楊 群，周春香，韓 宸，張 穎，蔣玉娜，李鎮(zhèn)江，馬進(jìn)安

中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院1臨床護(hù)理學(xué)教研室，2腫瘤科，3胃腸外科，湖南 長(zhǎng)沙410011

我國(guó)2018 年癌癥報(bào)告顯示，結(jié)直腸癌發(fā)病率居第3位，死亡率居第5位，且直腸癌發(fā)病率略高于結(jié)腸癌。直腸癌由于其特殊的解剖結(jié)構(gòu)和位置，手術(shù)切除時(shí)技術(shù)難度大于結(jié)腸癌，其復(fù)發(fā)率也明顯高于結(jié)腸癌，術(shù)后5年生存率為50%左右［1］。術(shù)前新輔助同步放化療（CRT）是局部晚期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療策略，20%～30%患者達(dá)到臨床完全緩解［2］，有5%～44%患者可達(dá)到病理完全緩解［3-5］。研究表明新輔助CRT后達(dá)到臨床完全緩解的患者，觀察-等待策略的生存數(shù)據(jù)不劣于根治性手術(shù)方案，觀察等待組和手術(shù)組的3 年無(wú)復(fù)發(fā)生存率（88%vs78%）和總生存率（96%vs87%）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［6］。直腸癌“新輔助CRT－觀察－等待”的保肛策略越來(lái)越受到患者和醫(yī)生的重視，但目前新輔助CRT的臨床完全緩解率僅30%左右，限制了絕大部分直腸癌患者的這種臨床選擇。如何提高直腸癌新輔助CRT的完全緩解率是臨床實(shí)施保肛策略急需解決的難題，免疫治療聯(lián)合新輔助CRT也許是一個(gè)很好的策略。

腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的數(shù)量和表型可在一定水平上預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1單抗免疫治療的療效，富集免疫細(xì)胞的“熱腫瘤”對(duì)免疫治療更為有效［7,8］。放療可以誘發(fā)腫瘤遠(yuǎn)隔效應(yīng)說(shuō)明其具有一定的免疫激活作用［7］，但放療對(duì)腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的影響一直存在爭(zhēng)議。有觀點(diǎn)認(rèn)為放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，還可以抑制淋巴細(xì)胞，削弱抗腫瘤免疫［9,10］。也有研究表明放療可以增加腫瘤局部浸潤(rùn)免疫細(xì)胞從而調(diào)節(jié)免疫，腫瘤局部預(yù)先存在浸潤(rùn)免疫細(xì)胞也是免疫檢控點(diǎn)抑制劑起效的前提［11］。大部分實(shí)體瘤內(nèi)缺乏浸潤(rùn)免疫細(xì)胞，微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)，對(duì)PD-1/PD-L1單抗反應(yīng)性欠佳，放療可能是一個(gè)潛在的激發(fā)啟動(dòng)策略［7,8］?；熞部烧T導(dǎo)腫瘤局部CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)，下調(diào)Treg細(xì)胞等抑制性免疫細(xì)胞［12,13］。理論上同步放化療腫瘤殺滅能力增強(qiáng)，但新輔助CRT前后直腸癌微環(huán)境中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的數(shù)量和表型如何變化目前尚不明確。本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)直腸癌新輔助CRT前后活檢與手術(shù)標(biāo)本組織中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞（CD3、CD4、CD8、CD56、Foxp3）的數(shù)量和表型變化，前后自身對(duì)照比較分析新輔助CRT 對(duì)直腸癌免疫微環(huán)境的影響，以期為臨床聯(lián)合免疫治療增效直腸癌新輔助CRT提供理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本研究共納入2016年1月～2018年12月于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院確診，新輔助CRT后接受直腸癌根治術(shù)的臨床Ⅱ～Ⅲ期直腸癌患者20例。所有患者的術(shù)前活檢與術(shù)后石蠟包埋組織標(biāo)本均在病理科存檔，排除術(shù)后病理完全緩解患者，均有完善的臨床病理資料及隨訪資料，隨訪截止至2019年12月，詳細(xì)臨床資料見(jiàn)表1。其中男性15例，女性5例；年齡39～68歲，平均年齡52.9±8.5歲，中位年齡51歲；病理診斷均為直腸腺癌；病理組織學(xué)分級(jí)：高分化（G1）7 例（35%），中分化（G2）3 例（15%），低分化（G3）10例（50%）；臨床TMN分期：Ⅲ期17例（85%），Ⅱ期3例（15%）；放療模式：總劑量50 Gy/2.0 Gy/25F，所有患者均使用卡培他濱片（825 mg/m2，口服，2 次/d）同步化療；16 例（80%）患者在新輔助CRT 前接受至少1 周期XELOX 方案化療（奧沙利鉑130 mg/m2，靜脈滴注，d1+卡培他濱片1000 mg/m2，口服，2次/d，d1-d14，21 d重復(fù)）；完成新輔助CRT與手術(shù)的間隔時(shí)間為43.5±17.6 d，中位數(shù)為38.5 d；新輔助CRT后腫瘤縮退分級(jí)（TRG）0級(jí)患者0例，TRG 1級(jí)患者4例（20%），TRG 2級(jí)患者6例（30%），TRG 3級(jí)患者10例（50%）；其中17例患者為微衛(wèi)星穩(wěn)定型，3例患者為高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定型；隨訪截止時(shí)有6例患者（30%）出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期為14～44月，理論中位無(wú)復(fù)發(fā)生存期為26.5月。

1.2 試劑

兔單克隆抗體CD3、CD4、CD8、CD56及鼠單克隆抗體FoxP3均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；ElivisionTM Plus二抗試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

所有直腸癌組織標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定、石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)石蠟常規(guī)切片脫蠟水化，抗原修復(fù)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活，行免疫組織化學(xué)染色，具體操作步驟均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。同時(shí)采用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，采用PBS液替代相應(yīng)一抗為空白對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

CD3、CD4、CD8、CD56主要以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性，F(xiàn)oxP3陽(yáng)性則主要為細(xì)胞漿著色。先于低倍鏡下觀察著色細(xì)胞的均勻性，然后隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×200），計(jì)算標(biāo)本的染色強(qiáng)度，未見(jiàn)染色記0分、淡黃色記1分、黃色記2分、棕褐色記3分。利用Image J軟件分別計(jì)算出每個(gè)視野中可見(jiàn)的所有細(xì)胞面積和免疫組化染色呈陽(yáng)性細(xì)胞的面積，以染色陽(yáng)性細(xì)胞面積/視野中所有細(xì)胞面積=陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，取5個(gè)視野的平均值為免疫組化染色的平均陽(yáng)性率［14］，0%～5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～75%為2分，＞75%為3分，染色強(qiáng)度、平均陽(yáng)性率二者得分相乘得出總分，0～3分為低表達(dá)，4～9分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，服從正態(tài)分布的配對(duì)樣本均數(shù)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布的配對(duì)樣本均數(shù)的比較采用Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)。變量之間的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析以及Spearman 相關(guān)性分析，多因素分析采用COX回歸模型。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新輔助CRT前后CD3的表達(dá)情況

直腸癌新輔助CRT后CD3的平均陽(yáng)性率較前顯著增高[（21.8%±10.5%）vs（48.8%±16.3%）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1）。15例（75%）患者新輔助CRT后CD3陽(yáng)性率較前升高。

圖1 新輔助CRT前后CD3表達(dá)的變化Fig.1 Changes of CD3 expression before and after neoadjuvant CRT(P＜0.001).

2.2 新輔助CRT前后CD4的表達(dá)情況

直腸癌新輔助CRT后CD4平均陽(yáng)性率較前顯著增高[（16.5±8.7）%vs（42.2±12.6）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖2）。18例（90%）患者CD4陽(yáng)性率較前升高。

圖2 新輔助CRT前后CD4表達(dá)的變化Fig.2 Changes of CD4 expression before and after neoadjuvant CRT(P＜0.001).

2.3 新輔助CRT前后CD8的表達(dá)情況

直腸癌新輔助CRT后CD8平均陽(yáng)性率較前顯著升高[（8.3±6.8）%vs（33.4±20.7）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3）。15 例（75%）患者新輔助CRT 后CD8陽(yáng)性率較前升高。CD4/CD8平均比值在新輔助CRT 后較前升高[（2.7±2.3）%vs（5.1±12.8）%]，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.075）。

圖3 新輔助CRT前后CD8表達(dá)的變化Fig.3 Changes of CD8 expression before and after neoadjuvant CRT(P＜0.001).

2.4 新輔助CRT前后CD56的表達(dá)情況

直腸癌新輔助CRT 后腫瘤組織中CD56 的平均陽(yáng)性率較前明顯升高[0vs（7.6±12.1）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012，圖4）。所有患者新輔助CRT前CD56陽(yáng)性率為0，6例（30%）患者新輔助CRT后CD56陽(yáng)性率升高。

圖4 新輔助CRT前后CD56表達(dá)的變化Fig.4 Changes of CD56 expression before and after neoadjuvant CRT(P=0.012).

2.5 新輔助CRT前后Foxp3的表達(dá)情況

直腸癌新輔助CRT后腫瘤組織中Foxp3平均陽(yáng)性率較前顯著下降[（26.0±21.5）vs（15.3±21.8）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005，圖5）。13例（65%）患者新輔助CRT后Foxp3陽(yáng)性率下降。

圖5 新輔助CRT前后Foxp3表達(dá)的變化Fig.5 Changes of Foxp3 expression before and after neoadjuvant CRT(P=0.005).

2.6 新輔助CRT前后免疫標(biāo)記物的變化與患者臨床病理因素的相關(guān)性

新輔助CRT前后CD3和CD8表達(dá)升高的患者有著更長(zhǎng)的無(wú)復(fù)發(fā)生存期，但CD4、CD56、Foxp3的表達(dá)變化與患者臨床病理因素?zé)o顯著相關(guān)性（表2、圖6）。

圖6 CD3、CD8的變化與DFS的相關(guān)性Fig.6 Correlation of changes of CD3-(P=0.028) and CD8-positive cells (P=0.001) with disease-free survival of the patients,

表2 新輔助CRT前后免疫標(biāo)記物的變化與DFS的多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of the changes of immune markers and disease-free survival before and after neoadjuvant CRT

3 討論

腫瘤組織中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞不僅作用于腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而且可以對(duì)腫瘤的治療反應(yīng)和預(yù)后產(chǎn)生影響。通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)直腸癌患者和健康人大腸組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中浸潤(rùn)的T細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量少于健康人，而腫瘤組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量則大于健康人［15］。CD3主要表達(dá)在成熟T細(xì)胞表面，某種程度上反應(yīng)T細(xì)胞的整體水平。CD4主要表達(dá)在輔助T細(xì)胞表面，CD4+T細(xì)胞主要在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起免疫監(jiān)視作用，可通過(guò)釋放溶細(xì)胞酶直接殺傷腫瘤細(xì)胞，也能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境、增強(qiáng)B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活性間接殺傷腫瘤細(xì)胞［16,17］。CD8主要表達(dá)在細(xì)胞毒性T細(xì)胞表面，在腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中起主要?dú)饔?。在炎癥因子的趨化下，CD8+T細(xì)胞向腫瘤局部聚集，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和殺傷。

本研究發(fā)現(xiàn)新輔助CRT可以對(duì)直腸癌微環(huán)境浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的數(shù)量和表型產(chǎn)生明顯影響，增加術(shù)后直腸癌組織中CD3+T、CD4+T和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。盡管本研究的樣本量偏少，但采用直腸癌新輔助CRT前后的活檢標(biāo)本、術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行自身對(duì)照，所以得到的CRT對(duì)直腸癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞影響的結(jié)果比較直接可靠，有一定臨床意義。Ogura等18］研究了新輔助CRT前后直腸癌腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的變化，發(fā)現(xiàn)新輔助CRT后CD8+T細(xì)胞較治療前明顯升高。新輔助CRT通過(guò)殺滅腫瘤細(xì)胞，可增加腫瘤新抗原的表達(dá)與釋放，從而促進(jìn)炎癥趨化因子募集免疫細(xì)胞來(lái)激活直腸癌局部的免疫效應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)CD3+T、CD8+T細(xì)胞的增加與患者預(yù)后呈正相關(guān)，說(shuō)明CD3+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量的變化可以作為評(píng)估直腸癌患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。薈萃分析證實(shí)頭頸部鱗癌中CD3+T細(xì)胞的浸潤(rùn)預(yù)示良好的預(yù)后［19］。腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞的數(shù)量被認(rèn)為可以預(yù)測(cè)直腸癌［20］、肛門(mén)癌［21］的預(yù)后。但CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)密度對(duì)腫瘤預(yù)后的影響與癌種相關(guān)，CD4+T 細(xì)胞在肺癌［22］、乳腺癌［23］中與預(yù)后不良相關(guān)，而在大腸癌患者中卻是預(yù)后良好的因素［24］，造成這種差異的原因可能是CD4+T細(xì)胞在不同腫瘤類(lèi)型的免疫微環(huán)境中有著不同的功能。

NKT細(xì)胞兼具T細(xì)胞和NK細(xì)胞的特性，可以通過(guò)分泌溶細(xì)胞酶和細(xì)胞毒性因子并且以非MHC限制的方式殺傷腫瘤細(xì)胞［25］。胃癌、肺癌中高密度的NKT細(xì)胞浸潤(rùn)已被證實(shí)與患者的生存改善有關(guān)［26,27］。本研究新輔助CRT前腫瘤組織中CD56的表達(dá)均為陰性，提示NKT細(xì)胞在直腸癌組織中低表達(dá)。既往大樣本結(jié)直腸癌腫瘤組織中，僅9%的患者發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性NKT細(xì)胞［28］，說(shuō)明NKT細(xì)胞在結(jié)直腸癌組織中的浸潤(rùn)存在障礙。我們的研究發(fā)現(xiàn)新輔助CRT后，直腸癌組織中CD56的表達(dá)顯著升高，表明CRT可以導(dǎo)致NKT細(xì)胞的瘤內(nèi)浸潤(rùn)增加。

Foxp3作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子參與Treg細(xì)胞的分化與功能行使。Foxp3+Treg細(xì)胞被認(rèn)為能抑制抗腫瘤免疫，腫瘤組織中Foxp3+Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)往往提示預(yù)后不良［29-31］。本研究發(fā)現(xiàn)新輔助CRT能夠顯著降低直腸癌組織中Foxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量，說(shuō)明CRT可以通過(guò)抑制Treg細(xì)胞表達(dá)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的抑制狀態(tài)。

具有放療史的非小細(xì)胞肺癌患者接受PD-1單抗治療，其療效是無(wú)放療史人群的2倍［32］，化療聯(lián)合PD-1單抗也能大幅提高其有效率［33］，證實(shí)肺癌中放療、化療對(duì)PD-1單抗免疫治療具有增效作用。本研究結(jié)果顯示同步放化療可以誘導(dǎo)直腸癌局部微環(huán)境中免疫細(xì)胞的募集，增加腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞水平，可以讓直腸癌轉(zhuǎn)化成“熱腫瘤”。因此，PD-1/PD-L1 單抗免疫治療在理論上支持增效直腸癌新輔助CRT，值得臨床進(jìn)一步探索。