-1/Ti 上的MG63 細(xì)胞骨鈣素（hBMP-2/Ti：P=0.021；hBMP-2/hIGF-1/Ti：P=0.013）與骨調(diào)素（hBMP-2/Ti：P=0.017；hBMP-2/hIGF-1/Ti：P=0.008）的表達(dá)顯著上調(diào)（圖6）。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)鈦種植表面修飾的研究，主要集中在種植體表面的物理或化學(xué)修飾，即通過(guò)噴砂或者酸蝕等理化作用，改變種植體表面宏觀與微觀形態(tài)［21-23］。這些理化修飾手段只能增加種植體的表面積，而無(wú)法解決鈦種植體表面骨整合效率較低的問(wèn)題。本研究在理化修飾的基礎(chǔ)上，引入hIGF-1與hBMP-2基因修飾載體，能有效提高種植體表面的骨整合效率。在以往的報(bào)道中，有研究者在種植體表面通過(guò)靜電吸附等方式在種植體表面固定基因載體［24］，雖然在短期內(nèi)也能誘導(dǎo)種植體表面骨形成，但仍然面臨成本較高且半衰期短的問(wèn)題。在本研究中，通過(guò)體外基因克隆技術(shù)獲得了足量hIGF-1與hBMP-2基因修飾載體。研究表明，使用肝素可以降低BMP-2與其接頭蛋白的結(jié)合，有效抑制其降解［25］。利用BMP-2的肝素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合BMP-2，并且肝素競(jìng)爭(zhēng)性地抑制接頭蛋白與成骨細(xì)胞的結(jié)合，能延長(zhǎng)BMP-2的半衰期［26］。為了解決其半衰期短的問(wèn)題，本研究對(duì)種植體表面進(jìn)行肝素修飾，有效隔離了DNA降解酶的作用，從而提高了基因載體的表達(dá)效率。

鈦種植體表面親水性不高，不利于細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)。在本研究中，經(jīng)過(guò)對(duì)鈦種植體表面進(jìn)行肝素改性后，顯著降低了其表面的水接觸角，從而提高了材料的親水性。在以往的研究中，通常采用靜電吸附將基因載體固定在殼聚糖表面，或者直接通過(guò)層層自組裝吸附在種植體上，結(jié)合力都不夠穩(wěn)固。在種植體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)榕ちψ饔?，容易使種植體表面的修飾物脫落［27,28］。而本研究利用肝素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合hIGF-1與hBMP-2分子，解決了基因載體結(jié)合不牢固的問(wèn)題。以往的研究大多采用單一基因載體修飾種植體表面，因而骨整合效率并不高，而率先將hBMP-2/hIGF-1二者固定在種植體表面，結(jié)果表明，相對(duì)于不做任何處理的Ti片或加載hBMP-2或hIGF-1單一涂層的Ti片，在Ti片加載hBMP-2/hIGF-1涂層后能顯著提高種植體表面MG63細(xì)胞的成骨效率。這一結(jié)果，不僅體現(xiàn)在茜素紅S實(shí)驗(yàn)中的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量上，在檢測(cè)鈣化相關(guān)的兩個(gè)重要指標(biāo)骨鈣素與骨調(diào)素的表達(dá)水平上，也同樣有這樣的趨勢(shì)。細(xì)胞是否成骨，在以往的口腔材料學(xué)研究中，一般是檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，而本研究通過(guò)茜素紅S實(shí)驗(yàn)很直觀的檢測(cè)了MG63細(xì)胞的成骨作用［29］。通過(guò)成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)以及茜素紅S 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hIGF-1與hBMP-2的協(xié)同能顯著誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖、成熟與鈣化，而肝素的使用，又起到了緩釋的作用。

因此，本研究設(shè)計(jì)的種植體材料，在控制成本的同時(shí)能有效地提高表面成骨效率，對(duì)今后的臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。但本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有將材料應(yīng)用于動(dòng)物模型，因而具有一定的應(yīng)用局限性，在將來(lái)的研究中，本課題組將進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，將材料應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，提高這一材料的應(yīng)用價(jià)值。